Analisi del tubolare prossimale e del glomerulo del rene
Mar 15, 2022
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Proteomica quasi unicellulare Profilazione del tubolare prossimale e del glomerulo del rene umano normale--Parte II
Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Giuliana Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Isabella Damm1, Svastica Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* e Minnie M. Sarwal1* per il Consorzio Kidney Precision Medicine Project (KPMP).
Risultati
La raccolta del rene congelato OCT è il metodo preferito per la proteomica del tessuto renale
Per la stessa quantità di tessuto in ingresso, OCT congelatoreneha prodotto più proteine rispetto alle sezioni FFPE dallo stesso rene (OCT congelato: 1871 ± 92 vs. FFPE: 296 ± 10 ng di proteina; p <0,0017) suggerendo una possibile degradazione proteica in FFPE, nonostante il tessuto sia incorporato nella paraffina blocchi per<2 months.="" bulk="" proteomics="" data="" from="" the="" two="" human="">reni(#1, #2) hanno dimostrato una sovrapposizione significativa delle proteine identificate con l'84% di sovrapposizione tra i 2 reni OCT (limite di riproducibilità=13.52, 97,96% di valori entro il limite di riproducibilità) e l'83% di sovrapposizione dello stesso rene proteine tra i 2 reni FFPE (limite di riproducibilità=24.43, valori del 98,5% entro il limite di riproducibilità) (tabella supplementare 1 e figura 2B). All'interno di ciascun rene, indipendentemente dal metodo di conservazione dei tessuti, è stato conservato circa il 70 percento delle proteine strutturali del rene (per lo più a matrice extracellulare), suggerendo che alcune proteine sono state rilevate in modo più preferenziale da ciascun metodo. Per valutare quale arricchimento proteico si osserva tra diversi metodi di raccolta, abbiamo scoperto che la proteomica dei tessuti OCT ha prodotto più proteine con conteggi spettrali elevati Maggiore o uguale a 5 (odds ratio=1.460601; 95% intervallo di confidenza {{21} }.238969, 1.722593; p=4.472e-06), che potrebbe riflettere una migliore conservazione del tessuto renale nell'OCT (Figura 2C). L'analisi proteomica del tessuto OCT ha anche campionato più proteine uniche rispetto al tessuto FFPE (odds ratio=3.207089; intervallo di confidenza al 95%=2.371221, 4.370600; p=4.985e{{ 38}}) (Figura 2D). Inoltre, molte di queste proteine uniche sono risultate essere di bassa abbondanza ed è più probabile che vengano perse, anche con tempi di conservazione molto brevi del tessuto renale in FFPE. Indipendentemente dal metodo di conservazione dei tessuti, abbiamo notato che c'era una forte sovrapposizione nei percorsi biologici comuni. I percorsi includevano processi metabolici di piccole molecole (p=2.59E-121 per OCT e p=2.15E-109 per FFPE), processo metabolico dell'acido carbossilico (p {{47 }}.62E-80 per OCT e p=1.93 E-76 per FFPE), processi metabolici degli acidi organici (p=1.26E-76 per OCT e p=3.62E-80 per FFPE) e processi di metabolismo dei farmaci (p=7.90E-83 per OCT e p=4.01E{{64} } per FFPE). Questi dati evidenziano come la proteomica del tessuto renale sia altamente riproducibile, indipendentemente dal metodo di conservazione dei tessuti per i due metodi testati.
La proteomica del tessuto renale è altamente riproducibile sul tessuto renale congelato OCT trasportato
Abbiamo analizzato i dati generati nei due siti (UCSF e Ohio State University) che hanno seguito lo stesso protocollo per l'esecuzione della proteomica di massa, come descritto nella sezione dei metodi. Sorprendentemente, circa il 70 percento di proteine sono state comunemente identificate nello stessoreneelaborati in due siti diversi con conteggio spettrale maggiore o uguale a 5 (r=0.95, P < 0.0001)="" (dati="" grezzi="" forniti="" nella="" tabella="" supplementare="" 2).="" ancora="" più="" importante,="" i="">renispedito da un sito centrale ha prodotto dati altamente correlati (r=0.89, P=0.0001) (tabella supplementare 2), a supporto del fatto che i protocolli analitici di elaborazione dei tessuti in atto erano piuttosto robusti.
