L'associazione del raro polimorfismo del gene Rs35667974 IFIH1 con le malattie autoimmuni è un caso di epigenetica dell'RNA?

visualizzazione: AA, AP e EEE, supervisione: EEE e acquisizione di finanziamenti: EEE. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto. Astratto

L'interferone indotto con il gene della proteina 1 contenente il dominio dell'elicasi C (IFIH1) codifica per una RNA elicasi citoplasmatica altrimenti nota come melanoma differenziation-associated 5 (MDA5), una RNA elicasi simile a RIG-1- che riconosce l'RNA virale ed è coinvolta nell'RNA elicasi innato immunità attraverso il riconoscimento dell'RNA virale. Dopo il legame con l'RNA a doppio filamento (ds), MDA5 forma un assemblaggio filamentoso lungo la lunghezza del dsRNA e utilizza le firme molecolari per discriminare il sé, rispetto al non sé in base alla lunghezza del dsRNA e alla metilazione. La sua variante missenso rs35667974 è protettiva contro il diabete di tipo 1, la psoriasi e l'artrite psoriasica, ma è anche associata a un aumentato rischio di spondilite anchilosante, morbo di Crohn e colite ulcerosa. Per ottenere informazioni sul ruolo complesso di questa variante abbiamo eseguito un'analisi strutturale di MDA5 in complesso con dsRNA utilizzando simulazioni di dinamica molecolare.

I nostri dati suggeriscono che mentre la mutazione Ile923Val della variante rs35667974 non influisce in modo significativo sul legame con il dsRNA nativo, mostra un effetto destabilizzante in presenza di 2'-O metilazione dell'uridina. Pertanto, la presenza di 2'-O-metilazione al dsRNA introduce una firma di rilevamento che porta alla riduzione selettiva dell'attività catalitica MDA complessiva. Questo studio rappresenta una valutazione del ruolo della variante condivisa rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, segnalata per portare a un'attività catalitica selettivamente ridotta del fenotipo MDA5 modificato e, di conseguenza, a un feedback negativo ridotto sulla segnalazione di citochine e chemochine e protezione selettiva contro l'autoimmunità .

Il dominio elicasi C è un'importante proteina enzimatica che può svolgere la struttura a doppia elica del DNA. Può aiutare il DNA a completare la corretta replicazione, modifica e consegna nel processo di replicazione, riparazione e trascrizione cellulare ed è una delle chiavi per il normale funzionamento delle cellule. Allo stesso tempo, l'immunità è un meccanismo di difesa molto importante nel corpo umano, che può proteggerci efficacemente da agenti patogeni come batteri e virus.

Gli studi hanno dimostrato che il dominio elicasi C svolge un ruolo importante nell'immunità. Innanzitutto, il dominio elicasi C può garantire la stabilità e l'efficienza di codifica dei geni aiutando la normale replicazione, riparazione e trascrizione del DNA cellulare, migliorando così l'immunità del corpo umano. In secondo luogo, il dominio elicasi C può promuovere il riconoscimento delle molecole di eterogeneità proteica da parte delle cellule e regolare la trasduzione del segnale del sistema immunitario, supportando così la funzione di difesa dell'organismo. Entrambi i due metodi di cui sopra hanno svolto un ruolo positivo nel promuovere il mantenimento e il miglioramento dell'immunità.

Inoltre, lo studio approfondito della relazione tra il dominio dell'elicasi C e l'immunità ci fornisce anche un'importante ispirazione per scoprire nuovi farmaci per il trattamento del cancro e delle malattie immuno-correlate. Lo sviluppo di farmaci e la terapia genica mirati al dominio dell'elicasi C possono migliorare la resistenza del corpo al cancro e ad altre malattie immuno-correlate e aiutare i pazienti ad affrontare meglio il trattamento e il recupero delle malattie correlate.

Per riassumere, la relazione tra il dominio dell'elicasi C e l'immunità è molto stretta e svolge un ruolo vitale nell'assicurare la stabilità genica, promuovere l'immunità cellulare e sostenere la difesa del corpo. Si spera che attraverso metodi di ricerca e trattamento pertinenti, possiamo mantenere e migliorare meglio l'immunità umana e creare una vita più sana e migliore per noi. Da questo punto di vista, dobbiamo rafforzare l'immunità personale. Cistanche ha un effetto significativo sul miglioramento dell'immunità perché la pasta di carne è ricca di una varietà di sostanze antiossidanti, come vitamina C, vitamina C, carotenoidi, ecc. Questi ingredienti possono eliminare i radicali liberi e ridurre lo stress ossidativo. Stimolare e migliorare la resistenza del sistema immunitario.

