La naringina e l'esperidina contrastano l'epatotossicità indotta da diclofenac nei ratti Wistar maschi attraverso le loro attività antiossidanti, antinfiammatorie e antiapoptotiche Parte 1

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1. Introduzione

I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) hanno vari effetti collaterali [1]. Il diclofenac, come uno di questa categoria di farmaci, è un derivato dell'acido fenilacetico che è stato a lungo utilizzato come analgesico e antinfiammatorio per il trattamento di determinate condizioni [2]. Nel suo meccanismo d'azione, il diclofenac inibisce la ciclossigenasi-(COX- )2 enzimi con una potenza maggiore di quella che agisce sulla COX-1 [3]. Sebbene il diclofenac abbia potenti effetti terapeutici, il suo uso prolungato è associato a gravi effetti avversi dose-dipendenti [3]. Un aumento inossidativostress e soppressione dei sistemi di difesa antiossidanti sono stati riportati da varie pubblicazioni che erano implicate nell'induzione della tossicità e degli effetti collaterali del farmaco [4,5]. L'uso di antiossidanti come i flavonoidi degli agrumi in combinazione con il diclofenac può contrastare lo stress ossidativo indotto dal diclofenac e quindi può prevenire gli effetti collaterali e la tossicità del farmaco.

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La naringina responsabile del sapore aspro e amaro dei frutti della specie Citrus ha proprietà farmacologiche e terapeutiche ad ampio spettro come ipolipemizzanti, antinfiammatorie, scavenging dei radicali liberi, antiossidanti, antiiperlipidemiche,

proprietà antiapoptotiche e antiaterogeniche [6,7. L'esperidina è un altro flavonoide isolato dalle specie Citrus che aveva diverse proprietà biologiche, in particolare antiossidanti e antinfiammatorie [8]. È stato riportato che l'esperidina ha migliorato il danno al tessuto epatico indotto dal citocromo osservato daistopatologicoesame [9]. È stato anche rivelato che l'esperidina era efficace nella soppressioneinfiammazionee sintomi allergici e nel trattamento della rinite allergica[10]. Pertanto, questo studio è stato condotto per valutare i possibili effetti preventivi di naringina ed esperidina sulla tossicità epatica indotta da diclofenac e per esplorare i ruoli della modulazione dell'infiammazione, dello stress ossidativo e dell'apoptosi nell'azione preventiva.

2. Materiali e metodi

2.1. Prodotti chimici e kit. Il diclofenac sodico è stato ottenuto dalla El-Nasr Pharmaceutical Chemical Company, in Egitto.

Naringin ed esperidina sono stati prodotti dalla Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, USA). Tutti gli altri prodotti chimici utilizzati sono di grado analitico e sono stati ottenuti da aziende chimiche locali. I kit di alanina transaminasi (ALT) e aspartato trans-aminasi (AST) sono stati ottenuti da Spinreact, Ctra Sta Coloma, 7.17176 St., Esteve de Bas, Girona, Spagna. La lattato deidrogenasi (LDH) e la y-glutamiltransferasi (GGT) sono state ottenute da Spectrum, Egyptian Company for Biotechnology, Obour City Industrial Area, Cairo, Egypt. Il kit di fosfatasi alcalina (ALP) è stato ottenuto da Biodiagnostic, 29 Tahrir St., Dokki, Giza, Egitto. I kit di albumina e bilirubina sono stati ottenuti da Diamond,24 El Mon-matzah St., Heliopolis, Cairo, Egitto.

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2.2.Animali sperimentali. Ratti maschi adulti di ceppo Wistar del peso di 100-130g (9-1l settimane) sono stati utilizzati come animali da esperimento nel presente lavoro.

Sono stati ottenuti dall'Istituto di ricerca sull'oftalmologia della casa di animali, Giza, in Egitto. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie ben aerate a 12 ore giornaliere di cicli luce-buio e temperatura tra 20 e 25 gradi. I ratti sono stati integrati quotidianamente con una dieta pellettata standard e acqua ad libitum. Gli animali sono stati mantenuti per due settimane sotto osservazione prima di iniziare l'esperimento per l'adattamento ed escludere qualsiasi infezione intercorrente. Tutte le metodologie animali sono conformi alle linee guida e alle istruzioni del Comitato Etico degli Animali Sperimentali della Facoltà di Scienze per la Cura e l'Uso degli Animali, Università Beni Suef, Egitto. Il numero di approvazione etica è BSU/FS/2015/15. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre la sofferenza e l'angoscia degli animali.

