Metabolismo in vitro e in vivo dell'estratto di Cistanche tubulosa in ratti depressivi indotti da stress normali e cronici imprevedibili

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

ASTRATTO

Cistanche tubulosa, una specie di Cistanche Herba, è stata recentemente confermata per avere un'efficacia antidepressiva nei ratti da stress imprevedibile incronico (CUS) ripristinando l'omeostasi del microbiota intestinale. In questo articolo, ci proponiamo di esplorare il profilo metabolico di C. tubulosa in ratti modello depressivi normali e indotti da CUS in vitro e in vivo. Utilizzando UPLC-Q-TOF-MS, il metabolismo gastrointestinale in vitro diEstratto di Cistanche tubulosa(CTE) è stato valutato sia in ratti normali che CUS. Allo stesso tempo, il metabolismo in vivo della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei ratti normali e depressi è stato anche studiato l'urina e le feci di ratto. Un totale di 20 e 26 metaboliti sono stati caratterizzati dal metabolismo in vitro e in vivo rispettivamente nei ratti normali e CUS. CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato metabolizzato in agliconi e prodotti di degradazione dei glicosidi feniletanoidi (PhG) e glicosidi iridoidi sia dal microbiota intestinale di ratto normale che depresso in vitro. I metaboliti di fase II degli agliconi ei prodotti di degradazione dei PhG e dei glicosidi iridoidi erano i principali metaboliti nelle urine e nelle feci di ratto. Inoltre, la capacità metabolica di generare glicosidi e agliconi secondari nel microbiota intestinale di ratto depressivo era molto più debole di quella del normale microbiota intestinale di ratto, che è stata attribuita alle idrolasi di glicosidi disordinate prodotte dal microbiota intestinale nei ratti depressi CUS. I risultati di questo studio hanno gettato le basi per la comprensione del processo metabolico e del meccanismo terapeutico delle proprietà antidepressive del CTE.

Parole chiave: Cistanche tubulose, DepressioneMetabolismo, In vitro, In vivo, Microbiota intestinale

1. Introduzione

Cistanches Herba è ufficialmente registrato come i gambi succulenti essiccati di Cistanche deserticola (YC Ma) e C. tubulosa (Schrenk), che è usato per trattare la deficienza renale, l'impotenza, l'infertilità femminile, la morbosa leucorrea, la metrorragia profusa e la stitichezza senile [1]. Moderni studi farmacologici hanno dimostrato che Cistanches Herba possiede varie attività biologiche come antineurodegenerazione, immunoregolazione e antinfiammatoria [2,3]. Le nostre precedenti indagini lo hanno verificatoEstratto di Cistanche tubulosa(CTE), che sono costituiti da 48,6% di glicosidi feniletanoidi (PhGs), 6,9% di glicosidi iridoidi e 20,0% di saccaridi totali, potrebbero alleviare notevolmente i sintomi depressivi di ratti depressivi indotti da stress cronico imprevedibile (CUS) di ripristinare l'omeostasi del microbiota intestinale [4]. Studi recenti indicano che i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale erano associati allo sviluppo e alla progressione della depressione [5,6]. La relativa abbondanza dei generi microbici è stata notevolmente disturbata nei ratti modello depressivi CUS rispetto ai controlli normali [7]. Nei pazienti depressi, anche la diversità e la ricchezza del microbiota intestinale erano significativamente alterate [8]. Inoltre, vari composti, inclusi glicosidi feniletanoidi (PhGs) e glicosidi iridoidi, sono stati considerati i principali costituenti di Cistanches Herba [2,3], che sono stati facilmente metabolizzati nei loro glicosidi e agliconi secondari tra cui l'idrossitirosolo (HT), 3,4-diidrossifenetile glicoside, acido geniposidico deglicosilato, ecc. dal microbiota intestinale umano. Questi metaboliti sono più facilmente assorbiti attraverso l'intestino ed esercitano un'attività biologica coerente con il componente prototipo[9–11]. Pertanto, riteniamo che durante l'insorgenza e lo sviluppo della depressione, il disturbo della struttura della microflora intestinale influenzerà inevitabilmente il metabolismo delle medicine tradizionali cinesi orali (MTC) nel tratto gastrointestinale, oltre a influenzare lo stato fisiologico dell'ospite. La maggior parte dei dati metabolici esistenti di Cistanches Herba provengono da studi metabolici su animali sani[12–15]. Pertanto, sarebbe di maggiore importanza clinica studiare il profilo metabolico della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nello stato patologico nel chiarire i suoi componenti bioattivi e comprendere il meccanismo d'azione per la sua efficacia antidepressiva.

