Influenza della simulazione in vitro della digestione umana sui contenuti fenolici e sulle attività biologiche degli estratti acquosi delle specie di cisto turco Parte 2

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Per riassumere

L'estratto acquoso di C.salvifolius ha mostrato una migliore attività inibitoria degli enzimi digestivi rispetto agli estratti di altre specie. Inoltre, i campioni IN di tutti gli estratti acquosi hanno rivelato attività inibitorie enzimatiche inferiori rispetto ai campioni ND.

2.4.Attività inibitoria degli AGE

Come presentato nella Tabella 4, l'attività inibitoria dell'AGE dipendente dalla concentrazione è stata osservata in tutti gli estratti acquosi. I campioni ND di CCA, CPA e CSA hanno mostrato una migliore attività inibitoria rispetto al composto di riferimento quercetina in entrambe le concentrazioni di 0,5 e 1 mg/mL. Tuttavia, solo l'estratto di C.saluifolius ha mostrato una migliore attività inibitoria rispetto alla quercetina tra i campioni IN degli estratti. I campioni biodisponibili di estratti acquosi hanno mostrato attività inibitorie dell'AGE inferiori rispetto ai campioni non digeriti. Secondo i risultati, il campione ND dell'estratto acquoso di C.salvifolius possedeva la più alta attività inibitoria dell'AGE. Tuttavia, il campione IN dell'estratto acquoso di C.monspeliensis ha mostrato il potenziale di inibizione dell'età più debole nelle concentrazioni testate.

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3. Discussione

I radicali liberi potrebbero attaccare proteine, lipidi o DNA per procurarsi un elettrone, causando vari problemi di salute. Per questo motivo è fondamentale riequilibrare il sistema antiossidante dell'organismo e i radicali liberi formati dall'ossidazione. In caso di deterioramento di questo equilibrio, sorge lo stress ossidativo [29]. Lo stress ossidativo è uno dei principali fattori che provocano vari disturbi cronici come cancro, diabete, malattie cardiovascolari, morbo di Alzheimer, ecc. Sebbene nel corpo umano siano presenti sistemi auto-antiossidanti per combattere ilossidativodanni ai tessuti e agli organi, questi sistemi di difesa possono perdere la loro efficienza a causa di diverse condizioni come consumo eccessivo di alcol, fumo, stress, uso cronico di droghe e radiazioni, ecc. [30]. Vari rapporti scientifici hanno indicato che i metaboliti vegetali secondari svolgono un ruolo significativo nella prevenzione dello stress ossidativo e dei suoi effetti nocivi [13,14,31]Anche se la biodisponibilità è un parametro importante che influenza la bioattività di questi composti, non è stata presa in considerazione in la maggior parte degli studi. Tuttavia, è noto che i metaboliti secondari sono soggetti a trasformazioni strutturali dovute a differenti condizioni di pH, attività enzimatica e temperatura corporea nel sistema gastrointestinale. Inoltre, le caratteristiche chimiche dei metaboliti secondari comemolecolarepeso, polarità e grado di legame alle macromolecole nella matrice vegetale sono anche fattori significativi che influenzano la loro biodisponibilità [13]. Di conseguenza, l'assorbimento dei composti o dei loro metaboliti nel flusso sanguigno una volta ingeriti è essenziale per esercitare i loro effetti fisiologici sistemici. I modelli di simulazione della digestione in vitro possono fornire prove per la valutazione delle possibili caratteristiche di biodisponibilità delle sostanze. Mentre la conferma negli studi sull'uomo è necessaria per rivendicare qualsiasi proprietà funzionale, i modelli di simulazione in vitro sono ampiamente utilizzati come alternative agli studi in vivo o agli studi sull'uomo, che sono spesso eticamente discutibili, dispendiosi in termini di risorse, costosi e dispendiosi in termini di tempo [32].