2.3. Raggruppamento di animali. Trenta ratti Wistar maschi sono stati utilizzati in questo esperimento e sono stati assegnati in cinque gruppi (Figura 1).

I ratti del gruppo 1 (normale) hanno ricevuto il volume equivalente di soluzione salina (il veicolo in cui è stato disciolto il diclofenac) mediante iniezione intraperitoneale e hanno anche ricevuto il volume equivalente dell'1 percentocarbossimetilcellulosa (CMC; il veicolo in cui sono state disciolte naringina ed esperidina) mediante sonda gastrica ogni giorno per 4 settimane. Il gruppo 2 (gruppo iniettato con diclofenac) è stato iniettato con diclofenac (disciolto in soluzione fisiologica) mediante somministrazione intraperitoneale a una dose di 3 mg/chilogrammo di peso corporeo (kg di peso corporeo)/giorno [11] ed è stato anche somministrato il volume equivalente dell'1 percento CMCby gavage orale ogni giorno per 4 settimane. Al gruppo 3 (gruppo iniettato diclofenac trattato con naringina) è stato somministrato diclofenac come nel gruppo 2 ed è stato trattato per via orale con naringina (disciolta in 1% CMC) a un livello di dose di 20 mg/kgb. peso/giorno mediante sonda gastrica[12] per 4 settimane. Al gruppo 4 (gruppo iniettato diclofenac trattato con esperidina) è stato somministrato diclofenac come nel gruppo 2 ed è stato trattato per via orale con esperidina (dissolta in 1% CMC) alla dose di 20 mg/kg peso corporeo/giorno [13] per 4 settimane. Il gruppo 5 (gruppo iniettato diclofenac trattato con naringina ed esperidina) è stato integrato con diclofenac come nel gruppo 2 ed è stato trattato per via orale con naringina eesperidina(sciolto in 1% CMC) alla dose di 20 mg/kg b. peso/giorno per 4 settimane.

2.4.Prelievo di sangue e fegato.

Alla fine dell'esperimento, i ratti sono stati privati ​​del cibo e sono stati raccolti campioni di sangue dalle vene giugulari. I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare a temperatura ambiente e quindi centrifugati a 3000 rpm per 15 minuti. Il siero di ciascun campione di sangue è stato frazionato in tre fiale che sono state mantenute a -30 grado fino a quando non sono state utilizzate per l'analisi biochimica.

Dopo aver prelevato campioni di sangue dalla vena giugulare, i ratti sono stati soppressi e sezionati. Il fegato di ciascun ratto è stato rapidamente asportato e lavato in soluzione fisiologica sterile ({0}},9 percento NaCl. Pezzi di fegato sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10 percento per l'indagine istologica. Altre parti sono state conservate in un congelatore a -30 gradi in attesa di omogeneizzazione in soluzione fisiologica isotonica sterile (0,9 percento NaCl) per la determinazione dello stress ossidativo e dei marcatori di difesa antiossidante. La terza parte del fegato è stata mantenuta a -30 gradi in provette Eppendorf sterili per Analisi della reazione a catena della trascrittasi-polimerasi inversa (RT-PCR).

2.5. Rilevazione dei parametri di funzionalità epatica nel siero.

Le attività ALT e AST sono state stimate utilizzando il metodo di ossidazione della nicotinamide adenina dinucleotide idrogeno (NADH) secondo i metodi rispettivamente di Murray [14] e Murray [15], utilizzando kit di reagenti acquistati da Spinreact, in Spagna. In breve, l'ALT catalizza la conversione dell'alanina in piruvato, che viene ridotto in lattato dall'LDH, e l'NADH viene ossidato in nicotinamide adenina dinucleotide (NAD). La velocità di diminuzione della concentrazione di NADH, misurata fotometricamente a 340 nm, è proporzionale alla concentrazione catalitica di ALT presente nel campione di siero. D'altra parte, l'AST catalizza la conversione dell'aspartato in ossalacetato, che viene ridotto a malato dalla malato deidrogenasi (MDH) e l'NADH viene ossidato a NAD. La velocità di diminuzione della concentrazione di NADH, misurata fotometricamente a 340 nm, è proporzionale alla concentrazione catalitica di AST presente nel campione di siero. L'attività sierica LDH è stata rilevata secondo il metodo di Van der Heiden et al. [16]. In questo metodo, LDH catalizza la reazione tra piruvato e NADH per produrre NAD* e L-lattato. La velocità di diminuzione della concentrazione di NADH, misurata fotometricamente a 340 nm, è proporzionale alla concentrazione catalitica di LDH presente nel campione. L'attività sierica dell'ALP è stata determinata secondo il metodo di Belfield e Goldberg [17] utilizzando kit ottenuti da Biodiagnostic, Egypt. Aggiungendo il campione di siero al fenilfosfato (5 mmol/L) a pH 10,