Ottimizzazione della cattura delle cellule renali mediante microdissezione a cattura laser (LCM)
Spessori variabili di sezioni OCT montate su vetrini PET dalle stesserene(n=2) sono stati testati a 5, 10 e 20 μm di spessore, in triplicato, per la ripetibilità LCM. La sezione da 10 μm è risultata essere la più ottimale nei test LCM seriali, utilizzando il sistema Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection (Cut Energy, 64; Cut Focus, 75). Le cellule tagliate sono state catturate su cappucci adesivi. Oltre alla ripetibilità del processo LCM, abbiamo anche riscontrato la massima efficienza di cattura delle celle catapultate con uno spessore della sezione OCT di 10 μm.
La proteomica delle cellule del sottocompartimento nel rene umano normale identifica proteine glomerulari e tubolari prossimali arricchite e uniche
Attraverso il 9 umano normalereniprocessed by nscProteomics, with input of an average of 10–40 cells input each/Glom and PT fraction, we identified an average of ~2,560 proteins/sample. Interestingly, ~20% of the total proteins assessed by nscProteomics, from either sub-compartment overlapped across compartments/cells and bulk tissue, representing likely housekeeping or more structural kidney proteins that are not compartment specific. In a direct comparison of the two sub-compartments, 208 proteins were enriched (>2 fold) in Glom, and 67 were completely unique to Glom (absent in PT); and conversely, 247 proteins were enriched (>2 volte) in PT e 25 erano unici per PT (assenti in Glom) (Tabella supplementare 3). Nonostante il set di campioni relativamente piccolo, abbiamo anche eseguito una convalida incrociata, trattando ogni batch di esecuzioni come un set indipendente. Anche con un piccolo set unico direni(2 nel lotto 1, 4 nel lotto 2), 210 proteine arricchite con Glom erano altamente correlate tra i due gruppi indipendenti, nonostante questi dati provenissero da diverse coorti direni(r=0.83; Figura 3A) e analizzati in momenti diversi. 246 proteine arricchite con PT potrebbero anche essere correlate tra le due diverse coorti di reni normali (r=0.77; Figura 3B). I risultati evidenziano che nscProteomics è in grado di identificare proteine specifiche del sottocompartimento conservate in diverse unità funzionali del rene in modo riproducibile.
Figura 3. (A) Correlazione di un insieme di 210 proteine significativamente arricchite inglomerulotra due diversi lotti di campioni renali indipendenti. Il lotto 1 (corsa 1) proveniva da 2 reni e il lotto 2 (corsa 2) proveniva da 4 reni. La scala dei colori è stata selezionata per la rappresentazione visiva dell'abbondanza. Una forte correlazione positiva di 0.83 tra le abbondanze medie delle stesse proteine impostate da due lotti diversi Le linee tratteggiate rosse forniscono una misura della diffusione raffigurando l'intervallo di previsione del 95 percento per i valori medi di abbondanza di queste proteine in futuri esperimenti ripetuti. (B) Correlazione di 246 proteine significativamente arricchitetubuli prossimalicontroglomerulotra i due lotti. Una correlazione positiva di 0.77 tra le abbondanze medie di queste stesse proteine tra i due lotti.
Per accertare la specificità dell'approccio nscProtoemics perreneanalisi del sottocompartimento, abbiamo confrontato i dati Glom e PT del sottocompartimento renale di nscProteomics con la proteomica di massa dello stesso insieme di tessuto renale. Abbiamo scoperto che circa il 25 percento (n=656) delle proteine identificate in entrambi i sottocompartimenti non è stato nemmeno rilevato dalla proteomica dei tessuti sfusi, poiché erano probabilmente di abbondanza molto bassa nel campione sfuso; Non è stato possibile rilevare le proteine arricchite 118 Glom e 74 PT nel rene sfuso, evidenziando la limitazione di eseguire solo la proteomica del tessuto sfuso. Solo il 9 percento delle proteine specifiche di Glom, ma un numero maggiore di proteine specifiche del 48 percento di PT, è stato identificato dalla proteomica della massa renale, riflettendo l'abbondanza molto maggiore di cellule PT rispetto alle cellule Glom nel normalerene. In effetti, alcuni marcatori noti per le cellule glomerulari come podocina (NPHS2), eva-1 omologo B (EVA1B), MARCKS like 1 (MARCKSL1), fattore di crescita dei fibroblasti 1 (FGF1) e claudina 5 (CLDN5) potrebbero non essere identificato dalla proteomica della massa renale a una profondità di esecuzione standard di ~2,000.
