Aumento dei livelli di YKL-40 ma non di proteina C-reattiva nei pazienti con malattia di AlzheimerⅡ
Apr 11, 2023
2. Materiali e Metodi
2.1. Donatori umani
In questo studio sono stati inclusi un totale di 123 soggetti: (1) soggetti anziani non dementi senza alcuna evidenza di alcuna malattia neurodegenerativa (controlli sani) classificati come controlli (n=37); (2) MCI dovuto a pazienti con AD (MCI) (n=22); (3) probabili pazienti affetti da AD sporadici lievi/moderati-gravi (n=34); (4) Pazienti PD (n=30). I partecipanti allo studio sono stati arruolati dalla Clinica della memoria (controlli, MCI e soggetti AD) e dall'Unità per i disturbi del movimento (partecipanti PD) dell'Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid, Spagna). Le caratteristiche demografiche e cliniche del soggetto sono elencate nella Tabella 1.
Tutti i partecipanti sono stati classificati utilizzando criteri diagnostici stabiliti in quelli con MCI o probabile demenza AD [43-45]. La diagnosi si è basata su una dettagliata valutazione clinica, valutazione neuropsicologica e neuroimaging (MRI). La compromissione funzionale è stata misurata tramite il punteggio CDR (Clinical Dementia Rating) [46].
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I pazienti con PD sono stati diagnosticati seguendo i criteri diagnostici clinici della Movement Disorder Society (MDS) [47] e tutti i criteri soddisfatti per PD clinicamente stabilito. I pazienti con PD non hanno riferito di disturbi cognitivi e non hanno mostrato sintomi di demenza. Il gruppo di controllo era costituito da individui cognitivamente normali di età pari o superiore a 50 anni, senza segni clinici di deterioramento cognitivo e storia di malattie neurologiche o psichiatriche.
I criteri di esclusione per ogni partecipante erano una concomitante malattia cerebrovascolare significativa e l'evidenza di qualsiasi comorbilità medica neurologica, psichiatrica, medica o non neurologica che potesse influenzare la cognizione o la funzione motoria. L'approvazione dello studio è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca dell'Ospedale Universitario 12 de Octubre e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto.
2.2. Campione fluido
Raccolta I campioni di CSF sono stati raccolti da tutti i soggetti (inclusi pazienti sani e soggetti con MCI, AD e PD) ed elaborati secondo procedure standardizzate mediante puntura lombare in provette di polipropilene sterili da 15 mL. I campioni sono stati quindi centrifugati a 3000 rpm a 4 ◦C per 10 min. Le aliquote del surnatante sono state conservate a -80 °C in provette criogeniche in polipropilene da 0,5 mL con cocktail di inibitori della proteasi (Roche, Basilea, Svizzera).
I campioni di sangue sono stati ottenuti attraverso punture venose antecubitali da pazienti e soggetti sani. Il plasma è stato isolato da sangue intero raccolto in provette da 7 ml di EDTA-2Na. Il sangue intero è stato centrifugato a 2000 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. I supernatanti sono stati quindi raccolti e aliquotati in provette criogeniche in polipropilene con cocktail di inibitori della proteasi (Roche, Basilea, Svizzera) e conservati a -80 °C.
2.3. Campioni di tessuto
Il tessuto della corteccia orbitofrontale cerebrale post-mortem è stato ottenuto da donatori di cervello con diagnosi di AD e individui di controllo. I campioni congelati sono stati forniti dall'Institute of Neuropathology Brain Bank IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat, Spagna). Il consenso del soggetto è stato ottenuto secondo la Dichiarazione di Helsinki e l'approvazione è arrivata dal Comitato etico della ricerca dell'istituzione responsabile.
Per tutti i casi era disponibile il consenso informato scritto. I soggetti sono stati selezionati sulla base della diagnosi post mortem di AD in base alla patologia del groviglio neurofibrillare e alle placche A [48]. I casi di AD hanno mostrato un elevato cambiamento neuropatologico di AD (stadio V/VI di Braak e punteggio della placca neuritica da moderato a frequente). I partecipanti di controllo sono stati considerati quelli con/senza sintomi neurologici o un cambiamento neuropatologico AD di basso grado. Un totale di 24 campioni è stato classificato in AD e controlli, come presentato nella Tabella 2.