L'ALP porta alla formazione di fenolo e fosfato. Il fenolo liberato viene misurato colorimetricamente a 510nm in presenza di 4-aminofenazone e ferricianuro di potassio. L'attività GGT è stata determinata secondo il metodo di Szasz e Persijn [18] utilizzando kit ottenuti da Spectrum Diagnostic, Egyptian Company for Biotechnology, Egypt. La GGT trasferisce il loro-glutamilgruppo dal substrato L- -glutamil-p-nitroanilide, liberando il cromogeno p-nitroanilide (PNA) che viene misurato a 418 nm e la sua formazione è proporzionale all'attività della GGT. Il livello di albumina sierica è stato determinato secondo il metodo di Doumas et al. [19] utilizzando kit di reagenti acquistati da Diamond, Egitto. Il metodo, in breve, è stato eseguito aggiungendo 10μL di siero a 2mL di bro-più sol verde (0,12 mmol/L) in tampone citrato a pH 3,8. L'albumina/bromocresoloil complesso verde, formato dalla reazione, è stato misurato a 630 nm. Il livello di bilirubina sierica è stato dosato secondo i metodi di Malloy ed Evelyn [20] utilizzando kit di reagenti acquistati da Diamond, in Egitto. Questo metodo per la stima della bilirubina si basa sulla reazione di van den Bergh. In questa reazione, la bilirubina reagisce con l'acido sulfanilico diazotizzato per produrre azobilirubina che è di colore viola ed è stata misurata fotometricamente a 578 nm. L'intensità del colore è direttamente proporzionale alla quantità di bilirubina nel siero.

2.6. Valutazione dello stress ossidativo epatico e dei parametri del sistema di difesa antiossidante.

La perossidazione lipidica epatica (LPO) è stata determinata secondo il metodo di Preuss et al. [21]. In breve, la proteina è stata precipitata aggiungendo 0.15 ml di acido tricloroacetico (TCA) al 76 percento a 1 ml di omogenato di fegato. Quindi, 0.35 ml di acido tiobarbiturico (TBA) sono stati aggiunti, come agente di sviluppo del colore, al supernatante separato. Il colore rosa tenue sviluppato è stato misurato a 532 nm dopo incubazione a bagnomaria a 80 gradi per 30 minuti. Come standard è stato utilizzato l'MDA (malondialdeide o 1,1,3,{14}}tetra metossipropano). Il contenuto ridotto di glutatione (GSH) nel fegato è stato determinato aggiungendo 0,5 mL5,5'-ditiobis (2- acido azoto-zoico), il reagente di Ellman (come agente di sviluppo del colore) e una soluzione tampone fosfato (pH 7 ) per omogeneizzare il supernatante dopo precipitazione proteica in base alla procedura di Beutler et al. [22]. I colori gialli sviluppati nei campioni e negli standard GSH sono stati misurati a 412 nm rispetto al bianco. L'attività epatica GPx è stata misurata secondo la procedura di Matkovics et al.[23] con alcune modifiche. Questo metodo si basa sul rilevamento del GSH che viene convertito in glutatione ossidato (GSSG) dall'enzima attraverso il rilevamento del GSH residuo e sottraendolo dal totale. In breve, 50 μL di surnatante omogenato sono stati aggiunti a una provetta Wasserman contenente 350μL di tampone Tris (pH 7,6), 50μL di soluzione GSH (2mM) e 50μL H, O, (3,38 mM). Quindi, dopo 10 minuti di incubazione, il contenuto residuo di GSH è stato misurato con il metodo precedentemente descritto per la determinazione del GSH a 430 nm. Il test standard è stato preparato aggiungendo 50μL di acqua distillata invece di 50μL di campione e il test in bianco è stato preparato aggiungendo 100μL di acqua distillata invece di 50μL di campione e 50μL di soluzione di GSH. Dopo il rilevamento del contenuto residuo di GSH nel campione, il GSH viene convertito in forma ossidata (GSSG) e l'attività enzimatica può essere calcolata. L'attività della superossido dismutasi (SOD) epatica è stata rilevata secondo il metodo di Marklund e Marklund [24]. La reazione si basa sull'inibizione dell'autoossidazione del pirogallolo da parte di SOD. Il processo dipende dalla presenza di ioni superossido. La quantità dell'enzima che provoca un'inibizione del 50 percento nell'estinzione cambia in 1 minuto rispetto al controllo è considerata come un'unità dell'enzima.

