Le interazioni tra gli antiossidanti polifenolici, la quercetina e la naringenina determinano il comportamento chimico e biologico distintivo delle loro miscele in relazione all'ossidoriduzione Parte 1

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Ricerche svolte negli ultimi due decenni sulle basi molecolari di malattie croniche non infettive comeaterosclerosi, ipertensione, il diabete e soprattutto il cancro, che stanno suscitando grande interesse, hanno rivelato che tutte queste malattie condividono un fattore di rischio comune, ovvero l'interruzione dell'omeostasi redox, spesso definita stress ossidativo12. Sorge come risultato di un aumento del livello endogeno di specie reattive dell'ossigeno (ROS) a causa della mancanza della barriera antiossidante del corpo e si ritiene che promuova lo sviluppo di tutte queste malattie.3. Si è quindi ipotizzato che fattori esogeni in grado di neutralizzare i ROS, ad esempio gli antiossidanti vegetali, potessero contrastare o rallentare lo sviluppo di malattie croniche e supportarne il trattamento. La verifica di questa ipotesi ha avviato studi dettagliati sugli antiossidanti presenti negli alimenti che potrebbero presentare un potenziale preventivo4. In effetti, diversi studi riassunti nella meta-analisi che confrontano il consumo di cibo e le malattie croniche legate all'alimentazione hanno rivelato una diminuzione del rischio nel caso di diete ricche di frutta e verdura, cereali integrali e bevande come vino, caffè e tè, quindi prodotti ricchi di sostanze fitochimiche antiossidanti. Non a caso, si presumeva che queste sostanze una volta isolate dalle loro fonti naturali, purificate e poi consumate sotto forma di integratori alimentari contenenti dosi maggiori di quelle ottenibili con la dieta potessero diventare potenti agenti chemiopreventivi. Questa ipotesi è stata confermata da un ampio corpus di prove provenienti da studi che sfruttano vari modelli sperimentali in vitro e in vivo di malattie croniche, incluso il cancro.7. Deludentemente, è stato recentemente dimostrato in studi sull'uomo che gli integratori antiossidanti non mostrano attività così promettenti . Ad esempio, due meta-analisi di coorte umana e indagini caso-controllo con vitamina E8 o preparazioni di micronutrienti" hanno concluso che bassi livelli di antiossidanti non hanno alcun effetto, mentre dosi elevate potrebbero aumentare sia l'incidenza che la mortalità del cancro e delle malattie cardiovascolari. Tuttavia, quando gli integratori erano a base di piante vere, come una miscela specifica di alimenti concentrati ricchi di polifenoli (melograno, tè verde, broccoli e curcuma), è stato osservato un significativo effetto protettivo negli uomini con cancro alla prostata1.

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Gli effetti promettenti degli alimenti integrali rispetto ai composti isolati sono in linea con il concetto di sinergia alimentare, che è definita come un additivo o più dell'influenza additiva della combinazione di diversi ingredienti alimentari sulla salute umana. Il nostro studio precedente ha verificato questo concetto confrontando le bioattività degli alimenti reali con il loro principale antiossidante isolato. Ciò ha dimostrato che gli effetti biologici degli estratti di frutti di bosco differiscono notevolmente da quelli esibiti dall'antocianina cianidina-3-O-glucoside. Alcuni altri rapporti hanno anche indicato l'importanza delle interazioni tra diversi composti bioattivi e componenti della matrice alimentare che si sono rivelati fattori di cooperazione, che determinano la bioattività finale degli alimenti3-1. Anche le nostre recenti indagini meccanicistiche che coinvolgono la ricostituzione graduale della composizione del cacao del bioattivo hanno supportato l'idea di sinergia alimentare, ma hanno dimostrato che gli effetti biologici di campioni con composizioni complesse non sono solo una combinazione delle attività mostrate dai singoli componenti'3. Tutte queste osservazioni hanno suggerito che quando si considerano le bioattività legate al redox degli antiossidanti isolati rispetto alle loro miscele, devono essere prese in considerazione le interazioni tra i componenti. La crescente complessità di una miscela difitochimicisembrava crearne uno nuovosostanza redox-attivapiuttosto che arricchire la miscela con nuove attività caratteristiche del composto aggiunto, come si evince dal concetto di sinergia alimentare.