Nel presente studio, miriamo a caratterizzare i profili metabolici di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in ratti modello depressivi sia sani che indotti da CUS mediante spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare con cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC-Q-TOF-MS). Il succo gastrico, il liquido intestinale e il microbiota di ratti patologici normali e depressivi sono stati utilizzati per simulare il processo metabolico della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nel tratto gastrointestinale in vitro, in modo indipendente e sequenziale. I metaboliti in vivo sono anche chiariti dopo somministrazione orale di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei ratti normali e CUS. Questo studio fornisce nuove informazioni sul metabolismo e sui metaboliti attivi del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)per la depressione.

2. Materiale e metodi

2.1. Materiale

I gambi secchi di C. tubulosa sono stati raccolti dalla contea di Hetian (Xinjiang, Cina). I campioni di voucher sono stati autenticati dal Prof. Xiaobo Li e depositati presso l'erbario della School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Cina). Il metodo di estrazione è stato utilizzato come specificato nella nostra precedente pubblicazione [4]. IlEstratto di Cistanche tubulosa(CTE) i campioni sono stati conservati a 4 gradi e ridisciolti con acqua sterile prima dell'uso. Le soluzioni acquose sterili del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)i campioni sono stati quindi filtrati attraverso una membrana 0.22 μm e i filtrati sono stati raccolti in tubi sterili.

L'echinacoside è stato fornito dal laboratorio del Dr. Pengfei Tu, l'Università di Pechino (Pechino, Cina). Acteoside, isoacteoside, 2′-acetylacteoside e cistanoside A sono stati acquistati da Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Cina). Idrossitirosolo, acido caffeico, acido 3,4-diidrossibenzenepropionico, 3-acido idrossifenilpropionico e 3-acido fenilpropionico sono stati acquistati da Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Cina). La purezza di ciascun componente è stata determinata essere > 95 percento mediante HPLC-UV. L'acetonitrile di grado HPLC è stato acquistato da Merck (Darmstadt, Germania). L'acqua deionizzata è stata preparata da acqua distillata utilizzando un sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Tutti gli altri reagenti e prodotti chimici utilizzati erano di grado analitico.

2.2. Esperimenti sugli animali

Ratti maschi Sprague-Dawley (200 ± 20 g) sono stati acquistati dalla Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pechino, Cina) e alloggiati nel Laboratory Animal Center della Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Cina). Gli animali sono stati alloggiati in gruppo a temperatura ambiente controllata (25 ± 2 gradi, 55 ± 10 percento di umidità relativa) con un ciclo luce-buio di 12:12 h. Ai ratti è stato concesso libero accesso a normali ratti di laboratorio chow e acqua per 1 settimana. Le strutture e i protocolli per gli animali sono stati approvati dall'Animal Ethics Committee dell'Università Jiao Tong di Shanghai (Shanghai, Cina).