Cistanche può migliorare l'immunità

Diversi ricercatori hanno anche studiato il potenziale antiossidante degli estratti preparati da diversi organi delle specie di Cistus. Secondo l'indagine della letteratura, questo è il primo studio sulle specie di Cistus per quanto riguarda la biodisponibilità di sostanze fenoliche e il loro impatto sull'attività antiossidante utilizzando un modello di simulazione della digestione in vitro. Karas et al. [33] hanno suggerito che il 10 percento dei componenti polifenolici rimane non digerito nella matrice vegetale e il 90 percento di essi è sottoposto a digestione nella fase gastrica o intestinale (circa il 48 percento e il 52 percento, rispettivamente). Come accennato in precedenza, tutte le quantità fenoliche negli estratti acquosi sono state influenzate negativamente dalla procedura di simulazione della digestione umana in vitro. Pertanto, sono state rilevate perdite significative nel contenuto fenolico dei campioni biodisponibili di tutti gli estratti. Inoltre, le concentrazioni totali di proantocianidina dei campioni IN erano inferiori al limite di rilevabilità in tutti gli estratti acquosi. Vari studi hanno anche suggerito l'influenza negativa della procedura di digestione sui composti fenolici negli estratti vegetali e quindi sulle bioattività correlate. Ad esempio, abbiamo riportato il contenuto fenolico totale di Salvia virgata Jacq. è stato anche influenzato negativamente dalla procedura di digestione nel nostro studio precedente. Inoltre, le quantità dei principali metaboliti dell'estratto, cioè la rutina e l'acido rosmarinico, tendevano a diminuire [13]. Al contrario, diversi studi hanno riportato risultati contraddittori. Nello studio di Celeb et al. [34], hanno osservato l'incremento delle quantità totali di acido fenolico, flavonoide e fenolico nei campioni biodisponibili di estratto metanolico di Hypericum perfoliatum L. Infatti, i principali metaboliti, quercitrina, acido clorogenico e acido gallico, avevano rapporti di bioaccessibilità superiori a 100 per cento . Questi studi hanno dimostrato che gli effetti della procedura di digestione possono variare a seconda dei materiali vegetali. Per chiarire queste differenze è fondamentale considerare il meccanismo d'azione del sistema digestivo sulle sostanze fenoliche. Serra et al. [35] hanno suggerito che i composti fenolici si trovano principalmente nei glicosidi, nei polimeri e nelle forme di estere nella matrice vegetale e vengono idrolizzati nel sistema digestivo prima dell'assorbimento. Vari fattori possono influenzare le trasformazioni strutturali dei composti fenolici nel tratto gastrointestinale. Ad esempio, i composti con pesi molecolari più elevati, come le proantocianidine o le procianidine, devono essere idrolizzati prima dell'assorbimento nell'intestino. Anche la struttura della matrice vegetale è un fattore di primo piano nella biodisponibilità dei fenoli; i composti fenolici possono legarsi alle macromolecole nella matrice vegetale, come fibre, proteine ​​e molecole lipidiche. Pertanto, solo i componenti fenolici liberati dalla matrice possono diventare assorbibili dal tratto gastrointestinale. Inoltre, diversi valori di pH e azioni enzimatiche del microbiota intestinale sono tra gli altri fattori cruciali che influenzano la trasformazione nella struttura chimica dei composti fenolici [36]. Alla luce di questi dati si può ipotizzare che risultati differenti ottenuti da analoghi tipi di studi sperimentali possano essere dovuti alla complessità del sistema di digestione e alla composizione della matrice vegetale. Come presentato nella Tabella 3, i campioni biodisponibili di estratti di Cistus hanno mostrato un'attività antiossidante più debole rispetto alle controparti non digerite e post-gastriche a causa del loro contenuto fenolico inferiore.

Inoltre, entrambi gli estratti di C. saluifolius hanno mostrato una migliore attività antiossidante nei test DPPH, CUPRAC, FRAP e TOAC rispetto ad altre specie. Inoltre, entrambi gli estratti di C.paroiflorus hanno mostrato una maggiore attività di scavenging dei radicali DMPD rispetto agli estratti di altre specie. Come indicato nella Tabella 1, il contenuto totale di fenoli, flavonoidi e acido fenolico di C. salviifolius era maggiore rispetto agli altri campioni. Pertanto, il maggiore potenziale antiossidante degli estratti di C. saloiifolius può essere correlato al suo contenuto fenolico.

Inoltre, la riduzione dei potenziali antiossidanti, delle attività inibitorie sugli enzimi correlati ai carboidrati e degli AGE dei campioni biodisponibili possono essere correlati al declino dei glicosidi flavonoidi marcatori. Tuttavia, gli estratti di Cisto contenevano anche altre sostanze fenoliche, come indicato nella Figura 1. Pertanto, è necessaria un'analisi cromatografica dettagliata degli estratti per monitorare l'influenza della digestione sull'attività biologica.