2.7.Determinazione dei livelli sierici di TNF-, IL-17 e IL-4.

I livelli sierici di TNF-, I-17 e I-4 sono stati stimati in base a specifici kit di test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) secondo le istruzioni del produttore. Il kit ELISA Rat TNF-alfa (n. catalogo: MBS355371), il kit ELISA IL-17 (n. catalogo MBS5203506) e il kit ELISA IL-4 (n. catalogo: MBS494192) sono stati ottenuti da MyBioSource, Inc. , San Diego, California, Stati Uniti. Questi kit ELISA utilizzano ELISA sandwich. In breve, le micro piastre ELISA fornite in questi kit sono state prerivestite con un anticorpo specifico per la citochina interessata. Standard o campioni vengono aggiunti agli appropriati pozzetti della micro piastra ELISA e combinati con gli anticorpi specifici. Quindi, un anticorpo di rilevamento biotinilato specifico per la citochina in questione e il coniugato avidina-perossidasi di rafano (HRP) viene aggiunto successivamente a ciascun pozzetto della micropiastra e incubato. I componenti liberi vengono lavati via. La soluzione di substrato viene aggiunta a ciascun pozzetto. Solo quei pozzetti che contengono citochine, anticorpi di rilevamento biotinilati e coniugato avidina-HRP appariranno di colore blu. La reazione enzima-substrato viene terminata con l'aggiunta di una soluzione di acido solforico e il colore diventa giallo. La densità ottica (OD) viene misurata spettrofotometricamente ad una lunghezza d'onda di 450 nm. Il valore della DO è proporzionale alla concentrazione della citochina testata e la sua concentrazione nei campioni può essere determinata confrontando la DO dei campioni con la curva standard.

2.8.Rilevamento dell'espressione di mRNA di p53

2.8.1. Isolamento dell'RNA.

L'RNA totale è stato isolato dal tessuto epatico secondo il metodo di Chomzynski e Sacchi [25] e Boom et al. [26] utilizzando un kit di purificazione dell'RNA GeneJET Thermo Scientific ottenuto da Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, New York, USA. In breve, i campioni di fegato vengono lisati e omogeneizzati in tampone di lisi, che contiene tiocianato di guanidina come sale caotropico e -mercaptoetanolo in grado di proteggere l'RNA dalle RNasi endogene. Il lisato viene quindi miscelato con etanolo e caricato su una colonna di purificazione. Il sale caotropico e l'etanolo fanno sì che l'RNA si leghi alla membrana di silice mentre il lisato viene fatto girare attraverso la colonna. Successivamente, le impurità vengono efficacemente rimosse dalla membrana lavando la colonna con tamponi di lavaggio. L'RNA puro viene quindi eluito in condizioni di bassa forza ionica con acqua priva di nucleasi. I livelli di RNA isolato sono stati determinati e quantificati utilizzando uno spettrofotometro a raggi ultravioletti (UV) e misurando l'assorbanza a densità ottiche (OD) a 260nm e 280 nm. L'RNA è stato quantificato e qualificato sulla base della formula [27] di Sambrook e Russell （RNA（ug/μL）=ODa 260nm×diluizione×40ug/mL/1000）. Per ciascun campione di RNA estratto, il rapporto tra OD a 260 nm e OD a 280 nm e il rapporto compreso tra 1,7 e 2,0 garantiscono un'elevata purezza dell'RNA estratto.