Dopo una settimana di acclimatamento, dodici ratti naive sono stati divisi casualmente in due gruppi (n=6), il gruppo di controllo e il gruppo di stress cronico imprevedibile (CUS). I ratti CUS sono stati sviluppati come nel nostro precedente rapporto [4], che sono stati sottoposti a una varietà di fattori di stress: rumore bianco (100 dB) per 1 h, illuminazione stroboscopica notturna a bassa intensità (120 flash/min), privazione di acqua per 24 h, vuoto bottiglie d'acqua per 1 h (dopo la privazione dell'acqua), privazione di cibo per 24 h, contenzione fisica (1-2 h), nuoto forzato (5 min), gabbia sporca per 24 h (200 ml di acqua in 100 g di lettiera di segatura), pizzico di coda ( 1 min), shock per 30 min, inclinazione della gabbia di 45 gradi per 24 h e illuminazione notturna (12 h). Gli stress sono stati applicati in modo continuo e casuale per 4 settimane, la disposizione dettagliata è descritta nella Tabella S1. Dopo 4 settimane di stress, il test di preferenza del saccarosio, il test in campo aperto e il test di alimentazione con soppressione di novità sono stati eseguiti come descritto in precedenza [4]. Lo schema del CUS e del test comportamentale è mostrato in Fig. S1. Dopo test comportamentali, da ciascun ratto sono stati ottenuti almeno 4 pellet fecali e posti in provette coniche sterili per l'analisi in vitro di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)metabolismo.

2.3. Metabolismo gastrointestinale del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)da ratto normale e CUS in vitro

2.3.1. Metabolismo del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in succhi gastrici e intestinali simulati

Cinquanta milligrammi di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati aggiunti rispettivamente a 10 ml di succo gastrico simulato e succo intestinale. Poi CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato incubato a 37 gradi per 4 h nel succo gastrico e 6 h nel succo intestinale. La miscela coltivata (1 ml) è stata spenta con 3 ml di n-butanolo saturo di acqua immediatamente a 0 e 4 h nel succo gastrico e a 0 e 6 h in succo intestinale. Il metodo di elaborazione del campione utilizzato è stato come descritto in precedenza [9].

2.3.2. Metabolismo del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)dal microbiota intestinale di ratto normale e CUS

Campioni fecali freschi di ratto normale e CUS sono stati prima miscelati e omogeneizzati con 25 volte il volume del brodo GAM. I sedimenti sono stati rimossi mediante filtrazione attraverso tre pezzi di garza. La sospensione è stata quindi incubata a 37 gradi in un incubatore anaerobico in cui l'aria è stata sostituita da una miscela di gas (H2 5 percento, CO2 10 percento, N2 85 percento). Cinquanta milligrammi di CTE sono stati aggiunti separatamente a 5 ml di sospensione fecale di ratto normale e CUS e la sospensione è stata incubata a 37 gradi per 48 ore. La miscela coltivata è stata rimossa ed estratta con n butanolo saturo di acqua a 0, 12, 24 e 48 h. Il metodo di elaborazione del campione è stato descritto in precedenza [9].

2.3.3. Metabolismo sequenziale del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)dal succo gastrico, succo intestinale, microbiota intestinale di ratto normale e CUS

In primo luogo, 100 mg di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato aggiunto a 1{{10}} ml di succo gastrico simulato e incubato a 37 gradi per 4 h. L'intera reazione è stata spenta di 3 volte il volume di n-butanolo saturo di acqua e centrifugata a 3000 rpm per 15 minuti, seguita dall'evaporazione del surnatante sotto un flusso di azoto gas a 37 gradi. In secondo luogo, il residuo è stato ridisciolto in 0,4 mL di acqua sterile, aggiunto a 8 mL di succo intestinale simulato e incubato a 37 gradi per 6 ore. Il campione con succo gastrico è stato preparato allo stesso modo. Infine, il residuo è stato ridisciolto in 0,3 mL di acqua sterile, aggiunto rispettivamente a 6 mL di sospensioni fecali di ratto normale e CUS e incubato a 37 gradi per 48 ore in un incubatore per anaerobici. Un millilitro della reazione è stato spento da 3 mL di n-butanolo saturo di acqua immediatamente a 0 e 4 h nel succo gastrico, a 0 e 6 h nel succo intestinale e a 0, 12, 24 e 48 h nel microbiota intestinale di ratto . Il campione è stato elaborato in modo identico CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in succo gastrico simulato.