Il potenziale inibitorio degli estratti vegetali sugli enzimi digestivi ha recentemente attirato maggiore attenzione a causa della preoccupazione per la sicurezza degli inibitori sintetici. Pertanto, l'effetto inibitorio degli estratti vegetali è stato determinato in diversi studi, e questo effetto è stato generalmente associato a sostanze fenoliche come flavonoidi, acidi fenolici, proantocianidine, ecc. Sun et al. [37] hanno suggerito che i composti polifenolici mostrano i loro effetti inibitori legandosi con gli enzimi sopra menzionati con l'aiuto di forze idrofobiche e legami non covalenti. Pertanto, l'inibizione dell'attività degli enzimi -amilasi e -glucosidasi da parte dei polifenoli è correlata alle loro strutture molecolari. Sebbene questo meccanismo di interazione sia stato studiato utilizzando diverse tecniche come la cinetica di inibizione, l'attenuazione della fluorescenza di docking molecolare, ecc., non è stata ancora acquisita alcuna conclusione certa [38]. Tuttavia, numerosi studi hanno riportato che le inibizioni degli enzimi digestivi degli estratti vegetali sono direttamente correlate al loro contenuto fenolico. In precedenza sono stati riportati anche studi simili sulle attività inibitorie degli enzimi delle specie Cistus. Sayah et al. [39] hanno studiato le attività inibitorie della -amilasi e della a-glucosidasi dell'80 percento di estratti metanolici e acquosi di C. monspeliensis e C. saluifolius. I loro risultati erano in accordo con il presente studio, rivelando che l'estratto acquoso di C. salvijfolius ha dimostrato una maggiore -glucosidasi （IC50 ug/mL∶0.95±0.14） e o -amilasi（IC50 ug/mL∶217,1±0,15）attività inibitoria rispetto all'estratto acquoso di C.monspeliensis （IC50 ug/mL∶14,58±1,26） e （ICsn ug/mL:886,10±0,10), rispettivamente. I tassi inibitori di entrambi gli estratti acquosi su questi enzimi erano superiori al composto di riferimento acarbosio (ICso ug/mL: 18,01±2.00) Analogamente al nostro studio, hanno trovato una correlazione con i tassi inibitori dell'enzima e il totale quantità fenoliche e flavonoidi. Sia il contenuto fenolico totale che quello totale di flavonoidi dell'estratto acquoso di C. salvijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE e 140.00 ± 1,15 RE, rispettivamente) erano superiori all'estratto acquoso di C.monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE e 78.00±1,15 RE rispettivamente). Orhan et al. [40] hanno anche studiato i potenziali inibitori degli enzimi digestivi dell'80% di estratti acquosi ed etanolici dalle foglie di C.laurifolius. Secondo i loro risultati, l'80% di estratto etanolico (71,7% ±0,6) ha mostrato una forte attività inibitoria dell'amilasi rispetto all'estratto acquoso (39,3% ±2,2) a una concentrazione di 1 mg/mL. Hanno suggerito che i composti fenolici, in particolare i flavonoidi, influenzino direttamente la secrezione di insulina prevenendo l'apoptosi delle cellule beta e sostenendo l'attività antidiabetica. Questa ipotesi, correlata ai nostri risultati, indica che il campione ND di estratti acquosi di C. salviifolius ha esercitato il più alto contenuto totale di flavonoidi e fenolici e le maggiori attività inibitorie di o-amilasi e o-glucosidasi. Come indicato nella tabella 4, l'estratto acquoso di C. salviifolius ha mostrato migliori attività inibitorie sugli enzimi digestivi rispetto agli altri estratti.

Inoltre, i campioni IN degli estratti acquosi contenevano quantità fenoliche e flavonoidi inferiori rispetto ai campioni ND e quindi hanno rivelato attività inibitorie enzimatiche inferiori nel presente lavoro. Sebbene il contenuto fenolico degli estratti sia stato influenzato negativamente dalla procedura di digestione, hanno comunque mostrato una significativa attività inibitoria dell'enzima digestivo. In diversi studi, i glicosidi flavonoidi sono stati segnalati come i principali metaboliti degli estratti vegetali con fortea-amilasie potenziali inibitori della -glucosidasi [41-43]Sebbene il meccanismo inibitorio dei composti fenolici sugli enzimi digestivi non sia stato ancora rivelato, sono stati condotti studi di relazione struttura-attività su alcuni componenti fenolici come flavonoidi, acidi fenolici, proantocianidine e tannini Studi sulla relazione struttura-attività sui flavonoidi hanno mostrato che il doppio legame C2=C3 dell'anello C aumenta il potenziale di inibizione dell'enzima digestivo di tali composti. Poiché questo legame eleva la densità elettronica, la forza dell'interazione tra il flavonoide e l'enzima è aumentata [44]. Inoltre, i gruppi idrossilici su C-5 e C-7 facilitano il potenziale inibitorio dell'o-amilasi dei flavonoidi. È stato anche suggerito che l'idrossilazione dello scheletro dei flavonoidi influenzi positivamente la loro a-amilasi e-enzima glucosidasipotenziali inibitori[45]. Come indicato in precedenza, tutti i flavonoidi marcatori nel presente studio erano glicosidi flavonolici con questi requisiti strutturali sopra descritti. Tuttavia, dopo la procedura di digestione in vitro, le loro attività correlate sono diminuite significativamente nei campioni biodisponibili degli estratti acquosi.

