Isolamento e quantificazione del ginsenoside Rh23, un nuovo composto anti-melanogenico dalle foglie del Panax Ginseng

Astratto:

Un nuovo ginsenoside, chiamato ginsenoside Rh23 (1), e 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentaidrossidammar-23-ene (2) sono stati isolati dalle foglie di Panax ginseng idroponico. I composti sono stati isolati mediante varie cromatografie su colonna e le loro strutture sono state determinate sulla base di metodi spettroscopici, tra cui spettrometria di massa quadrupolare/tempo di volo ad alta risoluzione (HR-QTOF/MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettroscopia a infrarossi (IR) . Per determinare l'attività anti-melanogenica, è stata testata la variazione del contenuto di melanina nelle cellule Melan-a trattate con composti identificati.

Inoltre, abbiamo studiato gli effetti inibitori della melanina del ginsenoside Rh23 sulla pigmentazione in un modello in vivo di zebrafish. Il composto 1 ha inibito la potente melanogenesi nelle cellule melan-a con un'inibizione della melanogenesi del 37,0 percento a 80 µM e ha anche presentato un'inibizione sulla pigmentazione del corpo nel modello di pesce zebra. Sebbene il composto 2 abbia mostrato un'attività inibitoria leggermente inferiore rispetto al composto 1, ha anche mostrato una melanogenesi significativamente ridotta nelle cellule Melan-a e nel modello di pesce zebra. Questi risultati hanno indicato che i composti isolati dal P. ginseng idroponico possono essere utilizzati come nuovi composti sbiancanti per la pelle attraverso i sistemi in vitro e in vivo. Inoltre, questo studio ha dimostrato l'utilità del composto 1 basato su MS per l'analisi quantitativa. Il ginsenoside Rh23 (1) è stato trovato a un livello di 0,31 mg/g nelle foglie di P. ginseng idroponico.

Per la melanina, abbiamo scoperto che Cistanche può ridurre significativamente l'attività della tirosinasi, che è il principale enzima limitante la velocità nella biosintesi della melanina cutanea ed è un complesso di rame e proteine. Può idrossilare la tirosina, la principale materia prima per la produzione di melanina nel corpo, per produrre L-dopa e quindi ossidare la dopa in dopachinone. Il dopachinone subisce una serie di processi metabolici, si riorganizza e polimerizza e infine si combina con le proteine ​​combinate per produrre una serie di pigmenti di melanina che causano l'imbrunimento. La melanina è il fattore più importante nel determinare il colore della pelle del corpo umano. Una sintesi eccessiva può causare la formazione di malattie della pelle pigmentata come lentiggini, cloasma, macchie senili e melanoma. Pertanto, attraverso la ricerca sull'inibizione dell'attività della tirosinasi, è possibile selezionare gli ingredienti efficaci per inibire la pigmentazione della pelle, quindi si può vedere che i glicosidi totali di Cistanche deserticola hanno l'effetto di inibire la pigmentazione della pelle e sbiancare la bellezza.

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Parole chiave:

ginsenoside Rh23; Panax ginseng; RMN; UPLC-QTOF/MS; pesce zebra; analisi quantitativa.

1. Introduzione

Panax ginseng CA Meyer è un'erba medicinale tradizionale molto famosa nei paesi asiatici. Panax deriva da una "panacea", che significa un toccasana per tutte le malattie. P. ginseng è una pianta erbacea perenne appartenente alla famiglia delle Araliaceae[1]. Le radici di P. ginseng di quattro-sei anni sono utilizzate principalmente per scopi terapeutici. I fiori sbocciano a giugno e le foglie hanno una forma a palato. P. ginseng è stato coltivato principalmente in Asia orientale, tra cui Corea, Cina e Giappone [2]. Ad oggi, sono stati riportati molti studi sui costituenti chimici di radici, foglie e bacche di ginseng; sono stati isolati più di 100 tipi di ginsenosidi. Sono state segnalate varie bioattività di P. ginseng, come il potenziamento dell'attività immunomodulatoria, il rafforzamento nutrizionale, il miglioramento della funzionalità epatica, le attività antidiabetiche, antitumorali, antiapoptotiche e antiossidanti [3-10].