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Nella ricerca attuale, abbiamo semplificato il sistema sperimentale limitandolo a due sole strutture centrali per approfondire i dettagli delle loro interazioni nel contesto della struttura chimica, della reattività redox e delle bioattività legate alla redox, in modo da consentire una migliore comprensione e previsione del potenziale chemiopreventivo degli antiossidanti.'I fitochimici utilizzati a questo scopo erano comuni antiossidanti presenti in varie erbe, verdure e frutta, in particolare negli agrumi, vale a dire: flavonoli rappresentati dalla quercetina (O) e dalla sua rhamno-side-rutina ( R) e flavanoni da naringenina (N-) e suoineoesperidosidenaringina (N plus ) e due miscele di questi composti (QN-, RN plus ). La composizione chimica dello studio comprendeva determinazioni che fornivano informazioni sulla termodinamica e sulla cinetica dei processi ossidativi, test ieDPPH, titolazione potenziometrica e voltammetria differenziale a impulsi (DPV). I test biologici hanno esaminato l'impatto dei campioni studiati sulla crescita cellulare (test MTT), l'attività antiossidante cellulare (test CAA), la genotossicità (test della cometa), il livello di metilazione globale del DNA (versione epigenetica del test della cometa) e l'espressione di 84 redox -geni correlati (tecnologie basate su array PCR in tempo reale). Gli esperimenti biologici sono stati condotti utilizzando la linea cellulare di adenocarcinoma del colon HT29 raccomandata per studi nutrizionali come modello dell'epitelio intestinale che può essere esposto a concentrazioni relativamente elevate di antiossidanti ingeriti.

Risultati

Le nostre precedenti indagini che hanno confrontato le proprietà redox del cacao in polvere e dei suoi costituenti principali hanno evidenziato l'importanza delle interazioni tra i componenti polifenolici della miscela sull'attività antiossidante complessiva. Nella ricerca attuale, abbiamo semplificato il sistema sperimentale per esaminare tali interazioni in modo più dettagliato per una coppia di flavonoidi che sono componenti alimentari comuni. Sono stati scelti due flavonoidi, entrambi sotto forma di agliconi e glicosidi. I flavonoli erano rappresentati dalla quercetina (Q) e dai suoirhamnoside-rutina(R) eflavanonidalla naringenina (N-) e dal suo neoesperidoside naringina (N più). Questi polifenoli differiscono per il numero e la posizione dei gruppi ossidrilici redox-attivi nonché per la capacità di formare legami H intramolecolari, cioè tre caratteristiche strutturali che possono interferire con la riduzione delle proprietà dei composti antiossidanti. Come mostrato in Fig. 1, i radicali semichinonici intermedi formati nella prima fase di ossidazione della parte catecola nell'anello B

di Q o R possono essere stabilizzati in due modii8,19. Il primo modo è la coniugazione della struttura del nucleo sugli anelli B e C e la formazione del secondo legame H con il gruppo OH vicinale o sostituenti nell'anello C, specialmente in R. la presenza di gruppi ossidrile nel sostituente dello zucchero in posizione 3 dell'anello C può aumentare ulteriormente questo effetto stabilizzante a causa di maggiori possibilità di formazione di legami H (direttamente o tramite molecola d'acqua), Al contrario, il radicale fenossilico intermedio in N più o N- è stabilizzato né da doppi legami coniugati che coinvolgono anche l'anello Legame C né H con sostituenti vicini. Inoltre, in N più, la parte zuccherina è attaccata all'anello A e quindi è troppo lontana per formare un legame H con il radicale nell'anello B. Ci si può aspettare che queste caratteristiche strutturali influenzino l'attività redox dei flavonoidi studiati.

Attività antiossidante mediante test chimici.

La determinazione delle proprietà riducenti per i polifenoli studiati e le loro miscele è stata eseguita mediante due saggi chimici a 37 gradi C per abbinare le condizioni cellulari dei processi redox. Il primo metodo è stato il test DPPH spettrofotometrico a lotti comunemente usato; i risultati per i singoli flavonoidi e le loro miscele sono presentati in Fig. 2A. Sono espressi come valori stechiometrici n dove il numero 10 si riferisce alla durata della reazione: 10 min. Introducendo il parametro temporale nelle misurazioni, un aspetto cinetico è stato incorporato nella valutazione dell'attività antiossidante come è stato descritto in precedenza13. In queste determinazioni, entrambi gli agliconi hanno mostrato proprietà riducenti più forti rispetto ai corrispondenti glicosidi, come era stato anche precedentemente dimostrato con questo test2021, mentre i flavonoli erano più attivo dei flavanoni. O era il composto più efficiente nello scavenging del DPPHradical ed è stato seguito da R. Nonostante la reattività trascurabile nei confronti del DPPH, entrambi i flavanoni, incluso l'N che di per sé non mostrava proprietà redox entro il periodo di 10 minuti della reazione, hanno aumentato significativamente l'attività antiossidante totale del miscele, nel caso sia degli agliconi ON- che dei glicosidi RN plus .