cistanche per migliorarerenefunzione
Convalida dei marcatori Glom e PT valutati da nscProteomics
La maggior parte delle proteine del sottocompartimento è stata segnalata come rilevata inreneda IHC in dati precedentemente pubblicati (Human Protein Atlas) (25). Le proteine che non sono state rilevate da IHC (etichettate con *) o dati non disponibili (etichettati con **) sono indicate nelle figure 4A, B. Abbiamo preso le prime 26 proteine arricchite con glom e 26 proteine specifiche PT e interrogato unicellulare dati trascrittomici (dati scRNA Seq) per l'integrazione e la convalida "cross-omics" (Figura 4B). Il risultato dell'analisi integrativa dei principali marcatori Glom e PT mediante proteomica e trascrittomica ha dimostrato una forte correlazione di alcune delle proteine note dei marcatori Glom e PT. I marcatori dei podociti come PODXL e CLIC5 e i marcatori PT come PDZK1 e ANPEP sono stati altamente arricchiti in entrambi i set di dati. Oltre a convalidare i marcatori noti, nscProteomics ha anche identificato proteine che sono identificate in bassa abbondanza nei set di dati trascrittomici o nei set di dati IHC. Ad esempio, PITPNB è un marcatore glomerulare altamente arricchito dai dati di nscProteomics; tuttavia, il rilevamento di questo gene era basso nei dati trascrittomici e non era rilevabile dall'IHC (25). Un caso simile è stato osservato con SLC5A1, il cui segnale è stato migliorato nei dati di nscProteomics ma non nei set di dati trascrittomici o IHC (Figura 4C).
Figura 4. (A) Heatmap che mostra la distribuzione differenziale delle abbondanze proteiche in 5 normalireni(lotto 2), di 26 proteine (su 372) più significativamente arricchite in G (vs T) e 26 proteine (su 411) più significativamente arricchite in T (vs G), con valori corrispondenti in 2 campioni Bulk mostrati per il confronto . Le abbondanze proteiche sono misurate come intensità relative trasformate log 2. Il raggruppamento non supervisionato di proteine significative evidenzia insiemi di proteine correlate dalla misura di somiglianza della distanza euclidea all'interno dei più grandi insiemi arricchiti differenziati. Si noti che i campioni sfusi si raggruppano insieme ai campioni PT; questo è previsto da alloratubuli prossimalisono abbondantemente dispersi all'interno delrene. (B) Correlazione del diagramma di espressione genica dei dati scRNA-seq dall'uomorene. Sono stati selezionati i geni che codificano per proteine specifiche di Glom e PT presentate sulla mappa di calore. L'aumento della dimensione del punto corrisponde a una maggiore percentuale di cellule nella popolazione cellulare che esprimono il gene, mentre un colore più scuro corrisponde a una maggiore espressione del gene. PT,tubolare prossimale; Podo, podociti; Mes, cellule mesangiali; LOH, Ansa di Henle, Cellule immunitarie; Endo, cellule endoteliali; DT, tubuli distali; CD, condotto di raccolta. *Il segno accanto al simbolo del gene indica che la proteina non è stata rilevata sui glomeruli come riportato da Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), **Dati non disponibili su Human Protein Atlas (https://www. proteinatlas.org). (C) Proteine rappresentative che dimostrano come nscProteomics non solo identifica marcatori positivi come PODXL e PDZK1, ma identifica anche marcatori proteici come quelli altrimenti persi dalla trascrittomica o dall'immunoistochimica.