2.4. Purificazione del DNA e genotipizzazione dell'apolipoproteina E (APOE).
Il DNA genomico è stato estratto dal sangue periferico utilizzando il kit QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen, Hilden, Germania), secondo le istruzioni del produttore. I polimorfismi umani APOE C112R e R158C sono stati rilevati per identificare gli alleli APOE ε2, ε3 e ε4, utilizzando il kit di strumenti LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Basilea, Svizzera) seguendo le istruzioni del produttore.
2.5. Analisi delle proteine
Le concentrazioni plasmatiche e liquorali dei biomarcatori neuroinfiammatori (YKL-40 e CRP) sono state analizzate utilizzando i kit ELISA (Human Chitinase 3-like 1 Quantikine ELISA kit (DC3L10), R&S; Human CRP Quantikine ELISA kit (DCRP{ {5}}), R&S) secondo le istruzioni del produttore. Anche i livelli di proteina YKL -40 e GFAP nel cervello sono stati esaminati mediante Western blotting. Il tessuto della corteccia orbitofrontale cerebrale post-mortem è stato ottenuto da donatori di cervello con diagnosi di AD e individui di controllo.
In breve, campioni di corteccia orbitofrontale cerebrale umana sono stati incubati e omogeneizzati in tampone di lisi (tampone Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 contenente 2 mM EDTA, 0,2% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, proteasi, e cocktail di inibitori della fosfatasi; Roche, Basilea, Svizzera) e centrifugati per 10 min a 14,000 rpm a 4 ◦C. I surnatanti sono stati recuperati e conservati a -80°C. Il contenuto proteico è stato determinato utilizzando il metodo BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Quantità uguali di proteine (20 μg per YKL-40 e 5 μg per GFAP) sono state miscelate con tampone campione Laemmli integrato con -mercaptoetanolo, riscaldato a 95 ◦C per 5 minuti, risolto con il 10% di NuPAGE Bis-Tris Gels ( Thermo Fisher Scientific, MA, USA) e trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF) (Millipore, MA, USA).
Successivamente, le membrane sono state bloccate e incubate per una notte a 4°C con anticorpi primari: un anticorpo monoclonale di coniglio anti-YKL-40 ricombinante (ab255297, 1:500, Abcam) e un anticorpo monoclonale di topo anti-GFAP (G3893, 1 :0000, Sigma Aldrich). Le membrane sono state quindi incubate per 1 ora con gli appropriati anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (G-21234, 1:5000, Thermo Fisher Scientific, MA, USA; ab97023, 1:40000, Abcam).
Il caricamento delle proteine è stato monitorato utilizzando anticorpi monoclonali di topo coniugati con HRP contro -tubulina (ab40742, 1:5000, Abcam) per YKL-40 o contro -actina (A1978, Sigma Aldrich) per il rilevamento di GFAP. Gli immunocomplessi sono stati rivelati da un reagente di chemiluminescenza potenziato (ECL Clarity; Bio-Rad, CA, USA). La quantificazione densitometrica è stata effettuata con il software Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, USA). Le bande proteiche sono state normalizzate ai controlli di caricamento ed espresse come percentuale del gruppo di controllo
2.6. Analisi statistica
L'analisi statistica e i grafici sono stati eseguiti utilizzando il software Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, USA) e Prism (GraphPad Software versione 8.00, La Jolla, CA, USA). Dopo aver valutato la normalità della distribuzione, le differenze nei livelli di CSF e plasma YKL -40 e CRP tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test del rango Kruskal-Wallis non parametrico. Il valore p per i confronti a coppie viene visualizzato con la correzione di Bonferroni. È stato eseguito un modello descrittivo di regressione lineare multipla per tenere conto delle variabili confondenti (età, sesso e APOE ε4) nell'analisi dell'associazione YKL -40 del CSF.