Il secondo metodo prevedeva la titolazione potenziometrica (PT) che consente la misurazione del potenziale di riduzione standard (E), valutando così la capacità termodinamica dei composti puri di acquisire elettroni. I valori determinati di Confermato che Q e R sono forti composti riducenti (Fig. 2B). Tuttavia, in PT, R ha accettato elettroni donatori più volentieri di Q. La determinazione di E per N- e N plus non era possibile a causa del trasferimento di elettroni molto lento durante il processo di ossidazione (più lento per N plus). PT misura la differenza di potenziale tra l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo di misurazione dopo aver aggiunto ciascuna porzione del titolante. Il potenziale stazionario significa che il quoziente di reazione (Q) tra titolante e analita è stabile (Q= costante). Se la velocità di trasferimento della carica durante una reazione è bassa (basse correnti in voltammetria), allora ci vuole molto tempo per stabilizzare il Q in PT. Di conseguenza, per reazioni molto lente, la curva di titolazione potenziometrica è difficile da ottenere e quindi il valore trovato di E" è meno affidabile.

ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE mediante voltammetria a impulsi differenziali,

I test chimici utilizzati hanno suggerito che la delucidazione dell'azione antiossidante dei polifenoli deve prendere in considerazione gli aspetti cinetici, in cui la stabilità dei radicali intermedi potrebbe svolgere un ruolo. Come illustrato in Fig. 1, i radicali semichinonici formati durante il primo stadio dell'ossidazione dei flavanoli sono molto meglio stabilizzati dei radicali fenossilici che si formano dopo l'ossidazione dei flavanoni. Questa relazione è illustrata in Fig. 1 e può influenzare la velocità dei processi redox. Pertanto, le proprietà di riduzione-ossidazione degli antiossidanti puri studiati e delle loro miscele sono state ulteriormente analizzate con l'ausilio della voltammetria a impulsi differenziali (DPV). Poiché questa tecnica consente il monitoraggio degli aspetti termodinamici e cinetici delle reazioni di ossidazione, entrambi vengono infine combinati in un parametro chiamato potere antiossidante (AOP)15.

Le osservazioni fatte con misurazioni DPV (Fig.2B-F) contraddicevano quelle acquisite con il test DPPH (Fig.2A). Sorprendentemente, DPV ha rivelato che Q descritto in letteratura come un eccellente riducente, considerando solo gli aspetti termodinamici (potenziale di picco anodico, E.), si è rivelato l'antiossidante più debole (Fig.2B, C). Termodinamicamente, R era un antiossidante leggermente più forte. È interessante notare che N- e N plus sono considerati in letteratura come antiossidanti deboli, hanno mostrato termodinamicamente i valori più alti di E, il che significa che erano agenti riducenti molto forti. Per entrambe le classi di flavonoidi, la frazione glicosidica ha aumentato l'attività antiossidante degli agliconi. Tuttavia, i parametri relativi alla cinetica (Fig.2E, F), ovvero la corrente anodica (I,.) e la densità di carica (Q), hanno rivelato che l'ossidazione di N plus è il processo più lento rispetto all'ossidazione di Q e R. Allo stesso modo , la corrente anodica (I) era inferiore per N-che per Q e R, ma il trasferimento di carica per questo composto ha raggiunto il valore più alto.

Nel caso di miscele sono stati rilevati due picchi anodici (1° e 2°) su curve voltammetriche come ci si poteva aspettare per la miscela bicomponente. I valori determinati dei potenziali di picco anodico (E.) indicavano che il 1° picco osservato riflette l'ossidazione dei flavonoli, mentre 2"d raggiunge il picco l'ossidazione dei flavanoni (Materiali supplementari-Fig. S1). Nella maggior parte dei casi, la presenza dell'altro componente in una miscela ha influenzato la termodinamica e/o la cinetica del processo redox rispetto all'ossidazione dei composti puri Ad esempio per QN- il valore di E., per il 1° picco di ossidazione era pari al potenziale di picco anodico di Q ossidazione. Tuttavia, il picco anodico di 2 "corrispondente all'N-ossidazione e il potenziale di questa transizione era superiore al potenziale anodico dell'N-puro (Fig.2C). La situazione opposta è stata osservata per la cinetica di questa reazione. Il picco anodico I e Q di 1s di QN era vicino ai parametri cinetici dell'ossidazione dei componenti puri (Fig. 2E, F), mentre la carica scambiata durante la fase 2n dell'ossidazione ON era molto inferiore a quella dell'ossidazione N (Fig.2F). Questi effetti termodinamici e cinetici combinati hanno portato al miglioramento dell'AOP (Fig. 2D) di questa miscela, che è in accordo con i risultati del test DPPH.

Valutazione della citotossicità.