Rilevanza biologica delle proteine arricchite con Glom e PT
Abbiamo utilizzato i dati generati attraverso il protocollo sviluppato per nscProteomics per esaminare le proteine che erano significativamente arricchite nelle cellule glomerulari o neltubolare prossimalecellule. Le 208 proteine arricchite con Glom sono state arricchite nel trasporto mediato dalle vescicole (FDR 3,6E-15) e nella regolazione dell'organizzazione dei componenti cellulari (FDR 9,75E-14) come loro principali processi biologici e legame proteico citoscheletrico (FDR 2,63 E-19) e il legame dell'actina (FDR 2.40E-17) tra le prime funzioni molecolari. Inoltre, il citoscheletro di actina (FDR 3,73 E-25) e l'adesione focale (FDR 4,07E-20) erano i componenti cellulari arricchiti in alto. Le proteine arricchite con 247 PT sono state arricchite in processi metabolici a piccole molecole (FDR 7,55E-50) e processi metabolici dei farmaci (FDR 5.00E-41) come processi biologici principali. Le proteine sono state arricchite per l'attività ossidoreduttasica (FDR 9,07E-34) e l'attività catalitica (FDR 1,05E-27) tra le funzioni molecolari di primo piano.
nscProteomics identifica un insieme unico di proteine Glom e PT
A parte le proteine arricchite nelle sezioni Glom o PT, 92 proteine erano uniche per Glom (n=67) o uniche per PT (n=25), poiché erano identificate solo nelle cellule glomerulari o iltubolare prossimalecellule (Tabella 1). Le proteine identificate solo nelle cellule glomerulari sono state arricchite in funzioni molecolari come il legame dell'actina (FDR 4.92E-06), il legame con le proteine del citoscheletro (FDR 3.47E-05), il legame dell'integrina (3.9E{ {11}}), ecc. Abbiamo utilizzato questo elenco per interrogare i dati pubblicamente disponibili che avevano precedentemente segnalato la loro presenza nelglomerulo. Tra le 67 proteine identificate solo nelle sezioni Glom, 41 sono state segnalate per essere presenti nelrene(25). Di queste 41 proteine, un sottoinsieme di 18 (43,9%) è in accordo con nscProteomics e 23 (56,1%) non sono aumentate in Glom rispetto ai tubuli. Tra le 25 proteine identificate solo nelle sezioni PT, 20 sono state segnalate per essere presenti nelrene(25). Queste proteine sono arricchite in funzioni molecolari come l'attività del trasportatore transmembrana dell'anione organico (FDR 6.34E-05), l'attività del trasportatore transmembrana dell'acido carbossilico (FDR 1.4E-04), soluto: attività del symporter del sodio (FDR 1.8 E -04), ecc. Delle 25 proteine specifiche per PT, un sottoinsieme di 19 proteine (95.{13}} percento) sono in accordo con nscProteomics e solo 1 (5.0 percento) è segnalato per non essere aumentato nei tubuli rispetto a Glom.
Tabella 1. Proteine arricchite in glomerulare etubolare prossimalecellule identificate da nscProteomics.
Discussione
Con il rapido progresso della genomica unicellulare e dei saggi trascrittomici, c'è ancora la necessità insoddisfatta di fare studi paralleli unicellulari su preziosi campioni umani nel campo della proteomica (27). La profilazione delle proteine da una singola cellula è ostacolata dalla virtù che non abbiamo la capacità di amplificazione delle proteine nel modo in cui possiamo amplificare i nucleotidi. In questa prima applicazione della proteomica quasi unicellulare sull'uomorene, dimostriamo che una solida quantificazione proteomica senza etichetta è fattibile per un minimo di 40renecelle, specifiche per diversi sottocompartimenti LCM. I protocolli sviluppati per la proteomica renale quasi unicellulare saranno di beneficio per altri ricercatori che lavorano nel campo delle malattie renali.