In generale, il potenziale inibitorio degli estratti vegetali sugli AGE è correlato a diversi fattori, ad esempio il loro contenuto fenolico, i potenziali antiossidanti, le capacità di chelazione dei metalli, le interazioni proteiche e le attività di blocco dei recettori AGE[13]. Come presentato nella Tabella 4, i campioni biodisponibili degli estratti acquosi hanno mostrato attività inibitorie dell'AGE inferiori rispetto ai campioni ND poiché la procedura di digestione in vitro ha influenzato negativamente il contenuto fenolico degli estratti. Secondo i risultati dello studio attuale, il campione ND dell'estratto acquoso di C.salvifolius possedeva la più alta attività inibitoria dell'AGE così come i contenuti fenolici e flavonoidi totali. In confronto, il campione IN dell'estratto acquoso di C.monspeliensis ha mostrato il potenziale di inibizione dell'età più debole, che può essere attribuito al suo contenuto totale di flavonoidi e fenolici più basso. Poiché i flavonoidi hanno un'ampia distribuzione negli estratti vegetali, nella frutta, nella verdura e nelle bevande, numerosi studi si sono intensificati sul potenziale di inibizione dei flavonoidi sulle formazioni di AGE. Gli stessi flavonoidi assegnati come marcatori fenolici in questo studio sono stati riportati anche come composti marcatori in altri studi[46-48].

Simile all'inibizione dell'enzima digestivo, le attività inibitorie dell'AGE dei flavonoidi sono state stimolate dal doppio legame C2=C3 e dall'idrossilazione degli anelli A e C. Tuttavia, l'attaccamento dello zucchero allo scheletro dei flavonoidi porta a una diminuzione dell'attività inibitoria [49]. Cervantes-Lauren et al. [50] hanno suggerito che il flavone-3-dei glicosidi possedesse un maggiore potenziale di inibizione dell'età rispetto agli altri glicosidi flavonoidi. Questa ipotesi può essere una spiegazione per la ridotta inibizione dell'età nei campioni biodisponibili. Ad esempio, la quercitrina e l'iperoside non sono stati rilevati nei campioni biodisponibili dell'estratto acquoso di C.monspeliensis, motivo della minore attività dei campioni IN di C.monspeliensis rispetto agli estratti di altre specie. Anche se la quercitrina non è stata rilevata nell'estratto acquoso di C. saloifolius, quantità significativamente più elevate di iperoside e salidroside possono essere la causa della sua elevata attività di inibizione dell'età. In generale, è stata osservata una correlazione positiva tra il contenuto di flavonoidi marcatori dei campioni e il loro potenziale inibitorio sugli AGE.

4. Materiale e metodi

4.1.Prodotti chimici

Tutti i riferimenti, gli enzimi e le sostanze chimiche impiegati negli esperimenti sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Negli esperimenti sono stati utilizzati materiali di qualità analitica.

4.2.Campioni di piante

Parti aeree di C.creticus e C.saloifolius sono state raccolte dal campus dell'Università Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) durante l'ultima settimana di aprile 2018. Parti aeree di C.mon-speliensis e C.paroiflorus sono state raccolte vicino ad AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir nella seconda settimana di maggio 2018. Parti aeree di C. laurifolius sono state raccolte dalla strada Kemer-Doganhisar, Konya, nella prima settimana di giugno 2018. Il Prof. Dr. Erdem Yesilada ha autenticato materiali vegetali. I campioni di voucher per C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis (YEF18015), C.paroifforus (YEF18016) e C.salvifolus (YEF18014) sono stati conservati presso l'Erbario del Dipartimento di Farmacognosia, Facoltà di Farmacia, Università Yeditepe, Istanbul, Turchia.

4.3.Procedura di estrazione

È stata scelta l'estrazione acquosa poiché è comunemente usata come tecnica di preparazione nella medicina tradizionale. Le parti aeree grossolanamente essiccate all'aria e in polvere diCistanchele specie (100 g) sono state estratte con acqua distillata calda (80 gradi, 1,5 l) utilizzando un dispositivo di agitazione per 15 minuti. Quindi, gli estratti acquosi sono stati filtrati attraverso una carta da filtro ed evaporati a secchezza a pressione ridotta. Dopo che la procedura di liofilizzazione è stata completata, gli estratti sono stati sciolti in acqua distillata per l'ulteriore elaborazione (campione non digerito: ND) (la resa degli estratti: 13,04 percento per C.creticus, 15,7 percento per C.laurifolius, 12,8 percento per C.monspeliensis ,14,94 per cento per C.parviflorus, 14,74 per cento per C.salvifolius).

