Valutazione in vitro dei ceppi probiotici più attivi in grado di migliorare le funzioni della barriera intestinale e di prevenire le malattie infiammatorie del sistema gastrointestinaleⅡ
Nov 29, 2023
2. Materiali e metodi
2.1. Colture cellulari
Le cellule Caco{{0}} di adenocarcinoma del colon caucasico umano (ATCC® HTB-37™) e le cellule HT29-MTX secernenti muco epiteliale del colon umano (Sigma Aldrich) sono state inizialmente coltivate separatamente, entrambe utilizzando Terreno DMEM (Gibco) integrato con siero bovino fetale al 10% (Gibco), 100 UI/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina (Gibco) e 2 mM di glutammina (Gibco), a 37 ◦C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Quindi, le co-colture sono state allestite in piastre 12-wellTranswell® (con inserto in policarbonato da 12 mm e pori da 0,4 µm) placcando le cellule nel compartimento basolaterale in un rapporto Caco-2:HT di 75:25 29-MTX, ed effettuato per 21 giorni, cambiando il mezzo ogni 2 giorni.
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2.2. Ceppi batterici
Ceppi di lattobacilli, tra cui Limosilactobacillus fermentum isolato da latte di bufala [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 e Lacticaseibacillus paracasei IMC502 forniti dal leader del progetto Incube, R&D—IBSA Farmaceutici Italia, sono stati coltivati nella fermentazione del bioreattore processi e liofilizzati per ottenere le polveri utilizzate come materiale di partenza. Prima dell'esperimento, le polveri sono state risospese e coltivate in brodo Man, Rogosa e Sharpe (MRS-Oxoid) a 37 ◦C in condizioni microaerofile per 24 ore.
2.3. Trattamento cellulare
Le cellule in co-coltura sono state trattate con diversi ceppi di Lactobacillus spp. (108 CFU/mL) a una molteplicità di infezione (MOI) di 100, da solo o in combinazione con 20 µg/mL di lipopolisaccaride (LPS) di S. Typhimurium, per 24 ore a 37 ◦C al 5% di CO2 in DMEM senza antibiotici.
2.4. PCR in tempo reale
Per valutare l'espressione di citochine pro- e antinfiammatorie, HBD-2 e TJ, le cellule alla fine dei trattamenti sono state lavate tre volte con PBS sterile e l'RNA totale è stato estratto utilizzando il kit High Pure RNA Isolation Kit ( Roche Diagnostics). Un totale di 2{{20}}0 ng di RNA cellulare sono stati trascritti in modo inverso (Expand Reverse Transcriptase, Roche) in DNA complementare (cDNA) utilizzando primer esamerici casuali (randomhexamers, Roche) a 42 ◦C per 45 minuti, secondo le istruzioni del produttore. PCR in tempo reale per IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, Occludin, Zonulin-1 e Claudin{{ 14}}è stato effettuato con il kit LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) utilizzando 2 µL di cDNA, corrispondenti a 10 ng di RNA totale in un volume finale di 20 µL, 3 mMMgCl2 e 0,5 µM primer senso e antisenso ( Tabella 1). Dopo l'amplificazione, l'analisi della curva di fusione è stata eseguita riscaldando a 95 ◦C per 15 s con una velocità di transizione della temperatura di 20 ◦C/s, raffreddando a 60 ◦C per 15 s con una velocità di transizione della temperatura di 20 ◦C/s, e quindi riscaldando il campione da 0,1 ◦C/s a 95 ◦C. I risultati sono stati poi analizzati utilizzando il software LightCycler (Roche Diagnostics). La curva standard di ciascuna coppia di primer è stata stabilita con diluizioni seriali di cDNA. Tutte le PCR sono state eseguite in triplicato. La specificitàdei prodotti di amplificazione è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2% e visualizzazione mediante colorazione con bromuro di etidio [6].
2.5. Saggio ELISA
La presenza di IL-6, IL-8, IL-1 , TNF- , TGF- , HBD-2, Zonulin-1, Occludin e Claudin{{7 }} nei lisati cellulari di co-colture Caco-2/HT29-MTX infettate con diversi ceppi di lattobacilli con o senza LPS è stato analizzato utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA; Invitrogen, IL{{12 }}, IL-8, IL-1 alfa, TNF alfa e TGF beta-1 Kit HumanELISA; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beta (umano)—Kit ELISA; Elabscience Biotechnology Inc. Zonulina umana, kit ELISA OCLN umano (Occludin) e CLDN1 umano (Claudin 1).