Attualmente, l'interesse per i prodotti agricoli di alta qualità legati al benessere sta gradualmente aumentando, portando alla coltivazione idroponica del ginseng. La coltivazione idroponica presenta i vantaggi di un semplice processo di coltivazione e di un periodo di crescita più breve rispetto alla coltivazione in terra. Il ginseng idroponico richiede solo 2-4 mesi in un sistema che controlla la temperatura, è privo di pesticidi, umido, leggero, ha ingredienti organici, ecc. [11]. Le foglie del ginseng coltivato in terra non vengono utilizzate per scopi medicinali e vegetali funzionali, mentre possono essere utilizzate le foglie del ginseng idroponico.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. In conclusione, le condizioni idroponiche hanno portato a un elevato contenuto di ginsenosidi e il contenuto totale di ginsenosidi nelle foglie era significativamente più alto che nelle radici, suggerendo che le foglie di ginseng potrebbero essere una buona fonte di verdure funzionali ed erbe medicinali.

Diversi composti sbiancanti noti, come l'arbutina e l'acido cogico, sono stati studiati per la loro efficacia nel ridurre la melanogenesi [13]. Sfortunatamente, è necessario trovare agenti sbiancanti per la pelle più sicuri ed efficaci, a causa del potenziale cancerogeno dell'acido cogico e sia della sicurezza che degli effetti collaterali dell'arbutina [14]. Pertanto, è stata costantemente prestata molta attenzione allo sviluppo di nuovi prodotti naturali nell'industria cosmetica [15,16]. Diversi studi hanno riportato l'inibizione della sintesi di melanina da P. ginseng coltivato nel terreno [17-20].

Tuttavia, questi studi sono stati riportati con composti ben noti, come acido cinnamico e composti fenolici, e l'attività sbiancante non è stata segnalata dalle foglie di P. ginseng idroponico (HPGL). Il nostro lavoro in corso ha portato all'isolamento di ginsenosidi minori da HPGL. Di solito, i ginsenosidi in quantità minori o in tracce non possono essere rilevati con l'HPLC. In caso contrario, il tempo analitico è molto lungo, il che non è conveniente per qualificare i ginsenosidi nelle spezie al ginseng [21,22]. Per quantificare rapidamente nuovi composti, dovrebbe essere stabilito un metodo rapido e sensibile, in grado di rilevare accuratamente le tracce di nuovi composti. Nel presente studio, è stata stabilita una cromatografia liquida sensibile ad altissime prestazioni accoppiata con il metodo di spettrometria di massa quadrupolo/tempo di volo (UPLC-QTOF-MS) per quantificare il nuovo composto.

Sulla base della descrizione di cui sopra, in questo lavoro, l'isolamento e l'identificazione di un nuovo composto, comprese le proprietà fisiche e la quantificazione, sono stati rivelati mediante metodi spettroscopici e le loro attività anti-melanogeniche sono state studiate attraverso sistemi in vitro e in vivo.

2. Risultati e discussione

Le foglie di Panax ginseng idroponico (HPGL) sono state estratte con MeOH acquoso e suddivise rispettivamente nelle frazioni di acetato di etile (EtOAc), n-butanolo (n-BuOH) e H2O. Ripetute cromatografie su colonna di SiO2 e ODS della frazione n-BuOH hanno fornito un nuovo ginsenoside (1) e un raro ginsenoside (2) è stato isolato dalla frazione EtOAc di HPGL.

