Valutazione in vitro dei ceppi probiotici più attivi in ​​grado di migliorare le funzioni della barriera intestinale e di prevenire le malattie infiammatorie del sistema gastrointestinaleⅢ

4. Discussione

Il mantenimento dell'integrità della barriera intestinale è di cruciale importanza nella prevenzione dell'insorgenza non solo di malattie intestinali, ma anche di disturbi metabolici, autoimmuni e del sistema nervoso [36,37]. I numerosi studi effettuati sulla mucosa intestinale hanno dimostrato che essa protegge l’ospite attraverso la stimolazione dei meccanismi dell’immunità innata e acquisita [38], e garantisce l’omeostasi grazie al mantenimento dell’equilibrio del microbiota [39]. I lattobacilli sono probiotici comunemente presenti nei fermentati alimenti e nel microbiota intestinale di esseri umani e animali [40,41].

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Negli ultimi anni sono stati compiuti grandi progressinello studio dei meccanismi di simbiosi tra batteri lattici e l'ospite. Tra i loro principali effetti benefici è stata dimostrata la regolazione dello squilibrio della flora intestinale [42], il rafforzamento delle funzioni della barriera intestinale [23,27,36 ], il mantenimento dell'omeostasi [36,43], la regolazione del sistema immunitario [43] e la produzione di neurotrasmettitori (asse intestino-cervello) [44]. È stato inoltre dimostrato che l'esopolisaccaride (EPS) prodotto dai lattobacilli ha la peculiare capacità di modificare il microbiota [45] e di migliorare la colonizzazione e la crescita dei batteri intestinali agendo come fonte di carbonio [46].

Inoltre, i probiotici possono competere con i patogeni colonizzatori del tratto gastrointestinale, prevenendone l’adesione e inibendone la crescita a causa dell’abbassamento del pH causato dalla produzione di acido lattico [36]. I modelli in vitro che simulano il colon umano rappresentano uno strumento utile per studi meccanicistici sulla le interazioni dei probiotici con l'epitelio intestinale [47]; in questo lavoro abbiamo utilizzato un modello sperimentale di co-colture di cellule epiteliali intestinali, Caco-2 e HT29-MTX, e abbiamo analizzato la loro interazione con diversi ceppi di Lactobacillus spp. per determinare quale di questi ceppi ha mostrato la migliore funzionalità proteggendo l'epitelio intestinale, rafforzandone la barriera e promuovendo proprietà antinfiammatorie e immunomodulanti.

La scelta di lavorare con una co-coltura è dovuta a diverse evidenze: innanzitutto, la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) è molto più elevata nei monostrati Caco-2 (fino a 500 ohm cm2) rispetto all'intestino umano (12–69 ohm cm2) a causa di un'elevata espressione di TJ; inoltre, la barriera intestinale è composta da diversi fenotipi cellulari, tra cui enterociti, cellule caliciformi, cellule di Paneth, cellule endocrine e cellule staminali. Il modello di co-coltura che combina i due principali fenotipi cellulari presenti nell'intestino, Caco-2 e HT29-MTX che secerne muco, fornisce un monostrato epiteliale rivestito di muco che imita in modo più efficiente la condizione che si verifica in vivo.

L'efficacia di questo modello è stata dimostrata da Mahler et al. [48].La scelta dei ceppi è dovuta al fatto che erano in fase di commercializzazione ed erano già stati oggetto di diversi studi; infatti L. brevis SP-48 è presente in prodotti commerciali (es. Florap lady) che favoriscono l'equilibrio della flora intestinale e la funzionalità delle vie urinarie. Inoltre, il nostro recente studio ha indicato che inibisce l’H. pylori e agisce come modulatore del sistema immunitario, riducendo l’infiammazione potenzialmente correlata al trattamento della malattia intestinale [49].

Allo stesso modo, l’attività di L. fermentum è stata valutata in un modello di cellule epiteliali gastriche dimostrando la modulazione delle citochine infiammatorie e l’inibizione di H. pylori [32]; inoltre, altri ceppi di L. fermentum hanno mostrato proprietà anti-infettive e immunomodulatorie [50]. Lactobacillus rhamnosus IMC 501 e Lactobacillus paracasei IMC 502 sono ceppi probiotici disponibili in commercio (ad esempio, SYNBIO). Verdenelli e coautori hanno dimostrato la persistenza dei due ceppi, somministrati in associazione, nel tratto intestinale dei soggetti sottoposti al test, ed un miglioramento della naturale regolarità e del benessere intestinale [51,52].L. brevis normalmente colonizza il tratto gastrointestinale umano ed è stato dimostrato che fornisce diversi effetti stimolanti la salute [53], alcuni dei quali migliorano la funzione di barriera della mucosa [54]. L. reuteri LR92 è presente anche nei prodotti commerciali e studi clinici hanno dimostrato che migliora i sintomi delle coliche nei neonati se somministrato preventivamente alle madri negli ultimi mesi di gravidanza [55].

Nella prima parte del lavoro abbiamo quindi trattato le co-colture, differenziate per 21 giorni, con i diversi ceppi di Lactobacillus spp. per 24 ore e abbiamo analizzato, mediante PCR in tempo reale e test ELISA, i livelli di espressione dei TJ Occludin, Zonulin-1 e Claudin-1 e del peptide antimicrobico HBD-2 . I risultati ottenuti hanno rivelato che tutti i ceppi di lattobacilli testati possono indurre significativamente l'espressione di TJ, in particolare L. brevis e L. rhamnosus. Per quanto riguarda l'HBD-2, invece, si apprezza una significativa induzione della produzione peptidica soprattutto in presenza di L. reuteri. Per valutare l'attività antinfiammatoria dei lattobacilli, le co-colture sono state trattate per 24 h con S. Typhimurium LPS da solo o in combinazione con ceppi diversi,e i livelli di espressione di citochine pro- e antinfiammatorie sono stati valutati utilizzando PCR in tempo reale e test ELISA.