2.6. Saggio di adesione e invasività
La capacità di L. brevis, L. reuteri e L. rhamnosus di ridurre l'adesività e l'invasività di S. Typhimurium e EIEC nelle coculture intestinali è stata studiata in tre diversi tipi sperimentali: (i) test competitivo, in cui le cellule epiteliali intestinali sono state incubate simultaneamente con lattobacilli (108 CFU/mL) e S. Typhimuriumor EIEC (108 CFU/mL) per 2 ore. (ii) Saggio di inibizione, in cui le cellule sono state preincubate con lattobacilli (108 CFU/mL) per 2 ore, quindi S. Typhimurium o EIEC (108 CFU/mL) sono state aggiunte e incubate per altre 2 ore. (iii) Saggio di spostamento in cui le cellule sono state pre-incubate con S. Typhimurium o EIEC (108 CFU/mL) per 2 ore e poi sono stati aggiunti lattobacilli (108 CFU/mL) e ulteriormente incubati per 2 ore. Al termine di questo tempo, i monostrati infetti sono stati lavati estensivamente in PBS, quindi lisati con una soluzione di Triton X-100 allo 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente temperaturaper contare i batteri interiorizzati. Le aliquote di lisati cellulari sono state diluite in serie e piastrate su agar Hektoen (OXOID) e incubate a 37 ◦C durante la notte per quantificare il totale dei batteri vitali associati alle cellule (CFU/mL). Per i test di invasività, dopo l'incubazione con i batteri, i monostrati infetti sono stati ampiamente lavati con PBS sterile e ulteriormente incubati per altre 2 ore nel mezzo DMEM, integrato con gentamicina solfato (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich) per uccidere i batteri extracellulari, quindi le cellule sono state lisate e piastrate come precedentemente descritto per quantificare il numero totale di batteri internalizzati (CFU/mL).
2.7. Analisi statistica
Differenze significative tra i gruppi sono state valutate tramite ANOVA a due vie utilizzando GraphPad Prism 8.0 e il confronto tra le medie è stato calcolato utilizzando il test t di uno Studente. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.
Medicina naturale a base di erbe per alleviare la stitichezza-cistanche
Cistanche è un genere di piante parassite che appartiene alla famiglia delle Orobanchaceae. Queste piante sono note per le loro proprietà medicinali e vengono utilizzate da secoli nella medicina tradizionale cinese (MTC). Le specie Cistanche si trovano prevalentemente nelle regioni aride e desertiche della Cina, della Mongolia e di altre parti dell'Asia centrale. Le piante di Cistanche sono caratterizzate dai loro steli carnosi e giallastri e sono molto apprezzate per i loro potenziali benefici per la salute. Nella MTC, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà toniche ed è comunemente usata per nutrire i reni, aumentare la vitalità e supportare la funzione sessuale. Viene anche utilizzato per affrontare problemi legati all'invecchiamento, all'affaticamento e al benessere generale. Sebbene la Cistanche abbia una lunga storia di utilizzo nella medicina tradizionale, la ricerca scientifica sulla sua efficacia e sicurezza è continua e limitata. Tuttavia, è noto che contiene vari composti bioattivi come glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignani e polisaccaridi, che possono contribuire ai suoi effetti medicinali.
Wecistanche'spolvere di cistanza, compresse di cistanza, capsule di cistanzae altri prodotti vengono sviluppati utilizzandodesertocistanocome materie prime, che hanno tutte un buon effetto sull'alleviare la stitichezza. Il meccanismo specifico è il seguente: si ritiene che la Cistanche abbia potenziali benefici per alleviare la stitichezza in base al suo uso tradizionale e ad alcuni composti che contiene. Sebbene la ricerca scientifica specifica sugli effetti della Cistanche sulla stitichezza sia limitata, si ritiene che abbia molteplici meccanismi che potrebbero contribuire al suo potenziale per alleviare la stitichezza. Effetto lassativo:Cistancheè stato a lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese come rimedio contro la stitichezza. Si ritiene che abbia un lieve effetto lassativo, che può aiutare a favorire i movimenti intestinali e indurre la stitichezza. Questo effetto può essere attribuito a vari composti presenti nelle Cistanche, come i glicosidi feniletanoidi e i polisaccaridi. Inumidire l'intestino: in base all'uso tradizionale, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà idratanti, mirate specificamente all'intestino. Promuovere l'idratazione e la lubrificazione dell'intestino può aiutare ad ammorbidire gli organi e facilitare il passaggio, alleviando così la stitichezza. Effetto antinfiammatorio: la stitichezza può talvolta essere associata ad un'infiammazione del tratto digestivo. Cistanche contiene alcuni composti, tra cui glicosidi feniletanoidi e lignani, che si ritiene abbiano proprietà antinfiammatorie. Riducendo l’infiammazione nell’intestino, può aiutare a migliorare la regolarità del movimento intestinale e ad alleviare la stitichezza.