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Parole chiave

Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) · Modello molecolare · Interferone indotto con dominio 1 dell'elicasi C (IFIH1) · Melanoma 5 associato alla differenziazione (MDA5) · Metilazione dell'RNA.

introduzione

I geni e i meccanismi coinvolti nelle malattie autoimmuni, che colpiscono circa il 5% della popolazione, rimangono ancora poco chiari ma i dati accumulati suggeriscono fortemente che diverse malattie autoimmuni possono condividere un background genetico comune, evidenziando così l'esistenza di varianti condivise da diverse malattie autoimmuni (Zhernakova et al. 2009). Il tentativo di svelare queste informazioni genetiche in meccanismi biologicamente significativi che portano a malattie si riferisce all'identificazione di geni causali. L'identificazione delle varianti che causano la malattia è un compito difficile ma necessario nel tentativo di stabilire metodi efficaci per la previsione, la prevenzione e l'intervento della malattia (Biros et al. 2005).

Diversi tipi di molecole di RNA sono coinvolti nella regolazione di diversi processi biologici, tra cui l'RNA messaggero (mRNA), l'RNA di trasferimento (tRNA), l'RNA ribosomiale (rRNA), il microRNA (miRNA) e l'RNA lungo non codificante (lncRNA). Le molecole di RNA contengono numerose (più di 150) modificazioni chimiche (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Queste modifiche sono funzionalmente collegate a tutte le fasi del metabolismo dell'RNA, come struttura, stabilità e interazioni, e svolgono ruoli critici in diversi processi biologici, come la modulazione della replicazione dei virus e le risposte immunitarie antivirali (Machnicka et al. 2013). Tra questi, la metilazione del ribosio è tra le modifiche più onnipresenti trovate nell'RNA. La 2′-O -metiluridina si trova in rRNA, snRNA, snoRNA e tRNA di Archaea, Bacteria ed Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). La ribosio-2′-Ometilazione aumenta l'idrofobicità dei nucleotidi e li protegge dall'azione delle nucleasi (Yildirim et al. 2014).
Prove crescenti indicano che la 2'-O-metilazione dell'RNA virale (2'OMe-RNA) svolge un ruolo importante nell'evasione delle risposte immunitarie innate cellulari nelle cellule ospiti (Dimitrova et al. 2019). Züst e colleghi hanno dimostrato che 2′ OMe di RNA virale hanno contribuito all'evasione della risposta antivirale mediata dall'interferone (IFN), promuovendo così la replicazione virale (Züst et al. 2011). Inoltre, Vitali e Scadden hanno proposto che IU-dsDNA sopprima la via di stimolazione dell'IFN MDA5 (Vitali e Scadden 2010).

L'interferone indotto con il gene del dominio 1 dell'elicasi C (IFIH1) codifica per una RNA elicasi citoplasmatica nota anche come MDA5 (proteina 5 associata alla differenziazione del melanoma) ed è un recettore RIG-I-like (RLR) che svolge una funzione antivirale nell'immunità innata rilevando gli RNA virali. MDA5 riconosce 0.5–1 kb struttura staminali duplex di RNA che di solito si forma durante la replicazione picornavirale e media una risposta immunitaria all'infezione virale (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5, al rilevamento di lunghi RNA virali a doppio filamento (dsRNA), generati durante la replicazione dei picornavirus, attiva la via di segnalazione dell'interferone di tipo I. Gli studi hanno dimostrato che l'MDA5 forma un filamento lungo la lunghezza del dsRNA e utilizza la dinamica del filamento dipendente dall'ATP per discriminare tra sé e non sé in base alla lunghezza del dsRNA (Toro et al. 2015). È stato dimostrato che MDA5 è coinvolto nella modulazione del crosstalk tra le cellule e il sistema immunitario innato/adattivo attraverso la produzione locale di citochine e chemochine.

I cambiamenti nell'espressione e/o nell'attività di MDA5 possono innescare risposte cellulari al dsRNA, un sottoprodotto della replicazione del virus (Colli et al. 2010). È stato anche dimostrato che la mutazione dei residui associati alla formazione di fiamme provoca la perdita della formazione del filamento e la segnalazione dipendente da MDA 5-, ad eccezione di un paio di mutazioni, che migliorano moderatamente la segnalazione. Questi risultati suggeriscono che i meccanismi indipendenti dall'ATP, vale a dire un legame più stretto dell'RNA e/o un'interazione proteina-proteina più stabile, sono probabilmente responsabili della stabilità osservata della formazione del filamento MDA5 in vitro e di una maggiore attività di segnalazione nelle cellule (Sohn et al. Hur 2016).