4.4. Metodo di simulazione della digestione umana in vitro

Il modello di simulazione della digestione umana è stato applicato ai campioni di Cistus in vitro, seguendo il metodo descritto in precedenza da Celeb et al.[34]. Innanzitutto, 1 g di NaCl e 1,6 g di pepsina sono stati sciolti in 500 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione di fluido gastrico simulata (SGF). Successivamente, il pH della soluzione di SGF è stato portato a 2 con HCl(5 M); 17,5 mL di questa soluzione sono stati miscelati con 2,5 mL di campioni vegetali e questa miscela è stata situata nel bagnomaria con agitazione a 37 gradi per 2 ore fino a imitare i movimenti peristaltici del sistema digestivo. Dopo 2 ore, i campioni sono stati posti in un bagno di ghiaccio per inattivare le reazioni enzimatiche; 2 mL dei campioni sono stati messi da parte come campione (P) "post-gastrico" per ulteriori esperimenti. Una membrana di dialisi cellulosica caricata con una quantità adeguata di NaHCO3(1 M, pH7) è stata posizionata nelle soluzioni di campioni freddi; quindi, l'assorbimento gastrointestinale è stato imitato. Quindi, 4,5 mL di soluzione di acidi biliari/pancreatina sono stati combinati con le soluzioni e la miscela è stata incubata per altre 2 ore a 37 gradi. Infine, il fluido all'interno della membrana di dialisi è stato acquisito come campione "biodisponibile" (IN). Al termine della procedura, tutti i campioni sono stati conservati a -20 gradi per ulteriori esperimenti. 4.5. Stima in vitro del profilo fenolico

4.5.1. Saggio del contenuto fenolico totale

La determinazione spettrofotometrica del contenuto fenolico totale dei campioni è stata condotta in un 96-modello di piastra a pozzetti secondo il metodo descritto in precedenza da Barak et al.【32】;75 ul di NagCO3（20% in H2O） sono stati aggiunti a 20 μL di campione e soluzioni di riferimento appena preparati. Quindi, 100 μL di reagente Folin-Ciocalteu sono stati combinati con la miscela. Dopo un periodo di incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente al buio, l'assorbanza è stata misurata a 690 nm. L'acido gallico è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per stabilire una curva di calibrazione e il contenuto fenolico totale è stato espresso come equivalenti di acido gallico (GAE).

4.5.2.Saggio del contenuto totale di flavonoidi

La determinazione spettrofotometrica del contenuto totale di flavonoidi dei campioni è stata gestita in un 96- modello di piastra a pozzetti in conformità con il metodo spiegato in precedenza da Bardakci et al.[51]; 150 ul di etanolo al 75 percento, 10 ul di cloruro di alluminio , e 10 μL di acetato di sodio triidrato 1M sono stati combinati con 50 μL di campione e soluzioni di riferimento, separatamente. Quindi, queste miscele sono state incubate a temperatura di camera oscura per 30 minuti. Dopo il periodo di incubazione, l'assorbanza è stata calcolata a 405 nm.Quercetinaè stato impiegato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per stabilire una curva di calibrazione e il contenuto totale di flavonoidi è stato rappresentato come quercetina equivalenti (QE). 4.5.3. Saggio del contenuto totale di acido fenolico

Il contenuto di acido fenolico totale dei campioni è stato misurato spettrofotometricamente seguendo la procedura precedentemente riportata da Barak et al. [52]. In primo luogo, quantità adeguate di nitrito di sodio e molibdato di sodio sono state sciolte in acqua distillata per ottenere il reagente Arnow. Quindi, 1 ml dei campioni è stato combinato con 1 ml di reagente Arnow, 1 ml di 0.1 M HCl e 1 ml di 1 M NaOH, separatamente. Successivamente, il volume della miscela è stato regolato a 10 mL con acqua distillata e l'assorbanza è stata letta immediatamente a 490 nm. L'acido caffeico è stato impiegato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per ottenere una curva di calibrazione e il contenuto totale di acido fenolico è stato fornito come equivalenti di acido caffeico (CAE).

4.5.4. Saggio del contenuto totale di proantocianidina

La determinazione spettrofotometrica del contenuto totale di proantocianidina dei campioni è stata condotta in un 96-modello di piastra a pozzetti seguendo il metodo di Barak et al. [1]In breve, 25 μL delle soluzioni del campione sono stati miscelati con 150 μL di vanillina al 4% e 75 μL di soluzioni di HCl (32%) rispettivamente. Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura di camera oscura, l'assorbanza è stata regolata a 492 nm. L'idrato di catechina è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per ottenere una curva di calibrazione. Il metanolo è stato impiegato come soluzione di controllo. Il contenuto totale di proantocianidine dei campioni è stato dichiarato come equivalenti di catechina (CE).