Il composto 1, polvere bianca (metanolo), ha mostrato un colore viola sulla TLC, spruzzando l'10 percento di H2SO4 e riscaldandolo. La formula molecolare è stata determinata come C37H64O10 dal picco ionico quasi molecolare m/z 713,44723 [M più COOH]− nel QTOF/MS negativo. Lo spettro IR ha suggerito la presenza di un gruppo idrossile (3377 cm-1) e un doppio legame (1647 cm-1). Lo spettro 1H-NMR (Tabella 1 e materiali supplementari) mostrava due segnali di protone di metina olefina (δH 6.02, 5.64), tre segnali di protone di metina ossigenata (δH 4.38, 4.03, 3.49), un segnale di protone metossi (δH 3.18) e otto segnali di protone metile singoletto (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), che indicano che il composto 1 ha una frazione triterpenica tetraciclica che include un doppio legame con conformazione trans e tre gruppi idrossilici.

Inoltre, è stato confermato che il composto 1 è un tipo di protopanaxatriolo (PPT) dallo spostamento chimico di un segnale di protone metilico a δH 1,94 (H-28). Lo spostamento chimico di H-28 nel tipo protopanassadiolo (PPD) è solitamente osservato a ca δH 1.30 [23]. Inoltre, un segnale protonico emiacetale (δH 5.15) e diverse metine ossigenate e segnale protonico metilene a δH 4.45–3.95 sono stati osservati come segnali di una porzione di zucchero. Dalla costante di accoppiamento del segnale del protone anomero (J=7.6 Hz), sia il protone emiacetale che H-2 della porzione di zucchero erano in una disposizione assiale. La combinazione dei dati sopra menzionati ha concluso che il composto 1 è un aminoglicoside protopanassatriolo. Lo spettro 13C-NMR ha mostrato 37 segnali di carbonio dovuti a frazioni triterpeniche, metossi ed esose. Due carboni di olefina metina (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), un carbonio quaternario ossigenato (δC 74,9 (C-25)), tre carboni di metina ossigenato (δC 78,5 (C-3), 7{{9{0}}.3 (C-12), 67,7 (C-6)), un carbonio metossilico (δC 50,2 ( 25-OCH3)) e otto atomi di carbonio metilico (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17.6 (C-18), 17.4 (C-19), 17.3 (C-30), 16.4 (C-29)) sono stati osservati per il frazione aglicone. I dati NMR del composto 1 erano simili a quelli del composto 2, ad eccezione dello spostamento chimico per un carbonio quaternario ossigenato, cioè C-25. Inoltre, lo zucchero è stato identificato come -glucopiranosio dai segnali di carbonio emiacetale (δC 98.3, (C-10 ), quattro metine ossigenate (δC 78.9 (C-30 ), 78.2 (C{{82 }} ), 75,2 (C-20 ), 71,6 (C{-40 )) e un metilene ossigenato (δC 63,0 (C-60 )). Negli spettri di correlazione del legame multiplo eteronucleare gradiente (gHMBC), è stata osservata una correlazione a lungo raggio tra il segnale del protone anomerico (δH 5.15 (H-10)) e il segnale del carbonio quaternario ossigenato dell'aglicone (δC 83.0 (C -20)), indicando che il -glucopiranosio era legato all'ossidrile di C-20 (Figura 1).

Inoltre, la correlazione tra il segnale del protone metossi (δH 3.18 (25-OCH3)) e il segnale del carbonio quaternario ossigenato (δc 74.9 (C-25)) indicava che il metossi era legato a C{{ 7}} (Figura 1). Sulla base dei dati di cui sopra, la struttura chimica di 1 è stata determinata come 20-O- -D-glucopiranosile-3 ,6 ,12 ,20 -tetraidrossi-25- methoxydammar-23-ene, e chiamato ginsenoside Rh23. Il composto 2 è stato identificato come 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentaidrossidammar-23-ene dai confronti di NMR e Dati MS con quelli riportati in letteratura [23,24] (Figura 1). I composti 1 e 2 sono stati, per la prima volta, isolati da HPGL.