L'impatto degli agliconi flavonoidi studiati (Q, N-), glicosidi (R, N plus) e loro miscele (QN-, RN plus) sulla crescita delle cellule intestinali è stato valutato mediante il test MTT. La linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano HT29 è stata scelta come modello di epitelio del tratto digerente, ovvero il tessuto a diretto contatto con gli ingredienti alimentari ingeriti come i polifenoli. Le cellule sono state trattate con singoli flavonoidi e loro miscele a concentrazioni fisiologiche potenzialmente presenti nel sangue (0.01-1 uM){5}} o concentrazioni raggiungibili nel tratto digerente (10-100 uM) dopo l'ingestione di cibo25-27. Le curve dose-risposta per trattamenti di 6,24 e 72 ore sono presentate in Fig.3.

I singoli composti non hanno influenzato significativamente la crescita cellulare a nessuna delle concentrazioni studiate, né per trattamenti brevi né prolungati. L'eccezione era la concentrazione più alta di N-che dopo 72 ore inibiva la crescita cellulare fino al 75% rispetto al controllo. Al contrario, le miscele studiate (QN-, RN plus) hanno stimolato in modo significativo la crescita cellulare in modo dipendente dalla concentrazione per tutti i tempi di esposizione testati. Questo effetto è stato osservato a basse concentrazioni (0.01-1 uM) essendo raggiungibili nel flusso sanguigno ed era ancora più potente a concentrazioni più elevate (10-100 uM) rispetto alle cellule epiteliali del tubo digerente può essere esposto. Solo nel caso della massima concentrazione di QN-, dopo 72 h di trattamento, la stimolazione è cessata, probabilmente a causa degli effetti inibitori osservati in tali condizioni per N-. Attività antiossidante cellulare. L'efficienza dei flavonoidi purificati e delle loro miscele nel supportare la barriera antiossidante endogena delle cellule HT29 è stata verificata con l'ausilio del saggio CAA. Questo metodo si basa sulla capacità di un campione contenente composti redox-attivi di inibire o promuovere l'ossidazione della sonda assorbita dalle cellule alla sua forma fluorescente. L'attenuazione dell'ossidazione della sonda, osservata come spegnimento della fluorescenza, è una misura della capacità riducente degli antiossidanti nelle cellule (valori CAA positivi), mentre l'aumento dell'ossidazione della sonda denota la loro attività pro-ossidativa (valori CAA negativi)28 . Le determinazioni sono state effettuate per agliconi e glicosidi a concentrazioni che riflettono esposizioni intestinali sia fisiologiche, endogene, sia di origine alimentare, esogene. L'incubazione con i flavonoidi studiati è stata effettuata per un periodo standard raccomandato di 1 h18 per gliconi e glicosidi. I trattamenti prolungati (3 e 6 h) volti a monitorare la cinetica della risposta redox nel modello cellulare applicato sono stati utilizzati solo nel caso degli agliconi, a causa del loro impatto più rilevante sull'attività antiossidante cellulare.

I flavanoni e i flavonoli studiati differivano nel loro impatto sullo stato redox delle cellule HT29. Nel caso dei singoli agliconi, le risposte dipendenti dalla concentrazione definite sono state osservate dopo 1 ora di esposizione. Tuttavia, l'attività antiossidante del flavonolo-Q è aumentata con la concentrazione applicata, mentre nel caso del flavanone-N-è stato osservato il graduale potenziamento dell'effetto pro-ossidativo (Fig. 4A). La dose-dipendenza dei singoli glicosidi era meno evidente; solo R alla sua concentrazione più alta ha aumentato in modo convincente l'attività antiossidante cellulare (Fig. 4A). È interessante notare che entrambe le miscele hanno mostrato una maggiore attività antiossidante, apparentemente non influenzata dall'effetto pro-ossidativo osservato per i singoli composti.

La Figura 4B presenta la cinetica dei cambiamenti dei valori CAA determinati dopo il trattamento l,3 e 6h delle cellule HT29 con agliconi. Per la concentrazione più bassa (1 μM), corrispondente alle esposizioni fisiologiche, la dipendenza dal tempo non è stata osservata né per i singoli agliconi né per la loro miscela. Tuttavia, le influenze di una maggiore concentrazione sui valori di CAA erano chiaramente dipendenti dal tempo. Le esposizioni prolungate hanno ridotto sia l'effetto pro-ossidativo di N- che l'attività antiossidante di Q e QN-.

Gli agliconi studiati hanno mostrato una diversa attività nutrigenomica, ulteriormente modificata dalla concentrazione applicata alle cellule.

Flavanone N-at l μM ha ridotto significativamente l'espressione di CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Questo flavanone applicato alle cellule HT29 a 10 uM ha influenzato l'espressione di 5 geni, che erano anche sottoregolati dalla sua dose più bassa, vale a dire: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutazione dei radicali superossido in perossido di idrogeno e ossigeno6. Il leggero aumento dell'espressione causato da N-at 10uM è stato osservato solo per il gene VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Questo articolo è estratto da www.nature.com/scientificreports