2.4. Metabolismo del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)da ratto normale e CUS in vivo

Ciascun ratto dei due gruppi è stato poi alloggiato in una gabbia metabolica individuale. Dopo il digiuno notturno che consentiva solo il libero accesso all'acqua, tutti i ratti sono stati somministrati per via orale con 2 mL di acqua tramite tubo agastrico. Campioni bianchi di urina e feci sono stati raccolti da tutti i ratti dalle 0 ore alle 12 ore. Inoltre, CTE(estratto di Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) è stato somministrato mediante sonda gastrica. Campioni di urina e feci sono stati raccolti da 0 h a 24 h. Tutti i campioni di urina e feci sono stati immediatamente conservati a -80 gradi.

Campioni di urina e feci di ratto normale e CUS sono stati pretrattati come descritto in precedenza [12]. Tutti i campioni risultanti sono stati analizzati mediante UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Metodo analitico

L'UPLC è stato eseguito su un sistema Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) con una colonna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) mediante eluizione in gradiente utilizzando {{10}},1 percento di acido formico acetonitrile (A) e 0,1 percento di acido formico in acqua (B) a una velocità di flusso di 0,4 ml/min . Il profilo del gradiente era: 0–5 min (LA: 5–20 percento), 5–7,5 min (LA: 20–30 percento), 7,5–10 min (LA: 30–70 percento), 10–11 min (LA : 70–100 percento), e si è tenuto per 1,5 min. Il gradiente è stato riciclato al 5 percento in 0,5 minuti ed è stato mantenuto per 2,5 minuti per la corsa successiva. Il volume di iniezione era di 3 μL. La temperatura del forno a colonna è stata impostata a 35 gradi.

La spettrometria di massa è stata eseguita utilizzando uno spettrometro di massa IMS Waters Vion (Waters Corp., Milford, MA, USA). La ionizzazione è stata eseguita in modalità elettrospray negativo (ESI-). I parametri MS erano i seguenti: tensione capillare, -2.{1}} kV; tensione del cono, 20 V; temperatura sorgente, 120 gradi ; temperatura di desolvatazione, 500 gradi ; flussi gassosi di cono e di desolvatazione, rispettivamente 50 e 1000 L/h. Per una misurazione accurata della massa, la leucina-encefalina è stata utilizzata come massa di blocco per generare uno ione [M–H]− (m/z 554,2615). Un esperimento MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) in due funzioni di scansione è stato condotto come segue: funzione 1 (bassa energia): m/z 50–1000, tempo di scansione 0,25 s, ritardo interscansione 0,02 s, energia di collisione 6 eV; funzione 2 (alta energia): m/z50–1000, tempo di scansione 0,25 s, ritardo tra le scansioni 0,02 s, rampa di collisione di 20–45 eV.

2.6. Elaborazione dati

I dati sono stati elaborati utilizzando il software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) per l'identificazione dei metaboliti all'interno dei dati grezzi a scansione completa di massa accurata raccolti tramite MSE. I composti sono stati identificati sulla base di massa accurata, frammenti nella spettrometria di massa ad alta energia. La soglia di intensità è stata impostata su 100,0 conteggi. L'identificazione del bersaglio, la tolleranza di corrispondenza frammento e altri parametri sono stati impostati automaticamente.

3. Risultati

3.1. Cambiamenti comportamentali nel ratto da depressione indotta da CUS

I ratti con sintomi depressivi indotti da CUS sono stati valutati mediante test comportamentali tra cui test di preferenza del saccarosio, test in campo aperto e test di alimentazione con soppressione della novità. Il test t di Student ha rivelato che la preferenza per il saccarosio nel test di preferenza per il saccarosio (p <.001), la="" distanza="" totale="" coperta="" nel="" test="" in="" campo="" aperto="" (p=""><.001) e="" la="" latenza="" a="" mangiare="" nel="" test="" di="" alimentazione="" con="" soppressione="" della="" novità="" (p=""><.01) erano="" significativamente="" diverso="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo="" dopo="" 4-settimana="" di="" trattamento="" con="" cus="" (fig.="" 1).="" questi="" risultati="" hanno="" indicato="" che="" il="" modello="" di="" stress="" cronico="" imprevedibile="" è="" stato="" sviluppato="" con="">