4.6. Saggi di attività di scavenging dei radicali liberi 4.6.1. Saggio di attività di scavenging dei radicali DPPH

L'attività di scavenging del radicale DPPH dei campioni è stata determinata in un modello di piastra a pozzetti 96- seguendo il metodo modificato da Celeb et al.[53]. All'inizio, 150 uM di soluzione di DPPH erano preparati al momento. Quindi, 200 μL di soluzione DPPH sono stati miscelati con 25 μL di soluzioni campione. Quindi, questa miscela è stata incubata a temperatura di camera oscura per 50 minuti. L'assorbanza è stata calcolata a 540 nm. L'idrossitoluene butilato (BHT) è stato impiegato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni. Il metanolo è stato utilizzato come soluzione di controllo. L'attività dei campioni è stata presentata come EC50, corrispondente alla concentrazione che mostra un'attività del 50%.

4.6.2. Saggio di attività di scavenging radicale DMPD

DMPD plus (N, N-dimetil-p-fenilendiammina) attività di scavenging dei campioni è stata effettuata in un modello di piastra a pozzetti 96- secondo il metodo descritto in precedenza da Inan et al. [13]. In primo luogo, 10{{10}} mM DMPD più soluzione, 0,05 M FeCl; La soluzione 6H2O e il tampone acetato 0,01 M sono stati preparati di fresco. Quindi, 1 ml di soluzione DMPD, 100 ml di tampone acetato e 0,2 ml di FeCl; La soluzione 6H2O è stata miscelata e successivamente 15 μL di soluzioni campione sono stati combinati con 210 μL di questa miscela. Dopo il periodo di incubazione a temperatura ambiente per 50 minuti, l'assorbanza è stata misurata a 492 nm. Trolox è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per ottenere una curva di calibrazione. Le concentrazioni delle soluzioni campione erano 1 mg/mL. Le attività di scavenging radicale DMPD dei campioni sono state dichiarate come equivalenti di Trolox (TE). 4.7. Saggi di attività di riduzione dei metalli

4.7.1. Saggio di potere antiossidante riducente ferrico (FRAP)

La determinazione dell'attività FRAP dei campioni è stata effettuata in uno stampo a 96 pozzetti seguendo la procedura riportata in precedenza da Bardakci et al.[54]. All'inizio dell'esperimento, il reagente FRAP è stato formato miscelando tampone acetato, ferrico-tripiridiltriazina e FeCl; Soluzioni 6H2O. Successivamente, il reagente FRAP è stato inserito nel forno a 37 gradi per 30min. Quindi, 10 ul delle soluzioni del campione sono stati combinati con 30 ul di acqua distillata e 260 μl di reagente FRAP, rispettivamente. Dopo un tempo di incubazione a 37 gradi per 30 minuti, l'assorbanza è stata regolata a 593 nm. È stata costruita una curva standard utilizzando diverse molarità della soluzione di solfato ferroso (0,25-2 mM) per valutare i risultati. Il BHT è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni. Le attività FRAP dei campioni sono state presentate come mM FeSO4 in 1 g di estratto secco.

4.7.2. Saggio di capacità antiossidante riducente il rame (CUPRAC)

L'attività CUPRAC dei campioni è stata determinata in un 96-modello di piastra a pozzetti seguendo il metodo modificato da Celeb et al. 【31】; 85 μL di CuSO4 （10 mM）, soluzioni di neocupraina e acetato di ammonio e 51 μL di acqua distillata sono stati aggiunti a 43 μL di soluzioni campione, separatamente. Dopo un periodo di incubazione (20 min) a 50 gradi a bagnomaria, l'assorbanza è stata misurata a 450 nm. L'acido ascorbico è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per acquisire una curva di calibrazione. Le attività CUPRAC dei campioni sono state presentate come equivalenti di acido ascorbico (AAE). 4.8. Saggio di attività antiossidante totale (TOAC) La determinazione dell'attività antiossidante totale dei campioni è stata eseguita in un modello di piastra a pozzetti 96- seguendo la procedura di Celeb et al. [55]. Inizialmente, una certa quantità di fosfato di sodio monobasico, molibdato di ammonio tetraidrato e acido solforico è stata miscelata per acquisire la soluzione di TOAC. Quindi, 300 μL di soluzione TOAC sono stati aggiunti a 30 μL di soluzioni campione. Dopo il periodo di incubazione a 95 gradi a bagnomaria per 90 minuti, l'assorbanza è stata determinata a 690 nm. L'acido ascorbico è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni per acquisire una curva di calibrazione. Le attività TOAC dei campioni sono state rappresentate come equivalenti di acido ascorbico (AAE). 4.9.Stima dell'Indice di Biodisponibilità