La purezza del ginsenoside Rh23 è stata determinata essere superiore al 99% dalla normalizzazione delle aree di picco rilevate dall'analisi UPLC. Poiché UPLC-OTOF/MS ha dimostrato di essere uno strumento adatto per l'identificazione del ginsenoside Rh23, la separazione dei costituenti nell'estratto HPGL è stata eseguita da UPLC-OTOF/MS in modalità ioni negativi. La Figura 2 mostra un tipico cromatogramma ionico totale (TIC) di ginsenoside Rh23 ed estratto con rilevamento di massa.

È stata ottenuta una curva di calibrazione lineare per ginsenoside Rh23 a diversi livelli di concentrazione. Le caratteristiche dei grafici di calibrazione sono riassunte nella Tabella 2. Come si vede nella tabella, il ginsenoside Rh23 mostra ottimi coefficienti di correlazione. I conteggi del rivelatore (area relativa del picco) erano linearmente dipendenti dalla concentrazione del campione nell'intervallo di 0.02–0.8 µg/mL per il ginsenoside Rh23. I LOD del ginsenoside Rh23 erano 0.002 ppm. I LOQ del ginsenoside Rh23 sono stati determinati a 0,005 ppm mediante UPLC-QTOF/MS in modalità ioni negativi. La quantità di ginsenoside Rh23 nell'HPGL ottenuta utilizzando metodi di validazione (Tabella 2) era di 0,319 mg/g.

Per determinare l'attività anti-melanogenica, è stata studiata la variazione del contenuto di melanina nelle cellule melan-a trattate con composti purificati e identificati. Le cellule mela-a sono state trattate per 72 ore con i composti 1 e 2 a concentrazioni comprese tra 0 e 80 µM e la vitalità cellulare è stata valutata tramite un kit di analisi della vitalità cellulare CCK-8. La vitalità cellulare dei composti 1 e 2 a una concentrazione di 80 µM per la cellula melan-a era rispettivamente superiore al 98,1% e al 97,8% (dati non mostrati). Questi risultati indicano che i composti 1 e 2 hanno una natura non citotossica. L'effetto delle attività anti-melanogeniche dei composti è mostrato nella Figura 3. L'inibizione della sintesi di melanina del composto 1 a 20, 40 e 80 µM era dell'8,4%, 15,6% e 37,0% rispetto al controllo. Il composto 2 ha mostrato un'attività inibitoria leggermente inferiore rispetto al composto 1 rispettivamente al 7,6%, 12,8% e 17,8% a 20, 40 e 80 µM. Entrambi i composti hanno inibito la sintesi della melanina in modo dose-dipendente.

In particolare, il composto 1 ha mostrato la più alta attività inibitoria della melanina, 37,0 percento a una concentrazione di 80 µM. Secondo quanto riferito, l'estratto di radix ginseng a 0-1000 µg/mL non ha mostrato alcuna significativa inibizione della melanina [19], e l'acido cinnamico, un agente sbiancante che si trova principalmente in P. ginseng, ha mostrato un'inibizione del 29% della sintesi di melanina a 675 µM. [20]. Rispetto all'estratto di radix ginseng e acido cinnamico, il composto 1 ha mostrato una potente attività inibitoria della sintesi della melanina e ha persino mostrato un'attività inibitoria della sintesi della melanina 1.2-volte superiore a una concentrazione otto volte inferiore rispetto all'acido cumarico [ 17,20].

Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato altamente vantaggioso a causa dei suoi sistemi di organi e sequenze geniche simili agli esseri umani [25]. Inoltre, l'uso di embrioni di pesce zebra sta ricevendo una crescente attenzione poiché sono considerati un metodo sostitutivo per gli esperimenti sugli animali [26]. I pesci zebra hanno pigmenti di melanina sulla superficie, consentendo una semplice osservazione del processo di pigmentazione senza complicate procedure sperimentali [27].