3.2. Caratterizzazione dei costituenti chimici del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)

Un'analisi completa dei costituenti prototipo di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato eseguito da UPLC-Q-TOF-MS. In totale, 27 elettori di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati rilevati e caratterizzati provvisoriamente, inclusi 20 PhG, 5 iridoidi e glicosidi iridoidi e 2 oligosaccaridi. Informazioni dettagliate, inclusi tempo di ritenzione, MS accurati e frammenti di ioni MS/MS, sono elencate in Informazioni di supporto (Tabella S2) per fornire informazioni dettagliate sulla struttura di questi costituenti chimici. UPLC-Q-TOF-MS totale ioncromatogramma (TIC) di CTE è stato mostrato in Fig. S2.

3.3. Metabolismo gastrointestinale del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)da ratto normale e CUS in vitro

In questo studio, i potenziali metaboliti di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)di ratti normali e CUS in vitro sono stati rilevati dai TIC e identificati con una combinazione di composizioni elementari e spettri di massa di frammenti MS/MS dopo averli confrontati con i campioni di controllo. Tutti i metaboliti da CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei succhi gastrici e intestinali simulati, il microbiota intestinale di ratto normale e CUS è elencato nella Tabella 1.

3.3.1. Metabolismo del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in succhi gastrici e intestinali simulati

Sette metaboliti di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nel succo gastrico simulato sono stati identificati provvisoriamente da informazioni accurate sulla massa e sul frammento MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2,36 min), M5 (m/z 445.1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20,4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) e M18 (m/z623 .1968, C29H36O15, 5,81 min). La deglicosilazione, la deidrossilazione, la deidrogenazione e l'isomerizzazione sono state considerate le principali vie metaboliche della CTE nel succo gastrico. È stato riscontrato che M4 e M5 hanno un peso molecolare di 2 Da e 16 Da inferiore al loro componente prototipo, il decaffeilattoside, e quindi identificati rispettivamente come i suoi prodotti deidrogenati e deidrossilati. M12 è stato identificato come un isomero dell'echinacoside, che produce gli stessi ioni dell'echinacoside a m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Gli stessi metaboliti sono stati rilevati dopo CTE(estratto di Cistanche tubulosa)incubazione nel succo intestinale. È interessante notare che il gruppo caffeoile nella posizione C-6′ inPhGs è stato prontamente metabolizzato dagli enzimi digestivi nel succo intestinale per produrre i suoi metaboliti decaffeil e acido caffeico.

3.3.2. Metabolismo del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)dal microbiota intestinale di ratto normale e CUS

Un totale di 20 metaboliti biotrasformati da CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nel normale microbiota intestinale di ratto sono stati rilevati e identificati (Fig. 2). Dai risultati, è stato osservato che i PhG sono stati degradati ad aglicone idrossitirosolo (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) e acido caffeico (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), quindi hanno sono stati ulteriormente metabolizzati in M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,35 min) e M11 (m/z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 min) mediante deidrossilazione, riduzione e metilazione. Inoltre, le vie metaboliche centrali che hanno prodotto metaboliti diretti dei composti prototipo PhG da CTE nel microbiota intestinale di ratto normale sono riduzione, metossilazione, deglicosilazione, decaffeoile, deidrogenazione e isomerizzazione.

Dopo l'incubazione nel microbiota intestinale di ratto da depressione indotta da CUS, CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato convertito in 20 metaboliti attraverso le stesse vie metaboliche dei ratti normali.