2.8.2. Saggio RT-PCR. Il saggio RT-PCR è stato applicato utilizzando il kit Reddy Mix RT-PCR Step RT-PCR Thermo Scientific Verso 1- (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Rochester, New York, USA) per il rilevamento dell'espressione dell'mRNA del fegato p53. In breve, in una reazione in una fase, l'RNA è stato trascritto inversamente in cDNA e il cDNA prodotto è stato amplificato da Techne 32 Ther-mocycler. La miscela di reazione è costituita da Veso Enzyme Mix（1μL）, 2X One-Step PCR ReadyMix（25μL）, RT enhancer （25μL）, forward primer （10μM; 1μL）, primer inverso（10μM;1μ）, RNA templato（1 ng;1,5μL） e acqua priva di nucleasi per completare il volume totale a 50μL. Il programma di ciclo termico prevede la sintesi di cDNA (temp.50 gradi ,15 minuti,1 ciclo),Verso inattivazione (temp.95 gradi ,2 minuti, 1 ciclo), denaturazione (temp.95 gradi ,20 secondi), ricottura (temp. 55 gradi C, 30 secondi), estensione (temp.72 gradi, 1 minuto) ed estensione finale (temp. 72 gradi, 5 minuti, 1 ciclo). Il numero di cicli di denaturazione seguiti da ricottura ed estensione è di 35 cicli. Dopo la trascrizione inversa e l'amplificazione, 10μL di prodotti della PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio all'1,5% colorato con bromuro di etidio in 1 × tampone Tris Borato EDTA (TBE)pH 8.3-8.5. L'immagine elettroforetica è stata visualizzata e analizzata dal sistema di documentazione del gel (GelDocu Advanced) e i valori sono stati normalizzati alla quantità di -actina. Le sequenze di coppie di primer p53 erano 5'd CAGCGTGATGATGGTAAGGA 3'(avanti) e 5'd GCGTTGCTCTGATGGTGA 3'(reverse) secondo Asiri [28].

2.9. Indagini istopatologiche. Dopo il sacrificio e la dissezione, il fegato di ciascun ratto è stato rapidamente asportato e quindi irrorato in soluzione salina.

Pezzi di fegato di ciascun ratto (3 mm²) sono stati prelevati e fissati in formalina tamponata neutra all'10 per cento per ventiquattro ore. I fegati fissati sono stati inviati al Dipartimento di Patologia, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università Beni Suef, per ulteriore elaborazione, blocco in cera, sezionamento e colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)[29]. Le sezioni epatiche colorate sono state esaminate per il rilevamento dei punteggi istopatologici. In tre campi selezionati casualmente di ciascuna sezione (×100), le lesioni o le lesioni sono state classificate come assenti (0), lievi (I), moderate () e gravi (II) per le modifiche,0 percento, rispettivamente meno del 30 percento, 30-50 percento e oltre il 50 percento [30]. Le lesioni classificate includevano degenerazione idropica e vacuolare, infiltrazione di cellule infiammatorie, necrosi, apoptosi, proliferazione delle cellule di Kupffer, alterazioni adipose e steatosi, vasi sanguigni e sinusoidi congestionati e iperplasia del rivestimento epiteliale del dotto biliare.

2.10. Rilevazione immunoistochimica della caspasi-3.

I campioni di fegato inclusi in paraffina sono stati trasferiti al Dipartimento di Patologia, National Cancer Institute, per il sezionamento in sezioni spesse 5 um che sono state montate su vetrini a carica positiva (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). La reattività della caspasi-3 è stata elaborata secondo i metodi di Galaly et al.[31] e Ahmed e Ahmed [32]. In breve, dopo il recupero dell'antigene, un anticorpo primario diluito per la caspasi-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) è stato incubato con sezioni di fegato per 1 ora. È stato aggiunto l'anticorpo secondario biotinilato diluito (DakoCytomation Kit) e l'incubazione è stata eseguita per 15 minuti a 37 gradi. Successivamente, perossidasi di rafano coniugata con streptavidina (DakoCytomation Kit) è stata applicata per ulteriori 15 minuti di incubazione. Il complesso di anticorpi legati è stato visualizzato dalla reazione del substrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e dalla colorazione di contrasto con ematossilina. Tutte le sezioni di fegato sono state incubate nelle stesse condizioni con le stesse diluizioni di anticorpi e allo stesso periodo, quindi l'immunocolorazione era comparabile tra i diversi gruppi di studio. Per ogni preparazione è stato eseguito un controllo negativo (un vetrino senza anticorpo primario). Le sezioni sono state visualizzate al microscopio ottico ed è stata valutata l'entità dell'immunopositività cellulare. Le immagini di sezioni di fegato sono state acquisite utilizzando una fotocamera digitale (Leica, DM2500M Leica, Wetzlar, Germania). L'esame e l'analisi dell'etichettatura sono stati eseguiti utilizzando la versione del software libero ImageJ(1.51d)[33]. Il software ImageJ è stato utilizzato per misurare le intensità integrate (in pixel) della reazione positiva della caspasi-3.