Pertanto, abbiamo studiato gli effetti inibitori della melanina del composto 1 sulla pigmentazione del pesce zebra. Abbiamo usato PTU (N-feniltiourea; un inibitore della tirosinasi contenente zolfo) come controllo positivo (Figura 4B), che è ampiamente utilizzato nella ricerca sui pesci zebra [28,29]. Come mostrato nella Figura 4C, il trattamento D, 40 e 80 µM con il composto 1 ha prodotto una notevole inibizione della pigmentazione del corpo del pesce zebra, che ha ridotto notevolmente il contenuto totale di melanina rispetto al veicolo di controllo (Figura 4A).

In questo studio, abbiamo isolato il romanzo ginsenoside Rh23 (1) dalle foglie idroponiche di P. ginseng. Finora sono stati segnalati più di 100 ginsenosidi da specie di ginseng. Tuttavia, i 25-ginsenosidi idrossilati si trovano raramente in natura, anche nelle piante di ginseng. Inoltre, non era stata segnalata attività sbiancante. L'attività inibitoria del ginsenoside Rh23 ha mostrato il 37 percento alla concentrazione di 80 uN senza citotossicità cellulare nelle cellule melan-a, mentre nessuna inibizione dell'attività della tirosinasi dei funghi in vitro è stata osservata dal ginsenoside Rh23 (dati non mostrati). Recentemente, gli estratti o i ginsenosidi purificati dalle radici e dalle foglie di ginseng hanno dimostrato di possedere ampiamente proprietà antiossidanti (30,31), mentre l'acqua o l'estratto organico di ginseng ha mostrato attività di scavenging verso DPPH, anione superossido e radicale idrossile (32). Pertanto, il nostro nuovo ginsenoside Rh23 isolato dalle foglie di P. ginseng idroponico potrebbe avere una tirosinasi sottoregolata per la sua proprietà antiossidante. Tuttavia, il suo ruolo nella melanogenesi non è stato ancora studiato. Pertanto, in ulteriori studi, è necessario determinare i meccanismi precisi dell'azione del ginsenoside Rh23 sulla regolazione della sintesi di melanina.

3. Sperimentale

3.1. Generale

Le resine Kieselgel 60 e LiChroprep RP-18 sono state utilizzate per la cromatografia su colonna (Merck, Darmstadt, Germania). Kieselgel 60 F254 (Merck) e RP-18 F254S (Merck) sono stati usati come fasi solide per l'esperimento TLC. Il rilevamento dei punti sulla piastra TLC è stato eseguito mediante osservazione sotto una lampada UV (Spectroline, modello ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA) o spruzzando H2SO4 acquoso al 10% sulla superficie sviluppata piatto seguito dal riscaldamento. Le rotazioni ottiche sono state misurate utilizzando un polarimetro digitale JASCO P-1010 (Tokyo, Giappone). I punti di fusione sono stati ottenuti utilizzando un Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher scientific company, Pittsburgh, PA, USA) con un microscopio. Gli spettri ultravioletti sono stati misurati su uno spettrofotometro UV -1601 modello Shimadzu (Shimadzu Corp., Kyoto, Giappone). Gli spettri IR sono stati ottenuti da uno spettrometro Perkin Elmer Spectrum One FT-IR (Buckinghamshire, Regno Unito). Gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). L'analisi UPLC-QTOF/MS è stata eseguita utilizzando una serie Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, USA) operante in modalità ioni negativi.