3.3.3. Metabolismo sequenziale della CTE da parte del succo gastrico, del succo intestinale, del microbiota intestinale di ratto normale e CUS

Dopo incubazione sequenziale in succo gastrico, succo intestinale, normale e microbiota intestinale di ratto CUS, CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato metabolizzato in 14 metaboliti (di cui 8 con succo gastrico, 7 con succo intestinale, 11 normale e 10 con microbiota intestinale di ratto CUS). Tra questi, M2(HT) e M11 (3-acido idrossifenilpropionico, 3-HPP) erano i metaboliti finali dei PhG dopo l'incubazione sequenziale di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nel succo gastrico, nel succo intestinale e nel microbiota intestinale. Non vi era alcuna differenza significativa nei metaboliti tra ratto normale e CUS.

M8, M9, M14, M17, M19 e M20 sono stati rilevati solo nel metabolismo indipendente di CTE dal microbiota intestinale di ratto normale e CUS. Questi metaboliti erano principalmente intermedi metabolici che erano stati completamente metabolizzati in metaboliti finali nello studio del metabolismo sequenziale del CTE e sono quindi difficili da rilevare.

3.3.4. Differenze tra il tasso metabolico di CTE da microbiota intestinale normale e CUS

Per chiarire le differenze tra il tasso metabolico di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)microbiota intestinale di ratto normale e CUS, il contenuto relativo di 27 composti prototipo e 20 metaboliti dopo incubazione con succo gastrico, succo intestinale, microbiota intestinale di ratto normale e CUS sono stati determinati separatamente e in sequenza (Tabelle S3 e S4). I risultati hanno indicato che, sebbene non vi fossero differenze significative tra CTE(estratto di Cistanche tubulosa)metaboliti di ratti normali e depressi, è stata osservata una differenza significativa nei loro tassi metabolici. Ad esempio, C2 e C5 sono stati identificati come 8-acido epiloganico o suo isomero. Sono stati completamente metabolizzati in campioni normali entro 12 ore di incubazione. Nel microbiota intestinale di ratto patologicamente depresso, tuttavia, sono stati completamente metabolizzati dopo 48 h di incubazione. Era evidente che il tasso metabolico nel ratto normale era più veloce di quello nel ratto CUS. Risultati simili sono stati scoperti da C18 (isoacteoside). Inoltre, è interessante notare che l'area del picco di M12 (isomerizzazione dell'echinacoside) e M16 (isomerizzazione del tubuloside A) nei campioni normali era molto più grande di quella dei campioni CUS, indicando che la reazione di isomerizzazione del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)era più prevalente nel microbiota intestinale di ratto normale che nel microbiota intestinale di ratto depresso.

3.4. Metabolismo di CTE da ratto normale e CUS in vivo

Confrontando i campioni biologici del gruppo trattato con CTE con campioni biologici in bianco, un totale di 26 metaboliti (composto 1–26) di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati rilevati ratti innormali e CUS (Tabella 2). I tipici cromatogrammi UPLC di campioni di urina di ratto normale e CUS sono presentati in Fig. 3.

3.4.1. Caratterizzazione dei metaboliti della CTE nella raturina normale e CUS

Un totale di 18 metaboliti in vivo di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in campioni di urina di ratto normale sono stati identificati provvisoriamente. I metaboliti di degradazione dei PhG inclusi HT e CA e i loro ulteriori metaboliti di solfatazione (composto 1, 2, 3, 5, 8 e 16), metilazione (6, 21, 22 e 24) e metossilazione (13 e 14) erano i principali metaboliti nelle normali urine di ratto. I glicosidi iridoidi sono stati prontamente metabolizzati in agliconi (23, 25 e 26) attraverso la deglicosilazione. È interessante notare che nessun componente prototipo è stato rilevato nel normale campione di urina di ratto.

Nel campione di urina di ratto depressivo, 22 metaboliti di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati rilevati e caratterizzati. Un prototipo di composto, 8-acido epiloganico, è stato rilevato nell'urina patologica di ratto. Altri metaboliti erano conformi a quelli trovati nelle normali urine di ratto, inclusi i metaboliti solfati (1, 2, 3, 8, 10 e 16), i metaboliti metilati (6, 11, 19 e 22), i metaboliti metossilati (13 e 14) di HT e CA, e theaglycones di glicosidi iridoidi (25 e 26).