I dati ottenuti hanno rivelato che, ad eccezione di IL-8 la cui espressione non era modulata da L. fermentum e L. paracasei, tutti i ceppi potevano indurre significativamente l'espressione di citochine proinfiammatorie e indurre quella della citochina antiinfiammatoria TGF- . Sulla base dei dati ottenuti, e considerando che tutti i ceppi probiotici analizzati hanno mostrato una significativa attività antinfiammatoria, possiamo affermare che tre specifici ceppi sembrano avere un effetto particolarmente benefico sulla mucosa intestinale: L. reuteri, che emerge per la sua capacità di stimolare significativamente la mucosa intestinale difese immunitarie favorendo il rilascio massiccio di HBD-2, L. rhamnosus e L. brevis, che hanno rivelato un'elevata capacità di rinforzare la barriera intestinale, condizione necessaria per il corretto mantenimento di diverse funzioni, tra cui l'assorbimento dei micronutrienti e il mantenimento dell'omeostasi. Nella seconda parte del lavoro, abbiamo quindi valutato la capacità di questi tre ceppi di inibire l'adesione e l'invasione di S. Typhimurium ed EIEC nella mucosa intestinale.

A questo scopo, sono stati condotti test di adesione e invasione in tre modi diversi (inibizione, competizione e spostamento) per comprendere le dinamiche dell'interazione tra i lattobacilli e i patogeni. Infatti, preincubando i lattobacilli, la loro capacità di produrre batteriocine e di abbassare il pH dell'ambiente può esercitare un'attività kill che inibisce l'adesione del patogeno; d'altro canto, l'aggiunta contemporanea di entrambe le specie potrebbe provocare competizione tra le due specie batteriche, sia per il legame ai siti recettoriali cellulari, sia per l'assorbimento dei fattori nutritivi; infine, l'aggiunta del probiotico in seguito all'adesione del patogeno può provocarne lo spostamento dai siti di legame, anche a causa dell'attività kill esercitata dalle batteriocine.

I risultati ottenuti hanno mostrato che tutti e tre i ceppi hanno inibito significativamente l'adesione dell'EIEC nei test di competizione e ne hanno bloccato l'invasione attraverso competizione e inibizione. Questo diverso comportamento potrebbe essere dovuto al fatto che i lattobacilli non sono in grado di impedire l'adesione del patogeno se assunti preventivamente, mentre possono competere con esso; tuttavia, una volta avvenuta l'adesione, l'attività di miglioramento dell'integrità della barriera dei lattobacilli (che aumenta l'espressione delle giunzioni strette) previene l'invasione della sottomucosa intestinale. Per quanto riguarda S. Typhimurium, invece, l'attività inibitrice si esplica soprattutto in fase di adesione, sia nel saggio di inibizione che in quello di competizione, probabilmente perché evita a monte l'adesione del patogeno, riducendo così sensibilmente la carica batterica che invade il sottomucosa intestinale, che è già notevolmente ridotta. Nei saggi di spostamento non si sono ottenuti risultati soddisfacenti per entrambi i ceppi, né per quanto riguarda l'adesione né l'invasione, a dimostrazione che i lattobacilli non sono in grado di esplicare la loro azione protettiva nei confronti dei due patogeni se assunti ad infezione già avvenuta.

5. Conclusioni

Sebbene l’uso di integratori a base di probiotici sia praticato da molti anni, ultimamente l’interesse per questo tipo di prodotti è aumentato in modo significativo a causa del crescente interesse del pubblico nell’utilizzo di benefici/risorse naturali [56]. È stato ampiamente dimostrato che i lattobacilli sono probiotici che possono contribuire al mantenimento delle funzioni essenziali per uno stato di salute ottimale; tuttavia, questi studi in vitro dimostrano che diversi ceppi probiotici possono agire diversamente nei confronti dell'epitelio e nei confronti del patogeno con cui interagiscono; per questo motivo sarebbe utile, nella progettazione di formulazioni a base di probiotici, tenere in considerazione la specificità dei ceppi e la loro destinazione d'uso, per ottenere formulazioni consortili in grado di ottenere la massima resa in termini di beneficio per il paziente.

Medicina naturale a base di erbe per alleviare la stitichezza-cistanche

Cistanche è un genere di piante parassite che appartiene alla famiglia delle Orobanchaceae. Queste piante sono note per le loro proprietà medicinali e vengono utilizzate da secoli nella medicina tradizionale cinese (MTC). Le specie Cistanche si trovano prevalentemente nelle regioni aride e desertiche della Cina, della Mongolia e di altre parti dell'Asia centrale. Le piante di Cistanche sono caratterizzate dai loro steli carnosi e giallastri e sono molto apprezzate per i loro potenziali benefici per la salute. Nella MTC, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà toniche ed è comunemente usata per nutrire i reni, aumentare la vitalità e supportare la funzione sessuale. Viene anche utilizzato per affrontare problemi legati all'invecchiamento, all'affaticamento e al benessere generale. Sebbene la Cistanche abbia una lunga storia di utilizzo nella medicina tradizionale, la ricerca scientifica sulla sua efficacia e sicurezza è continua e limitata. Tuttavia, è noto che contiene vari composti bioattivi come glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignani e polisaccaridi, che possono contribuire ai suoi effetti medicinali.

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