Smith et al. (2006) e Nejentsev et al. (2009) descrissero un raro allele del gene IFIH1 che conferisce protezione dal diabete di tipo 1 (T1D). Questo polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs35667974 IFIH1, in cui l'isoleucina conservata (codone [ATT]) nella posizione #923 si trasforma in valina (codone [GTT]), è una variante rara in quanto la frequenza dell'allele minore (MAF) è C {{ 9}}.010031 (2655 individui in un campione totale di 264690) basato su TOPMED (Taliun et al. 2021) e C = 0.016267 (3343 individui in un campione totale di 205514) basato su ALFA (Phan et al.2020; Sherry et al.2001). Nella Tabella 1 è presentata la biogeografia umana della frequenza del polimorfismo in diverse regioni continentali basata sui dati del progetto ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Studi successivi hanno confermato che questo raro allele ha avuto lo stesso effetto su T1D, psoriasi (PS) (Li et al. 2010) e artrite psoriasica (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Al contrario, questo SNP è stato associato come fattore di rischio per la suscettibilità allo sviluppo di spondilite anchilosante (SA) (Ellinghaus et al. 2016), morbo di Crohn (MC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 ) e colite ulcerosa (CU) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov et al. (2010) hanno dimostrato che le mutazioni con perdita di funzione E627X e I923V di MDA5 sono associate a una minore produzione di interferone indotta da poli(I: C) nelle cellule mononucleari del sangue periferico di pazienti affetti da diabete di tipo 1 e quindi sono protettive per il T1D. Si afferma inoltre che nella molecola MDA5, la sostituzione dell'amminoacido I923V risiede in prossimità di un residuo H927, che contribuisce al legame del dsRNA (Yoneyama e Fujita 2008). Tuttavia, è stato dimostrato che la variante MDA I923V ha una capacità normale di legare il dsRNA ma un'attività catalitica ridotta di 2.5-volte (Shigemoto et al. 2009). Pertanto, questo polimorfismo sembra non influenzare in modo significativo le proprietà di legame acido nucleotidico di questa elicasi citoplasmatica sensibile all'RNA, ma ne altera la funzione con un meccanismo ancora sconosciuto.

È stata trovata la relazione tra il polimorfismo IFHI1 e l'incidenza dell'infezione da enterovirus nel T1D e l'associazione tra la variante MDA5 I923V e la frequenza dell'RNA enterovirale nei pazienti con T1D (Looney et al. 2015). Inoltre, recenti studi sui topi MDA5- e MAVSknockout hanno mostrato un ruolo critico di queste proteine ​​nella mediazione delle risposte dell'interferone di tipo 1 contro il virus Coxsackie B (Wang et al. 2010). È stato dimostrato che una proteina leader del mengovirus impedisce l'espressione di IFN- bloccando la dimerizzazione di IRF3 necessaria per l'attivazione di questo fattore (Hato et al. 2007). Questa osservazione suggerisce che le varianti che interrompono la funzione IFIH1 nella risposta antivirale dell'ospite sono state selezionate negativamente, piuttosto che selezionate positivamente perché conferiscono protezione dal T1D (Crow 2011).

Chow et al. (2018) hanno ampiamente analizzato, tra gli altri, i recettori simili a RIG-I, mentre Brisse e Ly (2019) hanno esaminato ampiamente l'evoluzione e la speciazione di MDA5 e del relativo RIG-I. La posizione dei residui alterati all'interno o vicino ai siti di legame dell'RNA e dell'ATP o all'interfaccia del filamento ci ha portato a ipotizzare che le mutazioni osservate potrebbero migliorare la stabilità del filamento IFIH1 aumentando l'affinità intrinseca tra IFIH1 e dsRNA o tra IFIH1 molecole nel filamento o diminuendo l'efficienza dell'idrolisi dell'ATP e, quindi, la velocità di disassemblaggio del filamento (Rice et al. 2014).

Questo lavoro rappresenta uno studio strutturale del ruolo potenziale della variante condivisa rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, segnalato per portare a un fenotipo di funzione inibita che codifica una sostituzione dell'amminoacido Ile923Val nel prodotto proteico del gene IFIH1 MDA5. Quest'ultimo è un gene candidato causale biologicamente plausibile condiviso tra diverse malattie, che influenza il controllo dell'espressione locale di citochine e chemochine che proteggono dall'autoimmunità (Colli et al. 2010). Questo lavoro mira a esplorare il meccanismo ancora sconosciuto mediante il quale la sostituzione Ile923Val riduce l'attività catalitica dell'MDA5 umano. In questo studio, abbiamo studiato le differenze nell'interazione di MDA5 con dsRNA tra il nativo e la rara variante Ile923Val nell'inizio del meccanismo di infiammazione. Di conseguenza, abbiamo mirato a studiare il comportamento dinamico del complesso MDA5 / dsRNA umano in un ambiente acquoso in presenza di Ile923 o Val923 quando l'uracile 2′-O è metilato o meno. Questa analisi strutturale di suscettibilità genetica condivisa rara o loci di protezione può fornire approfondimenti sulla nostra comprensione della fisiopatologia delle malattie autoimmuni e i risultati della ricerca possono influenzare la migliore gestione delle malattie in esame.