3.4.2. Caratterizzazione dei metaboliti del CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei ratti normali e CUS

In questo studio, solo un metabolita (composto 20, 3-HPP) di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato identificato nelle normali feci di ratto. La maggior parte dei PhG è stata inizialmente degradata a CA e di conseguenza ha subito un ulteriore metabolismo nel suo principale metabolita microbico, 3- HPP. Nel campione fecale del ratto CUS, 3 metaboliti sono stati caratterizzati in via provvisoria, tra cui HPP solfato 3- (composto 16) e HT solfato (composti 2 e 3).

3.4.3. Differenze tra i metaboliti in vivo di CTE nei ratti normali e CUS

Dopo somministrazione orale di CTE(estratto di Cistanche tubulosa), i metaboliti in vivo hanno mostrato differenze evidenti nei ratti modello sani e depressi. 21 metaboliti (composti 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 e 19–26) sono stati rilevati sia in campioni di ratti sani che CUS. Il composto 23 (acido deglicosilatogeniposidico) è stato identificato solo in campioni di ratto sani, mentre i composti 4 (HT), 7 (8-acido epiloganico), 15 (3, 4-acido diidrossibenzenepropionico) e 18 ({{ 19}}Coniugazione di glucuronide HPP) sono stati rilevati solo in campioni di ratto modello CUS. In sintesi, i costituenti del prototipo sono stati rilevati solo nei ratti CUS, mentre sono stati scoperti più metaboliti di fase II nei ratti normali.

4. Discussione

In questo studio, tre modelli di incubazione in vitro tra cui succo gastrico, succo intestinale, microbiota intestinale di ratto normale e CUS sono stati impiegati in modo indipendente e sequenziale per studiare il profilo metabolico gastrointestinale della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in vitro. È stato riscontrato che PhGs e glicosidi iridoidi nel CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati prontamente metabolizzati nei loro glicosidi e agliconi secondari dal microbiota intestinale di ratto depressivo indotto da CUS. Successivamente, il metabolismo in vivo della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei ratti normali e CUS è stato anche verificato. Le vie metaboliche proposte per CTE(estratto di Cistanche tubulosa)in ratti sani e depressi indotti da CUS sono mostrati in Fig. 4. PhG, come echinacoside e acteoside, sono stati metabolizzati in HT e CA e CA ha subito un ulteriore metabolismo nel suo principale metabolita microbico, 3- HPP. HT, CA e 3-HPP sono stati quindi metabolizzati nei loro metaboliti solfati, metilati e metossilati. I glicosidi iridoidi inclusi acido geniposidico, kankanoside A e kankanoside N sono stati metabolizzati nei loro agliconi attraverso la deglicosilazione. Questi hanno ulteriormente dimostrato che PhG e glicosidi iridoidi nel CTE(estratto di Cistanche tubulosa)sono stati prontamente metabolizzati in glicosidi e agliconi secondari nei ratti CUS. Questi metaboliti normalmente mostrano un migliore assorbimento intestinale e biodisponibilità per essere ulteriormente assorbiti nel sangue per esercitare attività biologica [16-18]. Vale la pena notare che l'isomerizzazione era prevalente per i PhG nel tratto gastrointestinale, i metaboliti rilevanti sono stati identificati dopo essere stati confrontati con il tempo di ritenzione UPLC dei loro composti prototipo sulla base di un profilo di gradiente UPLC ideale ottimizzato.