L'indice di biodisponibilità (BAvI) è stato calcolato secondo l'equazione teorica descritta da Inan et al.[13]: BAVI=CIN/CND L'"indice di biodisponibilità" (BAvI) è stato descritto come il rapporto tra il numero di fenolici nel campione biodisponibile (IN) a quello nel campione non digerito (ND). 4.10. Quantificazione dei flavonoidi marcatori mediante HPTLC

La determinazione quantitativa delle concentrazioni di salidroside, iperoside e quercitrina in tutti i campioni di simulazione (ND, PG, IN) degli estratti acquosi delle specie Cistus è stata effettuata mediante cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Svizzera) seguendo il metodo validato da Guzelmeric et al.[16]. Iperoside, salidroside e quercitrina sono stati preparati in concentrazioni di 25,50 e 100 ug/mL e le concentrazioni delle soluzioni campione appena preparate sono state regolate a 10 mg/mL. Queste soluzioni sono state applicate a piastre di gel di silice con retro in vetro in fase normale (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Germania) con determinati volumi (1-5 μL di soluzioni standard e 5 μL di soluzioni campione) utilizzando siringhe da 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Svizzera）. La procedura di applicazione è stata eseguita con l'applicatore di campioni Linomat 5. Il processo di sviluppo è stato eseguito nella camera di sviluppo automatizzata (ADC 2) e acetato di etile: diclorometano. acido acetico. acido formico: acqua (10:25:10 :10:10:10me) è stata selezionata come fase mobile. Quindi, le piastre sono state derivatizzate con Natural Product Reagent (NPR)(1 g difenilboricacid 2-aminoetilesterina 200 ml di acetato di etile) nel dispositivo di immersione (CAMAG). Mentreiperosidee la quercitrina sono state analizzate spettrofotometricamente a 260 nm, la quantità di salidroside è stata misurata a 330 nm mediante uno scanner UV. I valori Rf degli standard sono stati determinati come iperoside （≈{6}}.35）, quercitrina （≈{9}}.45）, tiliroside （≈0,65）. I coefficienti di correlazione （r2） sono risultati ×0,98 per la quantificazione dei flavonoidi marcatori.

4.11. Attività inibitoria sugli enzimi correlati al diabete

4.11.1. -Attività inibitoria della glucosidasi

Le attività inibitorie della -glucosidasi dei campioni non digeriti e biodisponibili ottenuti dagli estratti acquosi delle specie Cistus sono state esaminate seguendo il metodo spiegato in precedenza da Balan et al. [56]. In primo luogo, quantità adeguate di fosfato monosodico e fosfato disodico sono state miscelate con l'approvvigionamento di tampone fosfato 100mM (pH7). o--l'enzima glucosidasi è stato sciolto in tampone fosfato per ottenere la soluzione di a-glucosidasi (0.2U/mL). Quindi 170 μL di tampone fosfato, 20 μL della soluzione di -glucosidasi e 20 μL di soluzioni campione sono stati combinati e incubati in un forno a 37 gradi per 15 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti alla miscela 20 μL di soluzione 2,5 mM di p-nitrofenil{19}}D-glucopiranoside in tampone fosfato di potassio 100 mM (pH7,0) e un altro periodo di incubazione è stato eseguito a 37 laurea per 15 min. Quindi, 80 μL di soluzione di carbonato di sodio 0,2 M sono stati aggiunti alla miscela per terminare la reazione. L'assorbanza è stata misurata a 405 nm. Come riferimento è stata utilizzata una soluzione di quercetina a diverse concentrazioni. I risultati sono stati stimati come percentuale di attività inibitoria in concentrazioni di 1 mg/mL e 0,5 mg/mL di campioni ND e IN degli estratti acquosi delle specie Cistus. 4.11.2. -Attività inibitoria dell'amilasi L'attività inibitoria dell'o-amilasi di campioni non digeriti e biodisponibili ottenuti dagli estratti acquosi di specie Cistus è stata determinata seguendo la procedura descritta in precedenza da Balan et al.[56]. La determinazione spettrofotometrica delle attività inibitorie dell'a-amilasi dei campioni è stata eseguita utilizzando il reagente DNS (3,5-acido dinitrosalicilico). Come indicato nel metodo, il maltosio si forma dalla conversione dell'amido e il colore giallo del DNS alcalino viene trasformato nel colore rosso-arancione a causa del maltosio prodotto dall'amido. Pertanto, è stata preparata una soluzione di DNS 96 mM dalla miscela di soluzione di tartrato di sodio e potassio (sciolta in 2 M NaOH) e una certa quantità di DNS (sciolto in acqua distillata). Quindi, è stato preparato un tampone di fosfato di sodio 20 mM con NaCl 6,7 mM (cofattore dell'enzima u-amilasi) a 20 gradi (pH: 6,9). l'enzima a-amilasi (1U/mL) e l'amido (10 mg/mL) sono stati disciolti in questo tampone. Successivamente, 50 μL di tampone fosfato di sodio e 10 μL di soluzione enzimatica a-amilasi sono stati miscelati con 20 μL delle soluzioni campione. Questa miscela è stata incubata a 37 gradi per 45 minuti. Dopo il periodo di incubazione, alla miscela sono stati aggiunti 20 μL di soluzione di amido. Un altro periodo di incubazione è stato avviato a 37 gradi per 45 min. La stessa procedura è stata applicata ai campioni senza l'aggiunta della soluzione dell'enzima w-amilasi denominata "campione di fondo". Il gruppo di controllo è stato studiato con la stessa procedura in assenza di soluzioni campione. L'assorbanza è stata misurata a 540 nm. L'acarbosio è stato utilizzato come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni. I risultati sono stati presentati come percentuale dell'attività inibitoria in concentrazioni di 1 mg/mL e 0,5 mg/mL di campioni ND e IN da estratti acquosi di specie Cistus. 4.11.3. Attività inibitoria AGE L'attività inibitoria AGE di campioni non digeriti e biodisponibili da estratti acquosi di specie Cistus è stata determinata seguendo il metodo descritto da Starow-icz et al. [57]. Prima di qualsiasi processo, le concentrazioni di 1 mg/mL e 0,5 mg/mL di campioni ND e IN sono state preparate al momento. Quindi, 1 mL di una concentrazione di 10 mg/mL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) è stato aggiunto a 1 mL di soluzioni campione di ND e IN. I campioni di controllo sono stati preparati senza aggiungere soluzioni campione ND e IN e i campioni in bianco sono stati preparati senza aggiungere 0,5 M di glucosio. Quindi, tutti i campioni preparati sono stati incubati per 40 ore in un bagno d'acqua agitato a 55 gradi. Al termine del periodo di incubazione, il lettore di micropiastre multimodale Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX è stato utilizzato nell'intervallo di eccitazione 370 nm/emissione di 440 nm per calcolare l'intensità della fluorescenza. La quercetina è stata utilizzata come soluzione di riferimento a diverse concentrazioni.