Materiali e metodi

Recupero di sequenze, costruzione di alberi filogenetici e analisi di selezione positiva

La sequenza proteica di Homo sapiens (ID sequenza: NP_071451.2) è stata recuperata dal database UniProt (The UniProt Consortium 2021). Per trovare omologhi tra le specie, le ricerche BLAST sono state eseguite con Mega BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) nel database delle proteine ​​RefSeq e NR (e PDB e UniProt) utilizzando Blastp (proteina-proteina BLAST) con parametri predefiniti (Altschul et al. 1997). Inizialmente sono stati selezionati 1000 omologhi delle proteine ​​MDA5 umane ed è stata utilizzata una selezione tra specie incentrata sul dominio C-terminale contenente la sequenza attorno alla sostituzione I923V umana per identificare questa variazione in altre specie. Clustal Omega, il programma di allineamento di sequenze multiple (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) e il server di allineamento di sequenze multiple T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) sono stati utilizzati per eseguire allineamenti di sequenze proteiche e il software di bioinformatica della piattaforma Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) per visualizzare in modo selettivo più allineamenti.

L'analisi evolutiva viene utilizzata per identificare le posizioni sulle sequenze proteiche che sono fortemente conservate tra le specie, indicando l'importanza strutturale (Andreou et al. 2018). L'albero filogenetico è stato costruito utilizzando il metodo Maximum Likelihood (Nei e Kumar 2000) e il modello Tamura-Nei (Tamura e Nei 1993) con 500 repliche bootstrap (Felsenstein 1985). Gli alberi iniziali per la ricerca euristica sono stati ottenuti automaticamente applicando gli algoritmi Neighbor-Join e BioNJ a una matrice di distanze a coppie stimate utilizzando il modello Tamura-Nei e quindi selezionando la topologia con un valore di probabilità logaritmica superiore. L'analisi filogenetica ha coinvolto 52 sequenze nucleotidiche omologhe (39 ortologhi e 13 paraloghi) del gene umano IFIH1. Le posizioni del codone incluse erano 1a più 2a più 3a più Non codificante. C'erano un totale di 3729 posizioni nel set di dati finale. Le analisi evolutive sono state condotte utilizzando il pacchetto software MEGA11 (Tamura et al. 2021).

Per rilevare se il gene IFIH1 si è evoluto in modo adattivo, abbiamo utilizzato il programma codeml nel pacchetto software PAML v4.9j (Yang 2007). La sequenza nucleotidica e il corrispondente file di allineamento della sequenza proteica sono stati inviati a PAL2NAL (Suyama et al. 2006) per formare i file di allineamento nucleotidico di input CODEML appropriati. Le analisi di selezione positiva per i geni ortholog MDA5 sono state eseguite utilizzando modelli di sito e sito di ramo (Yang et al. 2005; Yang e Bielawski 2000). Il rapporto del tasso di sostituzione non sinonimo/sinonimo (ω=dN/dS) fornisce una misura della pressione selettiva a livello di aminoacidi. La grandezza del valore di dN/dS (ω) rappresenta i tipi di selezione: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 per selezione positiva (Yang et al. 2005). In CODEML i modelli di sito (M0, M1, M2, M3, M7 e M8) e i modelli di sito di diramazione (Clades A e C) sono stati selezionati per eseguire l'analisi di selezione positiva (Bielawski e Yang 2004; Yang e Nielsen 2002). Nei modelli di sito, il test del rapporto di verosimiglianza (LRT) è stato utilizzato per testare la selezione positiva confrontando le tre coppie di modelli (M0/M3, M2/M1 e M7/M8). L'analisi è stata eseguita sia per la sequenza a lunghezza intera che per la sequenza C-Terminal Domain (CTD).

Analisi strutturale e simulazioni di dinamica molecolare

La struttura della microscopia crioelettronica (cryo-EM) del filamento hMDA5-dsRNA in presenza di ATP (ID PDB: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) è stata utilizzata come sistema modello per la dinamica molecolare ( MD) simulazioni. Tutti i residui proteici si sono risolti (307-1020), le 14 paia di basi dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) e lo zinco coordinato sono stati mantenuti, mentre i residui mancanti sono stati modellati utilizzando il server SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). I parametri del campo di forza e gli atomi di idrogeno sono stati aggiunti utilizzando il modulo XLEaP di AMBER 18 (Case et al. 2005). I campi di forza AMBER f14SB (Maier et al. 2015) e f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) sono stati utilizzati rispettivamente per la proteina e l'RNA, con i parametri modrna08 (Aduri et al. 2007) per i nucleosidi modificati. La mutazione I923V è stata introdotta in MDA5 rimuovendo manualmente il gruppo metilico Cδ di I923, mentre il ribosio modificato di U12 è stato metilato a 2′-O utilizzando il residuo della libreria modrna08 MRU. Lo ione zinco è stato legato con i 4 residui di cisteina 907, 910, 962 e 964, utilizzando parametri di campo di forza appropriati per mantenere una sfera di coordinazione tetraedrica (lunghezze di legame Zn–S di 2,35 Å con 50 kcal·mol–1·Å–2 costanti di forza e angoli S–Zn–S di 109,5 gradi con 25 kcal·mol–1·rad–2).