L'acido caffeico era il prodotto di degradazione principale della CTE(estratto di Cistanche tubulosa)dal microbiota intestinale di ratto patologico depressivo. Pubblicazioni precedenti riportavano che l'acido caffeico produce effetti simil-antidepressivi nel test di nuoto forzato nei topi. Sia il livello di mRNA del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) nella corteccia frontale che il livello di mRNA di TrkB nell'amigdala erano significativamente ridotti dopo il test di nuoto forzato e la prima riduzione era significativamente inibita dall'acido caffeico [19]. L'idrossitirosolo era l'aglicone dei PhG, che protegge la neurogenesi e la funzione cognitiva prevenendo la sottoregolazione indotta dallo stress della proteina neurale BDNF [20]. Pertanto, è necessario prestare maggiore attenzione ad alcuni metaboliti bioattivi (es. HT e CA) trasformati dal microbiota intestinale dopo somministrazione orale.

Inoltre, i presenti risultati forniscono la prova che nel microbiota intestinale di ratto depressivo, la capacità metabolica di generare glicosidi e agliconi secondari era notevolmente più debole di quella innormale microbiota intestinale di ratto. Il motivo è probabilmente da attribuire a cambiamenti strutturali del microbiota intestinale indotti dalla depressione, che portano a una diminuzione dell'attività degli enzimi metabolici prodotti dal microbiota intestinale [21]. È interessante notare che uno studio precedente ha mostrato che il phylum Bacteroidetes codificava i geni più abbondanti del glicoside idrolasi e del polisaccaride liasi per l'idrolisi del glicoside e la scissione dei carboidrati complessi con un meccanismo di eliminazione [22]. In particolare, Bacteroides spp. tra cui B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis e B. xylanisolvens ha mostrato un numero totale dominante di geni che codificano per GH e PL. Anche Parabacteroides distasonis possiede le stesse caratteristiche [22]. I nostri studi precedenti hanno confermato che 28-la stimolazione da stress cronica imprevedibile diurna ha ridotto l'abbondanza relativa dei generi Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas e Weissella, mentre nei ratti ha aumentato Ruminococcus e Deinococcus [4]. È interessante notare che Bacteroides e Parabacteroides erano i due taxa microbici più abbondanti che rappresentavano circa il 20% di abbondanza relativa nei ratti normali. Dopo il trattamento con CUS, l'abbondanza relativa di Bacteroides e Parabacteroides è stata drasticamente ridotta a circa il 5% nei ratti modello depressi. Pertanto, ciò porterà inevitabilmente ad una riduzione del numero totale di enzimi GH e PL nei ratti CUS e disturberà ulteriormente la reazione deglicosilata da parte del microbiota intestinale depressivo CUS dopo somministrazione orale di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)nei topi modello.

5. conclusione

Nel presente studio, la tecnica UPLC-Q-TOF-MS è stata stabilita e applicata per lo screening e l'identificazione dei metaboliti diEstratto di Cistanche tubulosain ratti normali e depressi CUS in vitro e in vivo. I risultati hanno mostrato che CTE(estratto di Cistanche tubulosa)è stato metabolizzato in agliconi e prodotti di degradazione di PhG e glicosidi iridoidi dal microbiota intestinale sia sano che depresso. Dopo somministrazione orale di CTE(estratto di Cistanche tubulosa), metaboliti di fase II degli agliconi e prodotti di degradazione dei PhG e degli iridoidglicosidi sono stati trovati prevalentemente nelle urine di ratto. La capacità metabolica di generare glicosidi e agliconi secondari nel microbiota intestinale del ratto depressivo era molto più debole di quella del microbiota intestinale del ratto normale, che è stata attribuita alle glicosideidrolasi disordinate prodotte dal microbiota intestinale nei ratti depressi CUS. Questo studio fornisce una nuova prospettiva per il successivo sviluppo di CTE(estratto di Cistanche tubulosa)come potenziale antidepressivo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2017YFC1702400).

Appendice A. Dati supplementari

I dati supplementari a questo articolo possono essere trovati online su HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Da: ' Metabolismo in vitro e in vivo diEstratto di Cistanche tubulosain ratti depressivi indotti da stress imprevedibili e cronici' diYang Li, et al

--Rivista di cromatografia B 1125 (2019) 121728

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