4.12.Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti indipendentemente tre volte diverse. Il programma software GraphPad Prism (versione 6.1) è stato utilizzato per determinare la distribuzione parametrica o non parametrica dei dati. La sezione di analisi dei confronti multipli di ANOVA Tukey unidirezionale è stata utilizzata per valutare i saggi TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH e DMPD. D'altra parte, i risultati degli esperimenti di inibizione di o-amilasi, -glucosidasi e AGE sono stati esaminati dall'analisi di confronti multipli di ANOVA Sidak a due vie. Risultati significativi sono stati mostrati con p<0.05. 5.="">

Nel presente studio, gli estratti acquosi di tutte le specie di Cistus registrate nella flora turca sono stati studiati per i loro profili fenolici e potenziali antiossidanti e antidiabetici in vitro. Poiché il decotto o l'infusione è la forma comune nelle medicine tradizionali, l'utilizzo di estratti acquosi per la valutazione dell'attività negli studi sperimentali è particolarmente importante. D'altra parte, i costituenti idrofili dell'estratto acquoso sono soggetti a una serie di trasformazioni metaboliche nel sistema gastrointestinale una volta ingeriti. Pertanto, per una corretta valutazione dell'attività delle formulazioni tradizionali, dovrebbero essere studiate anche le attività dei metaboliti biodisponibili.

Questo è il primo studio che esamina le conseguenze del metodo di simulazione della digestione umana in vitro sulle specie di Cistus turchi. Inoltre, in questo studio è stato studiato per la prima volta il potenziale di inibizione delle specie di Cistus turche sugli AGE. Inoltre, sono stati assegnati marcatori a salidroside, iperoside e quercitrinaflavonoidi, e le alterazioni delle loro concentrazioni sono state monitorate nella procedura di digestione in vitro. Sebbene il contenuto fenolico e le attività antidiabetiche e antiossidanti degli estratti siano stati influenzati negativamente dalle procedure di digestione gastrointestinale, hanno comunque mostrato una bioattività significativa. Secondo i risultati, l'estratto di C.saloifolius è stato rilevato come la pianta più potente in termini di contenuto fenolico e attività antiossidante e antidiabetica. In conclusione, le parti aeree delle specie Cistus turche hanno un ricco contenuto fenolico e potenziali attività antiossidanti e antidiabetiche. Sebbene il metodo di simulazione della digestione in vitro sia stato impiegato per valutare la biodisponibilità, potrebbe non imitare completamente le vie metaboliche che si verificano nell'organismo. Pertanto, sono necessari ulteriori studi in vivo e clinici per valutare in dettaglio la biodisponibilità dei composti fenolici e il loro contributo agli effetti farmacologici riportati.

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 5322