3.2. Materiali vegetali

Il Panax ginseng idroponico è stato coltivato nella serra del Department of Herbal Crop Research situato a Eumseong, nella provincia di Chungbuk, secondo il protocollo della "Guida alla coltivazione standard GAP del ginseng" [11,33] sviluppata dall'Amministrazione per lo sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Radici di piantine di ginseng di un anno del peso di 0,8 a 1 g sono state acquistate dal Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science (NIHHS), Rural Development Administration (RDA) e conservate in un camera a bassa temperatura (1–2 ◦C) prima dell'uso. Le radici della piantina di ginseng sono state trapiantate in bagni di nutrienti e coltivate nel sistema idroponico. Dopo tre mesi di coltura, i ginseng idroponici sono stati estratti per la raccolta. Le piante di ginseng idroponico raccolte sono state lavate via dalla polvere con acqua e smistate in foglie e radici, che sono state poi essiccate per 72 ore in un liofilizzatore (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Corea). Un esemplare di voucher (NIHHS14-03) è stato depositato presso l'erbario del Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong, Repubblica di Corea.

3.3. Estrazione e isolamento

Le foglie essiccate e polverizzate di P. ginseng idroponico (HPGL, 6 kg) sono state estratte con l'80% di MeOH (30 L × 3) a temperatura ambiente per 24 ore. Gli estratti sono stati filtrati attraverso carta da filtro ed evaporati a pressione ridotta a 45°C per ottenere 1,4 kg di estratto. L'estratto è stato versato in H2O (3L) ed estratto successivamente con EtOAc (3 L × 3) e n-BuOH (2,6 L × 3). Ogni strato è stato concentrato a pressione ridotta per ottenere frazioni EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) e H2O (855 g).

La frazione n-BuOH (HPGLB, 130 g) è stata applicata alla colonna di gel di silice (φ 13 × 17 cm) ed eluita con CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) per ottenere 20 frazioni (da HPGLB1 a HPGLB20). Le frazioni HPGLB3 e HPGLB4 sono state combinate (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12) e ulteriormente frazionate sulla colonna di gel di silice (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) per ottenere 14 frazioni (da HPGLB3-1 a HPGLB3-14). Le frazioni HPGLB3-4 e HPGLB3-5 sono state combinate (1,27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0,16) e ulteriormente frazionate sulla colonna ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) per ottenere nove frazioni (da HPGLB3-4-1 a HPGLB3-4-9). La frazione HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0,26) è stata ulteriormente frazionata sulla colonna ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) per ottenere nove frazioni (da HPGLB3-4-3-1 a HPGLB3-4-3-9) incluso il composto 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Le frazioni da HPGLB5 a HPGLB7 sono state combinate (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22) e ulteriormente frazionate sulla colonna di gel di silice (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) per ottenere 16 frazioni (da HPGLB5-1 a HPGLB5-16). La frazione HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0.28–0,31) è stata ulteriormente frazionata sulla colonna ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) per ottenere dieci frazioni (da HPGLB5-6-1 a HPGLB5-6-10) incluso il composto 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Dati spettroscopici

Composto 1. Polvere bianca, pf: 138–140 ◦C; [ ] 25 D più 17.4◦ (c=0.39, MeOH); IR (finestra CaF2): 3377, 2932, 1382 cm-1; QTOF/MS negativo m/z 713,44723 [M più COOH]− (calcolato per C37H64O10, 668,4499); Dati 1H- e 13C-NMR, vedere la Tabella 1.

Composto 2. Polvere bianca, pf: 133–136 ◦C; [ ] 25 D più 20.2◦ (c=0.50, MeOH); IR (finestra CaF2): 3359, 2929, 1384 cm-1; QTOF/MS negativo m/z 699.48311 [M più COOH]− (calcolato per C36H62O10, 654.4323); dati 1H- e 13C-NMR, vedere Tabella 1.