In questo modo, abbiamo preparato 4 sistemi per le simulazioni MD: (i) MDA5–dsRNA nativo, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2′OMe) e (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Tutti i sistemi sono stati solvatati in scatole di solventi ottaedrici troncate di molecole d'acqua TIP3P pre-equilibrate, con un tampone minimo di 10 Å attorno al complesso e quindi è stato aggiunto il numero richiesto di controioni per ottenere la neutralizzazione della carica dei sistemi. Le simulazioni MD sono state eseguite con la versione con accelerazione GPU del modulo PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013) in AMBER 18 e un passo temporale di 2 fs. La temperatura è stata regolata utilizzando il termostato Langevin con una frequenza di collisione di 1,0 ps-1, mentre la pressione è stata regolata utilizzando il barostato Berendsen con un tempo di rilassamento della pressione di 1,0 ps. SHAKE è stato utilizzato per vincolare i legami che coinvolgono atomi di idrogeno con una tolleranza di 10-6 Å, mentre le interazioni non legate sono state calcolate con un limite di spazio diretto di 10 Å.

La minimizzazione dell'energia è stata eseguita inizialmente per 1{{2{0}},000 passaggi con vincoli posizionali di 100 kcal·mol–1·Å–2 costante di forza sugli atomi non di idrogeno di MDA5-dsRNA. Il solvente è stato quindi equilibrato a 300 K e 1 atm attraverso brevi cicli di simulazioni negli ensemble NVT e NPT, rispettivamente a 100 ps e 400 ps, ​​mantenendo i vincoli sugli atomi non di idrogeno del soluto. Successivamente, la minimizzazione dell'energia è stata eseguita per 10,000 passaggi, ma con restrizioni posizionali di 10 kcal·mol–1·Å–2 solo sugli atomi di C di MDA5 e sulla spina dorsale di fosfato del dsRNA. In 3 sub sono stati gradualmente rilassati (10.0, 1.0, 0.1 kcal·mol–1·Å–2) per 1 ns, seguiti da 9 ns di equilibrio senza restrizioni sotto pressione costante. Dopo questi 10 ns iniziali di equilibratura (non utilizzati nell'analisi), sono state eseguite 100 ns di simulazioni di produzione nell'insieme NPT per ciascun sistema a 300 K e 1 atm, memorizzando istantanee del sistema ogni 5,0 ps per l'analisi utilizzando CPPTRAJ modulo di AMBER 18 (Roe e Cheatham 2013). Tutte le figure raffiguranti modelli 3D sono state generate utilizzando il sistema grafico molecolare PyMOL (build open source v.2.3).

Risultati

Analisi filogenetica della sostituzione Ile923Val di MDA5

L'evoluzione e la speciazione di MDA5 e del relativo RIG-I sono ampiamente riviste da (Brisse e Ly 2019). Qui l'evoluzione IFIH1 è stata impiegata per definire elementi di conservazione nella sequenza MDA5 circa il particolare polimorfismo. L'analisi evolutiva ha rivelato la conservazione di una sequenza pesante tra MDA5 di specie diverse (984 su 1000 sequenze studiate hanno isoleucina nella posizione equivalente di hMDA #923) nel dominio RD/CTD, indicando un'importanza strutturale/funzionale. Il polimorfismo rs35667974 nell'esone 14 del gene umano causa una mutazione conservata dell'amminoacido nella posizione 923 da Ile a Val in hMDA5. Tuttavia, ci sono altre sedici specie distanti che hanno la stessa posizione occupata da una valina (Fig. 1) che indica la fattibilità di questo cambiamento tra le specie nel dominio RD/CTD di MDA5 e il dominio RS/GY strettamente omologo delle isoforme X1, Eliche X3 e DHX58 (Fig. 2). Inoltre, l'allineamento della sequenza della regione attorno alla posizione hMDA #923 (il ciclo di interazione CTD MDA) rivela una sequenza da moderata a altamente conservata tra specie distanti che indica l'importanza funzionale tra specie della regione.