Un recente studio di Hoehne et al. ha dimostrato l'uso della tecnologia SP3 (Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation) per l'analisi proteomica dei segmenti renali (4). Utilizzando singoli glomeruli microdissezionati con circa 200 cellule, gli autori hanno illustrato l'eterogeneità dei proteomi da singoli glomeruli da modelli murini e pazienti umani. Un altro studio recente di Song et al. (28) hanno utilizzato tessuto FFPE da pazienti trapiantati renali per creare una piattaforma diagnostica molecolare utilizzando la proteomica di massa. In questo manoscritto, abbiamo ottimizzato e analizzato in grande dettaglio il processo di raccolta dei tessuti nella SM per stabilire un protocollo standard per l'analisi proteomica di piccoli campioni di tessuto. In primo luogo, abbiamo confrontato il metodo di conservazione dei tessuti FFPE e OCT per dimostrare che, sebbene vi sia un'elevata correlazione tra i due set di dati, i tessuti OCT producono un contenuto proteico più elevato e, soprattutto, la capacità di identificare proteine a bassa abbondanza. In secondo luogo, i protocolli MS per la proteomica di massa sono stati ottimizzati in modo tale da poter ottenere risultati altamente riproducibili (r=0.95) in siti disparati su tagli seriali, adiacentirenesezioni di tessuto. Terzo, dove descriviamo un approccio per accoppiare la microdissezione di acquisizione laser per ridurre la quantità di campione di input a 10-40 cellule con una tecnologia nano POTS costituita da una piattaforma robotica per gestire con precisione volumi di pico-litri. Il nostro approccio ci consente di controllare il numero di cellule in ingresso migliorando così la riproducibilità di diversi campioni di glomi e tubuli. A causa della semplicità dell'LCM e dell'accuratezza della tecnologia nano POTS, riteniamo che il nostro studio consentirà l'adozione della proteomica su preziosi campioni clinici in modo riproducibile.
cistanche da trattarerenefunzione
I limiti di questo studio includono la piccola dimensione del campione e la limitazione del tessuto che non ci ha permesso di eseguire la convalida spaziale del tessuto mediante immunoistochimica. Per alleviare parzialmente questa limitazione, forniamo un'analisi dei dati integrata con i dati di scRNA Seq degli stessi tessuti per confermare che le proteine identificate inrenei sottocompartimenti sono anche identificati nella stessa cellula tissutale originaria mediante trascrizione. Un'ulteriore limitazione è che identifichiamo un numero limitato di proteine da nscProteomics, probabilmente a causa del piccolo materiale di input, che corre il rischio che alcune proteine non vengano identificate dalla SM poiché potrebbero desiderare al di sotto del limite di rilevamento dello strumento. Il miglioramento della sensibilità dello strumento e dell'estrazione di proteine da un piccolo campione di input può aiutare a migliorare questa limitazione attuale.
Riconosciamo che ci sono molte variabili che possono contribuire alla qualità dei dati. Il tempo di conservazione, i fissativi FFPE (cioè, PFA vs. Glutaraldeide), la durata del fissativo, il tempo nel congelatore/in ghiaccio secco/in azoto liquido, gli approcci per la solubilizzazione delle proteine sono alcuni fattori che potrebbero contribuire ai risultati della proteomica. È importante rendersi conto che anche la biologia dei duereninon è sempre lo stesso e ciò vale anche all'interno degli stessi reni dei glomeruli dello stessorenele biopsie possono trovarsi in uno stato funzionale diverso. Istologicamente,renei compartimenti sono estremamente eterogenei anche all'interno della stessa condizione di malattia. Catturando le stesse regioni del rene da diversi campioni di input, nscProteomics consente l'interrogazione dell'eterogeneità all'interno di specifici compartimenti subcellulari, che è un punto di forza di questa tecnologia.
Abbiamo osservato che alcune proteine del sottocompartimento identificate da nscProtoemics sono potenzialmente nuove glomerulari etubolare prossimaleproteine. Innovazioni nell'analisi dei dati integrativa con RNA unicellulare Seq dello stessorenei campioni, sebbene preliminari, fornirebbero conferma che queste proteine sono effettivamente localizzate nelle loro sottoregioni campionate/previste.