3.5. Analisi quantitativa del nuovo composto 1 utilizzando UPLC-QTOF/MS

Una soluzione madre standard del composto 1 è stata preparata sciogliendo 1.00 mg ciascuno in 1 mL di metanolo per ottenere una concentrazione di 1.00 mg/mL ed è stata mantenuta a 4 ◦C. La soluzione madre standard (1) è stata diluita con metanolo per ottenere soluzioni di calibrazione con intervalli di 0.{{10}}2–0.8 µg/mL, rispettivamente. Un grammo di estratto HPGL è stato accuratamente pesato e sciolto in volumi fissi (10 mL) di metanolo, filtrato attraverso una carta da filtro di 0,20 mm e refrigerato a 4 ◦C . L'UPLC è stato eseguito utilizzando un UPLC Waters ACQUITY H-Class (Waters Corp., Milford, MA, USA) con una colonna ACQUITY BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Le fasi mobili erano costituite da acqua (A) con acido formico allo 0,1% (v/v) e acetonitrile (B) con acido formico allo 0,1% (v/v). Il gradiente di eluizione era il seguente: 0–4 min, B 10–30%; 4–15 min, B 30–60 percento; 15-16 min, B 60-100 percento; 16-19 min, B 100-10 percento . La portata era di 0,45 mL/min e il volume di iniezione era di 2 µL per ciascuna corsa.

Successivamente, l'analisi HR-MS è stata eseguita utilizzando un Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, USA) operante in modalità ioni negativi. Gli spettrometri di massa hanno eseguito scansioni alternate ad alta e bassa energia note come modalità di acquisizione MSE. Sono state ottenute misurazioni di massa accurate utilizzando un sistema di erogazione di calibrazione automatizzato contenente Leucine enkephalin, m/z 554.262 (ESI neg. mode) come riferimento interno. I parametri operativi ottimali sono stati impostati come mostrato nella Tabella 3.

3.6. Coltura cellulare

I melanociti melanociti sono una normale linea cellulare di melanociti murini altamente pigmentata, immortalata, derivata da topi C57BL/6. Le cellule melan-a utilizzate in questo studio sono state ottenute dalla dott.ssa Dorothy Bennett (St. George's Hospital, Londra, Regno Unito). Le cellule sono state coltivate a 37°C in un'atmosfera al 95% di aria, al 10% di CO2 in mezzo RPMI 1640 integrato a una concentrazione finale con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% di penicillina/streptomicina e 200 nM di PMA. La vitalità cellulare è stata determinata mediante il kit di conteggio cellulare CCK-8-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Giappone).

3.7. Analisi della melanina

Le cellule melano-a sono state trattate con composti per 72 ore, quindi le cellule sono state sciolte in 1 N NaOH a 60 °C per 30 minuti. Quindi, i lisati sono stati misurati a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro. I dati sono stati normalizzati al contenuto proteico dei lisati cellulari. I lisati cellulari sono stati successivamente elaborati per la determinazione della concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi proteica BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).

3.8. Origine e mantenimento dei pesci parentali

I pesci zebra adulti sono stati ottenuti da un commerciante commerciale e 10-15 pesci sono stati tenuti in una vasca acrilica da 5 L con le seguenti condizioni: 28,5 °C, con un ciclo luce/buio di 14/10 ore. I pesci zebra sono stati nutriti tre volte al giorno, sei giorni alla settimana, con mangime in scaglie TetraMin integrato con artemia salina (Artemia salina). Gli embrioni sono stati ottenuti dalla deposizione delle uova naturale che è stata indotta al mattino accendendo la luce. La raccolta degli embrioni è stata completata entro 30 min. Tutti i protocolli e le procedure sperimentali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida e i regolamenti approvati dal Comitato per l'etica degli animali della Chungnam National University (CNU-00866).

3.9. Trattamento dei composti e valutazione basata sul fenotipo

Gli embrioni sincronizzati sono stati raccolti e disposti mediante pipetta (7-9 embrioni per pozzetto in 24- pozzetti contenenti 1 mL di terreno embrionale). I composti del test sono stati sciolti in 0,1% di DMSO e quindi aggiunti al mezzo embrionale da nove a 72 ore post-fecondazione (hpf) (63 ore di esposizione). Gli effetti sulla pigmentazione del pesce zebra sono stati osservati allo stereomicroscopio. L'agitazione occasionale, così come la sostituzione del mezzo, è stata eseguita giornalmente per garantire la distribuzione uniforme dei composti. In tutti gli esperimenti, 0.2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU) è stato utilizzato per generare zebrafish trasparente senza interferire nel processo di sviluppo [33] ed è stato considerato un controllo positivo standard. Le valutazioni basate sul fenotipo della pigmentazione corporea sono state dechorionate da pinze, anestetizzate in soluzione di metansolfonato di tricaina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), montate in metilcellulosa al 3% su un piatto da 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Corea), e fotografato con lo stereomicroscopio MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania).