Rilevamento della selezione positiva

Per rilevare se il gene IFIH1 si è evoluto in modo adattivo, sono stati utilizzati modelli di sito e modelli di sito di filiale per eseguire analisi di selezione positiva di ortologhi dell'intero gene e del dominio CTD. Nei modelli di sito, non sono stati identificati siti di selezione positivi per il dominio CTD (Tabella 2). M0 implica un tasso di evoluzione costante (ω=dN/dS=0.2) (Tabella 2). Alcuni siti che erano stati sottoposti a selezione positiva sono stati identificati utilizzando il metodo dei modelli di sito M2- e M8- per l'intero gene (Tabella 1 suppl.), sebbene non nelle regioni di interazione dell'RNA e nel dominio CTD. Nei modelli di sito, ω (dN/ dS) è<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

In particolare, per il modello di sito di filiale C per il dominio CTD (Tabella suppl. 3), il 33% dei siti si sta evolvendo nella categoria ω0=0. 036. Poiché i siti che si evolvono in questa categoria non distinguono tra i tipi di filiale, entrambi i tipi di filiale hanno lo stesso valore di ω per i siti che rientrano in questa categoria. Inoltre, il 55% dei siti si sta evolvendo nella categoria ω2. Tuttavia, questi hanno valori ω che sono condizionati dal tipo di ramo (ω20=0.25 e ω21=0). Inoltre, per il modello C del sito di diramazione per i 39 geni ortholog MDA5 (Tabella suppl. 4), il 33 percento dei siti si sta evolvendo nella categoria ω0=0. 027. D'altra parte, il 41 percento dei siti si evolve nella categoria ω2. Tuttavia, questi hanno valori ω che sono condizionati dal tipo di ramo (ω20=0.25 e ω21=15.32).

Analisi strutturale

L'analisi evolutiva condotta dimostra che la sostituzione Ile923Val non è una variante unica nella specie umana, poiché Val esiste nella posizione della sequenza MDA5 anche in altre specie. MDA5 è un recettore dell'RNA virale a doppio filamento (dsRNA) che svolge un ruolo chiave nell'immunità antivirale grazie alla sua specifica specificità per l'RNA virale (Wu et al. 2013). È stato dimostrato che la 2′-O-metilazione dell'mRNA virale è importante per le risposte immunitarie innate, pertanto è stato suggerito che la 2′-O-metilazione sia una firma molecolare per la distinzione tra mRNA self e non self. (Zust et al. 2011). Per studiare il ruolo potenziale della sostituzione Ile923Val nella variante missenso IFIH1 rs35667974, abbiamo analizzato la struttura della microscopia crioelettronica (crio-EM) del filamento MDA5-dsRNA in presenza di ATP (ID PDB: 6GKM) (Yu et al. 2018). La posizione 923 si trova sul loop 921-927 che interagisce direttamente con il dsRNA (Fig. 3A). In particolare, Ile923 si trova a 4,8 Å da 2′-ΟΗ dell'uridina U12 e la loro interazione è stabilizzata attraverso un legame idrogeno tra l'adiacente His927 e la base dell'uracile. La sostituzione di Ile923 con Val nella variante rs35667974 non dovrebbe introdurre alcun conflitto sterico, piuttosto che minimizzare le interazioni con 2′-ΟΗ dell'uridina U12 (Fig. 3B). Nel caso in cui l'RNA sia metilato al ribosio di U12, la variante MDA5 naturale con Ile923 mostra un contatto van der Waals favorevole con un gruppo 2′-OMe di U12 a 3, 6 Å (Fig. 3C), mentre Val923 della variante rs35667974 è situato a 5,0 Å (Fig. 3D). Queste differenze non possono suggerire un effetto importante della sostituzione Ile923Val di per sé; tuttavia, sottili cambiamenti strutturali spesso portano a cambiamenti funzionali significativi attraverso l'interruzione delle dinamiche strutturali del sistema.

Calcoli di dinamica molecolare

Per studiare l'effetto della mutazione I923V di MDA5 nella sua interazione con dsRNA, sia nativo che 2′-Ο-metilato, abbiamo impiegato simulazioni di dinamica molecolare di 4 sistemi alla scala temporale 100-ns. La dinamica dei sistemi è stata monitorata utilizzando le fluttuazioni quadratiche medie (RMSF) di ciascun residuo proteico e la distanza di legame idrogeno di H927 con U12 (Fig. 4). I nostri calcoli suggeriscono che la mutazione da I923 a V923 in MDA5 ha provocato una minore perturbazione della dinamica all'interno della regione di contatto dell'RNA (residui 923-934) e il ciclo di interazione interproteica (950-955) del complesso con dsRNA nativo (Fig. 4C) . Questa osservazione era simile nel caso della 2'-O-metilazione in U12, sebbene sia stato osservato un effetto più pronunciato nella dinamica complessiva della regione carbossi-terminale del mutante MDA5 V923 (Fig. 4D).