Le interazioni delle variabili confondenti con la diagnosi clinica sono state escluse dal modello (significato per l'intero insieme di interazioni: p > 0.10). Il coefficiente di regressione viene visualizzato come "b". Le differenze nella distribuzione del sesso, nell'età dei partecipanti, nell'età di insorgenza e negli anni dall'insorgenza della malattia tra i gruppi sono state valutate con i test del chi quadrato di Pearson e ANOVA, ove appropriato.
Le associazioni tra biomarcatori e caratteristiche demografiche sono state esaminate con test di correlazione di Pearson, test t di Student e test U di Mann-Whitney, ove appropriato. È stato eseguito un trend test non parametrico (Jonckheere trend test) per valutare l'esistenza di un trend quando l'esposizione mostrava categorie ordinali. Le curve ROC sono state costruite dopo aver modellato la presenza o l'assenza di una determinata diagnosi clinica con un'analisi logistica di regressione.
I livelli di espressione Western blot di YKL{{0}} e GFAP sono stati normalizzati ai rispettivi controlli di caricamento (-tubulina e -actina) e confrontati con la media del rapporto di controllo con il test U non parametrico di Mann-Whitney. Nei grafici, i livelli di CSF e plasma YKL-40 e CRP sono mostrati come mediana e intervallo interquartile. L'espressione cerebrale di YKL-40 è mostrata come media ± errore standard della media (SEM). In tutti i casi, la significatività statistica è stata fissata a p <0,05.
Il meccanismo di Cistanche tratta il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson
Cistanche è un'erba che è stata tradizionalmente utilizzata nella medicina cinese per trattare una varietà di condizioni di salute, compresi i disturbi neurologici come il morbo di Alzheimer (AD) e il morbo di Parkinson (PD). Cistanche contiene diversi composti bioattivi, inclusi glicosidi feniletanoidi e glicosidi iridoidi, che hanno effetti antiossidanti, antinfiammatori e neuroprotettivi. Questi composti aiutano a proteggere le cellule neuronali dai danni causati dai radicali liberi e dai processi infiammatori, che si ritiene contribuiscano allo sviluppo e alla progressione di AD e PD.
Inoltre, Cistanche ha dimostrato di aumentare i livelli di alcuni neurotrasmettitori nel cervello, tra cui la dopamina e l'acetilcolina, che sono importanti per la normale funzione cerebrale. Aumentando i livelli di questi neurotrasmettitori, Cistanche può aiutare a migliorare la funzione cognitiva e ridurre i sintomi di AD e PD.
Nel complesso, i meccanismi di Cistanche nel trattamento di AD e PD coinvolgono i suoi effetti antiossidanti, antinfiammatori e neuroprotettivi, nonché la sua capacità di migliorare i livelli di neurotrasmettitori nel cervello.
continua...
Víctor Antonio Blanco-Palmero 1,2,3,† , Marcos Rubio-Fernández 1,2,†, Desireé Antequera 1,2 , Alberto Villarejo-Galende 1,2,3 , José Antonio Molina 1,2,3, Isidro Ferrer 1,4,5,6 , Fernando Bartolomé 1,2,* e Eva Carro 1,2,*
1 Network Center for Biomedical Research in Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 28031 Madrid, Spagna; victorb1989@gmail.com (VAB-P.); marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.); eeara@yahoo.es (DA); avgalende@yahoo.es (AV-G.); cvillaiza@telefonica.net (INCEPPATA); 8082ifa@gmail.com (SE)
2 Gruppo di Malattie Neurodegenerative, Hospital 12 de Octubre Research Institute (imas12), 28041 Madrid, Spagna
3 Neurology Service Hospital Universitario 12 de Octubre, 28041 Madrid, Spagna
4 Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, E08907 Barcellona, Spagna
5 Dipartimento di Patologia e Terapia Sperimentale, Università di Barcellona, E08900 Barcellona, Spagna 6 Istituto di Neuroscienze, Università di Barcellona, E08000 Barcellona, Spagna * Corrispondenza: fbartolome.imas12@h12o.es (FB); caroeva@h12o.es (CE); Tel.: plus 34-913908765 (FB & EC); Fax: più 34-913908544 (FB e CE)