2.11. Analisi statistica.

Results were represented in tables and graphs as the mean±standarderror(SE). The data were analyzed by LSD analysis to discern the main effects and to compare various groups with each other using PC-STAT, University of Georgia(USA)[34]. Values of p>0.05 sono stati considerati statisticamente non significativamente differenti, mentre i valori di p<0.05 were="" significantly="" and="" highly="" significantly="">

3. Risultati

3.1. Effetto sui parametri sierici relativi alla funzionalità epatica.

L'iniezione intraperitoneale giornaliera di diclofenac per 4 settimane ha indotto un aumento significativo (p<0.05)in serum="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" and="" ggt="" activities="" as="" well="" as="" serum="" total="" bilirubin="" level.="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" ani-mals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" decrease="" in="" these="" elevated="" levels.="" while="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" rats="" with="" naringin="" induced="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in the="" elevated="" serum="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels,="" it="" produced="" a="" nonsignificant="" effect="" (p="">0.05) sull'attività ALT. Il co-trattamento di animali iniettati con diclofenac con esperidina ha indotto un effetto significativo (p<0.05)on the="" elevated="" alt,="" ast,="" ldh,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels="" while="" it="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" effect="" in="" serum="" alp=""><0.05). the="" cotreatment="" with="" naringin="" and="" hesperidin="" in="" combination="" successfully="" caused="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in all="" elevated="" parameters="" related="" to="" liver="" function="" including="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels.="" moreover,="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" appeared="" to="" be="" the="" most="" effective="" in="" improving="" the="" elevated="" ast,="" alp,="" and="" ggt="" activities(table="" 1).="" serum="" albumin="" level,="" on="" the="" other="" hand,="" exhibited="" a="" nonsignificant="" change="" (p="">0.05) in tutti i gruppi.

3.2.Effetto sullo stress ossidativo del fegato e sul sistema di difesa antiossidante.

L'iniezione intraperitoneale giornaliera di diclofenac per 4 settimane ha indotto un aumento significativo (p<0.05)in liver="" lpo="" and="" a="" significant=""><0.05) in="" liver="" gsh="" con-tent="" and="" gpx="" and="" sod="" activities.="" the="" treatment="" of="" diclofenac-injected="" animals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" significant=""><0.05)in liver="" lpo.="" narin-gin="" and="" its="" combination="" with="" hesperidin="" were="" more="" potent="" than="" hesperidin="" alone="" in="" decreasing="" the="" elevated="" liver="" lpo="" product.="" while="" the="" treatment="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" produced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gpx="" and="" sod="" activities,="" only="" naringin,="" and="" hesperidin="" in="" combination="" induced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gsh="" content="" (table="">

3.3. Effetto sull'espressione dell'mRNA di p53 nel fegato.

Come indicato nella Figura 2, l'espressione dell'mRNA della proteina p53 proapoptotica è aumentata significativamente (p<0.05)in the="" liver="" of="" diclofenac-injected="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" the="" treatment="" with="" naringin,="" hesperidin,="" and="" their="" combination="" produced="" a="" significant=""><0.05)decrease in="" p53="" mrna="" expression="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control.="" there="" is="" no="" significant="" difference="" between="" the="" three="" treatments="" when="" compared="" with="" each="">

3.4.Effetto sui livelli sierici di TNF-, IL-17 e{4}}. Nella Tabella 3, l'iniezione intraperitoneale giornaliera di diclofenac per 4 settimane ha indotto un aumento significativo (p<0.05)in serum="" tnf-αand="" il-17="" levels="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" serum="" il-4="">

Il cotrattamento di ratti iniettati con diclofenac con naringina e/o esperidina ha indotto un miglioramento significativo (p<0.05)of altered="" serum="" tnf-a,="" il-17,="" and="" i-4="" levels.="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" both="" flavonoids="" was="" the="" most="" potent="" in="" increasing="" the="" lowered="" il-4level;="" the="" effect="" of="" the="" combination="" was="" more="" significantly="" potent=""><0.05)as compared="" with="" the="" effect="" of="" either="" naringin="" or="">