Considerando ora l'interazione chiave del legame idrogeno del residuo H927 adiacente con la base dell'uracile, le nostre simulazioni MD suggeriscono che la metilazione a 2′-O non la influenza nell'MDA5 nativo (Fig. 4E). Tuttavia, la mutazione V923 non influenza il legame idrogeno di H927 nel dsRNA nativo ma mostra un effetto destabilizzante in presenza di 2′-O-metilazione (Fig. 4F). Nel loro insieme, le nostre simulazioni MD suggeriscono che sebbene l'effetto della mutazione I923V di MDA5 nell'interazione con il dsRNA nativo sia marginale, il suo effetto nella dinamica e nella stabilità del complesso MDA5/RNA è più significativo quando l'uracile è 2′-O-metilato .

Discussione

Questo studio rappresenta un'indagine evolutiva e strutturale del ruolo della variante condivisa rs35667974 del locus autoimmune IFIH1, segnalata per portare a un fenotipo di funzionalità modificato per MDA5 (Downes et al. 2010). L'applicazione di modelli di sito evolutivo e di sito di diramazione per eseguire analisi di selezione positiva non indica siti di selezione positivi nei siti di interazione dell'RNA in cui risiede il polimorfismo rs35667974. Né i modelli del sito di diramazione indicano che alcuni siti particolari hanno subito una selezione positiva nel dominio CTD.

Ciò è in accordo con le frequenze di comparsa molto basse della variante Ile923Val anche tra la popolazione umana (Tabella 1). Tuttavia, la popolazione europea rispetto alle altre presenta una differenza nella frequenza dell'allele C di un ordine di grandezza. Senza trascurare la piccola dimensione del campione, la distribuzione geografica del polimorfismo in studio mostra che la sua comparsa nella popolazione europea come punto di partenza potrebbe essere dovuta a condizioni di vita e alimentazione che sono cambiate negli ultimi anni. L'indagine strutturale del ruolo dell'SNP esaminato è stata eseguita esaminando la struttura del complesso dsRNA-MDA5 (nativo e mutante).

A livello di formazione del complesso dsRNA-MDA5 l'introduzione della mutazione Ile923Val influenza l'interazione del dominio C-terminale della proteina (CTD) con il dsRNA con l'introduzione di una cavità idrofobica accanto allo zucchero ribosio dell'unico filamento del dsRNA . Abbiamo dimostrato che nel caso dell'RNA metilato alla catena fosforibosilica di un filamento, ulteriori effetti dinamici possono influenzare l'interazione del mutante senza influenzare il tipo selvaggio. Ciò è in accordo con studi sperimentali (Looney et al. 2015; Brisse e Ly 2019) che mostrano che l'effetto del polimorfismo Ile923Val identificato in prossimità di un punto di interazione MDA5-dsDNA potrebbe non influenzare le proprietà native di legame del dsRNA ma alterato da 2.5-riduzione dell'attività catalitica (Shigemoto et al. 2009). Inoltre, gli studi di dinamica molecolare hanno dimostrato il ruolo critico della metilazione nel mutante riguardo alla mobilità e stabilità dei loop MDA5 941–959 e 970–977 coinvolti nell'interazione dsRNA e nell'interazione interproteica nella formazione del filamento MDA. Tali effetti possono ostacolare l'assemblaggio del filamento MDA5, l'associazione MDA5-MAVS e l'assemblaggio del filamento MAVS che attivano ulteriormente l'espressione dei geni dell'interferone di tipo I (IFN1: IFN e IFN ). Nei casi di T1D e PsA, di conseguenza, livelli ridotti di attività della proteina MDA5 e quindi una minore produzione di IFN proteggono dall'autoimmunità. Queste osservazioni suggeriscono che diverse varianti di IFIH1, previste per influenzare l'interazione di MDA5 con MAVS e la riduzione della produzione di IFN, ridurrebbero il rischio di malattie, mentre la normale funzione di MDA5 è associata a esse (Shigemoto et al. 2009).

Ciò porta alla conclusione che, come nel caso dell'RNA virale, la metilazione del self-dsRNA, una mutazione identificata dall'RNA, è un importante fattore di selezione/attivazione per l'introduzione di effetti protettivi in ​​alcune malattie autoimmuni. I risultati del presente studio ampliano la conoscenza del significato biologico di rs35667974 SNP del locus IFIH1 nello sviluppo delle suddette malattie e sottolineano l'importanza degli studi sui geni condivisi da più malattie autoimmuni. Tuttavia, negli studi sulla popolazione per l'associazione genetica di SNP con malattie autoimmuni, utilizzando, ad esempio, PCR-RFLP, sequenziamento o chip di genotipizzazione, un caso di metilazione dell'RNA non viene preso in considerazione. E' quindi importante conoscere lo stato di metilazione del dsRNA interagente e il suo effetto sull'allele MDA5. Come nel caso del riconoscimento del dsRNA virale (Wu et al. 2013) e della distinzione tra mRNA self e non self (Züst et al. 2011), la perdita di un gruppo metilico dall'MDA5 interagente, come nel caso del mutante Ile923Val MDA5, può influenzare la formazione del filamento e l'induzione dell'interferone di tipo I.