Questo studio fornisce approfondimenti sulla complessità sconosciuta dei modelli molecolari inrenesottocompartimenti sanitari e supporta l'applicazione di questa tecnologia a campioni di malattie renali per comprendere la perturbazione delle proteine in diversi sottocompartimenti renali che possono essere preferenzialmente interessati in diversi disturbi renali. La regolazione differenziale di queste proteine in diverse malattie renali potrebbe scoprire l'eterogeneità clinica e prognostica nei fenotipi complessi delle malattie glomerulari e tubulari e scoprire nuovi fattori scatenanti del danno renale e del recupero. Inoltre, data la scarsità di qualsiasi farmaco protettivo renale, la scoperta di questi nuovi percorsi in specifiche regioni del rene può fornire nuovi importanti obiettivi per la progettazione razionale di farmaci per affrontare lesioni specifiche a diversi sottocompartimenti in una varietà di disturbi renali.
Pertanto, in conclusione, presentiamo un flusso di lavoro nscproteomics per la gestione di 10-40renecellule; il miglioramento di questa tecnologia porta la promessa di ridurre il materiale in ingresso in futuro al livello di una singola cella. Sono in corso sviluppi futuri come volumi di elaborazione ottimizzati e ulteriori perfezionamenti della piattaforma LC-MS.
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati
I set di dati generati per questo studio possono essere trovati in PRIDE PXD015058 e 10.6019/PXD015058.
Contributi dell'autore
TS e MS hanno concettualizzato lo studio. TS, JLi, JH, ACS, RZ, YZ, PR, ID, SS, JLu e YY hanno aiutato nell'elaborazione dei campioni e nella generazione di dati sperimentali, TS, PP, SR, AS, W-JQ e MS hanno contribuito all'analisi dei dati e preparazione del manoscritto. Tutti gli autori hanno contribuito all'articolo e hanno approvato la versione presentata.
Finanziamento
Il finanziamento di questo lavoro è stato delReneProgetto di medicina di precisione, NIDDK NIHUG3 -DK114937 (MS) e R01 DK{3}} (MS), DP3 DK110844 (W-JQ), R01 DK122160 (W-JQ) e il supporto della Divisione Multi -Trapianto d'organo (SM).
Conflitto d'interesse
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che possano essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Riconosciamo l'aiuto di Zoltan Laszik e Gyula Szabo dell'UCSF per l'aiuto con l'elaborazione dei tessuti. Samir Parekh e Brad Rovin dell'Ohio State University (OSU), per le collaborazioni di massa sulla proteomica di massa e il QC per il tessuto proteomico di massa condiviso tra UCSF e OSU, e Jeff Hodgin e Matthias Kretzler dell'Università del Michigan per aver gentilmente fornito l'accesso a il riferimentorenecampioni. Parte del lavoro sperimentale qui descritto è stato eseguito nel Laboratorio di scienze molecolari ambientali, il Pacific Northwest National Laboratory, una struttura scientifica nazionale sponsorizzata dal Dipartimento dell'energia con contratto DEAC05-76RL0 1830.
Materiale supplementare
Il materiale supplementare per questo articolo è disponibile online all'indirizzo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2020.00499/full#supplementary-material
Abbreviazioni
nscProteomica, proteomica quasi unicellulare; KPMP,ReneProgetto di medicina di precisione; PT,tubolare prossimale; Glomo, glomerulare; LCM, microdissezione a cattura laser; μPOTS, elaborazione di microlitri in un vaso per campioni di tracce; OCT, temperatura di taglio ottimale; FFPE, incluso in paraffina fissata in formalina; UM, Università del Michigan; OSU, Università statale dell'Ohio; DDM, n-dodecil -D-maltoside; scRNA Seq, sequenziamento dell'RNA unicellulare; IHC, immunoistochimica.
Da: "Profilatura della proteomica quasi unicellulare del tubolare prossimale e del glomerulo del rene umano normale" diTara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Giuliana Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Isabella Damm1, Svastica Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* e Minnie M. Sarwal1* per il Consorzio Kidney Precision Medicine Project (KPMP).
---Articolo di RICERCA ORIGINALE Front. Med., 17 settembre 2020|https://doi.org/10.3389/fmed.2020.00499
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