3.5. Reperti istopatologici del fegato.

La Figura 3 illustra l'effetto della naringina e/o dell'esperidina sui cambiamenti istologici del fegato di ratti iniettati con diclofenac. La Figura 3 (a) mostra il fegato con la normale struttura istologica del lobulo epatico. D'altra parte, il fegato dei ratti iniettati con diclofenac ha mostrato marcati cambiamenti istologici deleteri come la degenerazione idropica di epatociti, cellule apoptotiche e infiltrazione portale con cellule mononucleate (Figura 3 (b)) oltre alla vacuolizzazione citoplasmatica degli epatociti e necrosi epatica focale associato all'infiltrazione di cellule infiammatorie focali (Figura 3 (c)). Queste alterazioni sono state modificate in una certa misura nei ratti iniettati con diclofenac trattati con naringina che mostravano l'unico cambiamento grasso degli epatociti sporadici (Figura 3 (d)). Il trattamento dei ratti iniettati con diclofenac con esperidina ha prodotto un miglioramento dei cambiamenti istologici del fegato rispetto al controllo iniettato con diclofenac, ma ha comunque mostrato un cambiamento grasso degli epatociti sporadici, una leggera attivazione delle cellule di Kupffer e la presenza di poche cellule apoptotiche (Figura 3(e)). Allo stesso modo, il trattamento dei ratti iniettati con diclofenac con una combinazione di naringina ed esperidina ha migliorato i cambiamenti istologici del fegato rispetto al controllo iniettato con diclofenac. Tuttavia, il fegato dei ratti iniettati con diclofenac con una combinazione di entrambi i flavonoidi ha mostrato una leggera proliferazione delle cellule di Kupffer e una leggera vacuolizzazione citoplasmatica (Figura 3 (f)). Sembrava che l'effetto combinatorio di naringina ed esperidina fosse il più potente nel migliorare l'architettura istologica del fegato.

I punteggi delle variazioni istopatologiche di tutti i gruppi sono registrati nella Tabella 4. La sezione epatica del controllo normale ha mostrato zero punteggi per tutte le lesioni istologiche. I ratti iniettati nel fegato con diclofenac hanno mostrato vari gradi di punteggio delle lesioni istologiche che vanno dal grado III al grado 0. La somministrazione di esperidina e naringina a ratti iniettati con diclofenac ha comportato notevoli miglioramenti nelle lesioni istologiche tra cui degenerazione idropica e vacuolare, infiltrazione di cellule infiammatorie, necrosi, apoptosi, proliferazione delle cellule di Kupffer, alterazioni del grasso, steatosi, congestione

FcuRE 2: Effetto di naringina, esperidina e loro combinazione sull'espressione dell'mRNA di p53 nel fegato di ratti somministrati con diclofenac. I mezzi, che condividono simboli diversi, sono significativamente diversi a p<0.05. blood="" vessels="" and="" sinusoids,="" and="" hyperplasia="" of="" the="" epithelial="" lining="" of="" the="" bile="" duct;="" thereby,="" the="" liver="" exhibited="" lower="" grades="" of="" histopathological="" change="" scores="" in="" the="" diclofenac-injected="" groups="" treated="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control="" rats.="" the="" combinatory="" effect="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" was="" the="" most="" potent="" in="" decreasing="" the="" histopathological="" lesion="">

3.6. Saggio immunoistochimico.

Le sezioni di fegato colorate immunoistochimicamente sono illustrate nella Figura 4 e i risultati dell'analisi dell'immagine sono illustrati nella Figura 5.

Le microfotografie nella Figura 4 e i dati nella Figura 5 hanno rivelato che l'espressione della caspasi-3 era significativamente aumentata nei ratti iniettati con diclofenac. Il trattamento di ratti iniettati con diclofenac con naringina, esperidina e la loro combinazione ha comportato una diminuzione significativa dell'elevata espressione di caspasi-3 nel fegato. L'effetto combinatorio di naringina ed esperidina è stato il più potente nel diminuire il contenuto elevato di caspasi-3. Il trattamento con la combinazione ha normalizzato l'espressione della caspasi epatica-3.

Questo articolo è tratto da Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID articolo 9990091, 14 pagine https://doi.org/10.1155/2021/9990091