Da notare, Plenge et al. (2013) avevano precedentemente discusso il potenziale di una variante rara in un gene di malattia causale per rappresentare un bersaglio terapeutico putativo per l'intervento farmaceutico. A tal fine, la funzione biologica della variante causativa deve essere nota in ogni tentativo di collegare le scoperte genetiche con un nuovo bersaglio terapeutico. Pertanto, individuare la posizione di una variante causativa nella struttura 3D della rispettiva proteina e indagare il suo ruolo dal punto di vista strutturale/funzionale in un percorso patogenetico che porta a una malattia autoimmune sembra essere di fondamentale importanza per l'ulteriore gestione e un migliore trattamento di i pazienti. Rimane un supremo bisogno di andare oltre la scoperta degli SNP associati a una più profonda comprensione delle varianti causali per chiarire i meccanismi molecolari e le vie della malattia. È necessaria un'ulteriore analisi strutturale-funzionale per studiare il legame del ribosio -2′-Ο-metilato self-dsRNA a MDA5 e in che modo ciò influisce sull'assemblaggio della fibrilla MDA5. L'inafferrabile ruolo biologico 2′-Ο-metilato dell'mRNA come sensore di distinzione tra virale e self-mRNA nell'induzione dell'interferone di tipo I potrebbe essere stato esteso a un sensore protettivo in alcune autoimmunopatie.

Conclusione

Il raro polimorfismo del gene rs35667974 IFIH1 protegge da T1D, PS e PsA, mentre l'allele IFIH1 portato dalla maggior parte della popolazione predispone alle malattie. Il finanziamento che il mutante Ile923Val MDA5 funzioni in modo diverso nell'interazione con il self-dsRNA e in particolare con quello 2′-O-metilato suggerisce che in alcuni casi le varianti che interagiscono con il dsRNA metilato interrompono la formazione del filamento MDA5, l'interazione MAVS e la formazione del filamento, e La segnalazione IFN, come nella risposta antivirale dell'ospite, potrebbe essere stata selezionata negativamente perché conferisce protezione dalle malattie.

Contributi d'autore

Concettualizzazione: AA, AP, EEE e GNG, metodologia: AA, AP e EEE, convalida: AA, AP, MIZ, GNG e EEE, indagine: GNG, AA, AP e MIZ, risorse: GNG, AA, AP e MIZ, cura dei dati — AA e AP, scrittura e preparazione della bozza originale — EEE, GNG, AA, AP e MZ, scrittura, revisione e modifica del manoscritto — AA, AP, MZ, GNG e EEE, visualizzazione: AA, AP e EEE, supervisione: EEE e acquisizione di finanziamenti: EEE. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento

Il finanziamento ad accesso aperto è fornito da HEAL-Link Grecia. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto "INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization" (Grant MIS 5002550), che è implementato nell'ambito dell'azione "Rafforzamento dell'infrastruttura di ricerca e innovazione", finanziato dal Programma Operativo "Competitività, Imprenditorialità e Innovazione" (NSRF 2014–2020) e cofinanziato dalla Grecia e dall'Unione Europea (Fondo Europeo di Sviluppo Regionale).

Disponibilità dei dati

I set di dati utilizzati e/o analizzati durante il presente studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta.

Dichiarazioni

Conflitto d'interesse

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto o nella decisione di pubblicare i risultati.

Approvazione etica

Non applicabile.

Consenso a partecipare

Non applicabile.

Consenso alla pubblicazione

Non applicabile.

Accesso libero

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Riferimenti

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) Parametri del campo di forza AMBER per i nucleosidi modificati presenti in natura nell'RNA. J Chem Theory Comput 3: 1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST e PSI-BLAST: una nuova generazione di programmi di ricerca di database proteici. Acidi nucleici Res 25: 3389-3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Approfondimenti strutturali ed evolutivi all'interno della famiglia del gene polisaccaride deacetilasi di bacillus anthracis e bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Identificazione di un'idrolasi nucleosidica 2′-O-metiluridina utilizzando le librerie metagenomiche. Molecole.

5.Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) La banca dati delle proteine. Acidi nucleici Ris 28:235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Un metodo di massima verosimiglianza per rilevare la divergenza funzionale nei singoli siti del codone, con applicazione all'evoluzione della famiglia genica.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Geni che mediano le interazioni ambientali nel diabete di tipo 1.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: un database di percorsi di modifica dell'RNA. Aggiornamento 2017. Acidi nucleici Ris 46: D303-D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Struttura comparativa e analisi funzionale dei recettori simili a RIG-I: RIG-I e MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Un raro allele codificante in IFIH1 è protettivo per l'artrite psoriasica. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

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