4. Conclusioni

In questo studio, il ginsenoside Rh23 (1) è stato isolato da foglie idrofoniche di Panax ginseng insieme a 20-O- -D-glucopiranosile-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentaidrossidammar-23-ene (2). Abbiamo avuto generalmente successo nel nostro tentativo di ottenere l'effetto ipo pigmentario dei composti dal P. ginseng idroponico. Ginsenoside Rh23 e 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentaidrossidammar23-ene hanno attività inibitoria sulla biosintesi della melanina senza effetti citotossici in melan-una cella. Inoltre, il ginsenoside Rh23 ha migliorato la depigmentazione del pesce zebra come modello animale alternativo. La diminuzione del contenuto di melanina e della pigmentazione nel corpo può avere il potenziale per l'attività sbiancante e l'effetto non citotossico è il punto più favorevole perché la sicurezza è una considerazione primaria per gli agenti sbiancanti nei prodotti cosmetici.

Pertanto, sulla base dei nostri risultati attuali, è importante che i nuovi composti idrofonici di P. ginseng possano essere utilizzati come un potenziale efficace agente illuminante per la pelle. Ulteriori studi chiariranno i meccanismi precisi dell'azione del ginsenoside Rh23 sulla regolazione della sintesi di melanina e la relazione tra le caratteristiche strutturali del ginsenoside Rh23 e la melanogenesi, per accertare se sia un potenziale agente sbiancante per l'industria cosmetica. I vantaggi della spettrometria di massa ibrida Q-TOF includono non solo la capacità e la sensibilità di rilevamento della qualità, ma anche misurazioni accurate, rendendo più facili le delucidazioni strutturali. Può essere utilizzato per la determinazione qualitativa e quantitativa di composti minori o nuovi, che aiuta a migliorare il controllo di qualità delle spezie al ginseng.

Materiali supplementari:

Gli spettri 1H-NMR e 13C-NMR di 1 sono disponibili nei materiali supplementari.

Ringraziamenti:

Questo lavoro è stato condotto con il supporto del "Programma di ricerca cooperativa per lo sviluppo delle scienze e delle tecnologie agricole" (PJ01136203), Amministrazione per lo sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Ringraziamo Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) per aver condiviso la struttura del pesce zebra.

Contributi dell'autore:

DYL e N.-IB hanno concepito e progettato gli esperimenti; H.-GK e Y.-GL hanno isolato i composti; DYL ha chiarito le strutture; I.-BJ ha contribuito alla preparazione dei materiali vegetali; JHK ha eseguito il saggio biologico e ha contribuito alla preparazione del manoscritto; JWL e B.-RC hanno eseguito gli NMR e UPLC-QTOF/MS dei campioni; G.-SK ha assistito alla revisione del manoscritto; e DYL ha scritto il documento e gestito il progetto di ricerca. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Conflitto di interessi:

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse. Gli sponsor fondatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; raccolta, analisi o interpretazione dei dati; scrittura del manoscritto; o la decisione di pubblicare i risultati.

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Disponibilità del campione:

Campioni dei composti 1 e 2 sono disponibili presso gli autori.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 e Nam-In Bak 2,*

1 Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Eumseong 27709, Corea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Dipartimento di biotecnologia della medicina orientale, Kyung Hee University, Yongin 17104, Corea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Ricevuto: 28 novembre 2017; Accettato: 26 gennaio 2018; Pubblicato: 29 gennaio 2018

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