Malattia policistica renale

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Parte Ⅱ: organoidi renali generati da cellule progenitrici eritroidi di pazienti con malattia renale policistica autosomica dominante

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Sfondo:Renegli organoidi sono stati ampiamente ottenuti da cellule staminali pluripotenti indotte disponibili in commercio (iPSC); tuttavia, è stata una grande sfida produrre in modo efficiente modelli organoidi renali da pazienti con policistico autosomico dominanterenemalattia (ADPKD) che ricapitola sia l'embriogenesi che i meccanismi della cistogenesi.

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Metodi: Progenitori eritroidi del sangue (EP) da due ADPKD (policistico autosomico dominanterenemalattia) pazienti e un donatore sano (HC) è stato utilizzato come controllo comparativo per normalizzare i numerosi passaggi tecnici per la riprogrammazione degli EP e per la generazione degli organoidi. Gli EP sono stati riprogrammati da un vettore episomiale in iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte), che sono stati differenziati in organoidi tubulari renali e quindi stimolati dalla forskolina per indurre la formazione di cisti.

Risultati: le iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) derivate da EP hanno mostrato tutte le caratteristiche della pluripotenza e sono state in grado di differenziarsi in tutti e tre gli strati germinali. Gli organoidi tubolari 3D sono stati generati da singole cellule dopo 28 giorni in Matrigel. HC e ADPKD (policistico autosomico dominanterenemalattia) gli organoidi non hanno formato spontaneamente cisti, ma dopo la stimolazione della forskolina, sono state osservate strutture simili a cisti nell'ADPKD (policistico autosomico dominanterenemalattia) organoidi ma non negli organoidi derivati ​​da HC.

Conclusione: i risultati di questo studio lo hanno dimostratoreneorganoidi sono stati generati con successo dalle cellule EP del sangue di ADPKD (policistico autosomico dominanterenemalattia) pazienti e un donatore di controllo sano. Questo approccio dovrebbe contribuire come un potente strumento per l'embrionerenemodello di sviluppo, che è in grado di ricapitolare i primissimi meccanismi fisiopatologici coinvolti nella citogenesi.

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Discussione

Nel presente studio, abbiamo descritto in dettaglio una procedura per generare organoidi renali da iPSC umane (cellule staminali pluripotenti indotte) ottenute dalle cellule progenitrici eritroidi del sangue di pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante). Molti tipi di cellule somatiche sono state riprogrammate con successo in iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte), comprese le cellule del sangue [Z]. Qui, abbiamo deciso di utilizzare i progenitori eritroidi del sangue come tipo di cellula iniziale per una serie di motivi, come la loro integrità genomica, memoria epigenetica e riprogrammazione efficiente [11,17,18]. L'efficienza con cui i progenitori eritroidi sono stati convertiti in iPSC era fino a due ordini di grandezza migliore (7 percento -28 percento) rispetto all'efficienza dei tipi differenziati di cellule del sangue (0.0 2 percento -0,60 percento) o fibroblasti (0,74 percento)[Z]. Nonostante la bassa abbondanza di queste cellule nel sangue periferico, possono essere facilmente isolate ed espanse in vitro per produrre un numero sufficiente per la riprogrammazione. Una delle sfide più importanti nello stabilire iPSC adatti è il loro genotipo e la variabilità fenotipica [6], ma ci sono alcune strategie tecniche proposte per aggirare o ridurre tale variabilità. Nei presenti esperimenti, abbiamo utilizzato un sistema episomiale non integrativo per la riprogrammazione che non richiede l'integrazione del genoma per l'espressione dei geni di riprogrammazione [10], consentendo una minore immunogenicità e rendendo le cellule geneticamente più stabili [19,20]. Inoltre, tutti i campioni sono stati derivati ​​dalla stessa fonte, il che aiuta a minimizzare la variabilità epigenetica [12] supponendo che la differenziazione della cellula di partenza possa influenzare l'efficienza dei risultati finali. L'analisi dei marcatori di pluripotenza e la capacità delle iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) di differenziarsi in tutti e tre gli strati germinali sono state confrontate fianco a fianco e sono state anche confrontate con la linea cellulare embrionale H9, che è stata utilizzata come controllo positivo . Tutti questi confronti non hanno mostrato differenze significative tra pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante), HC e cellule H9.

Sono stati sviluppati diversi protocolli per indurre la differenziazione delle iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) negli organoidi renali [13,21]. Sulla base dei protocolli descritti da Cruz et al. [6], abbiamo ottenuto strutture con le caratteristiche dei tubuli prossimali, inclusa l'espressione di NHE3 e AOP1. Inoltre, gli organoidi esprimevano NPHS2, indicando la presenza di cellule simili a podociti.

Al contrario, AQP2 non è stato espresso in questi organoidi tubolari. Questo risultato è in accordo con studi precedenti che indicano diversi limiti nello sviluppo di strutture derivate dalla gemma ureterale (UB) in vitro, con lo sviluppo di UB che richiede protocolli specifici, poiché la finestra temporale per l'aggiunta dell'induttore specifico è molto limitata. 6,22,23].

Nel processo di generazione di organoidi renali da iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte), tutta l'embriogenesi renale viene ricapitolata in vitro, coinvolgendo inizialmente la formazione di sferoidi cavitati da singole cellule [14]. In effetti, abbiamo scoperto che iPSCss indifferenziati (cellule staminali pluripotenti indotte) da entrambi i pazienti ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) e il controllo sano formavano strutture sferoidi simili a epiblasti che erano morfologicamente simili. Sebbene nel presente studio non sia stato eseguito il sequenziamento del DNA dei geni PKD1 e PKD2, i risultati attuali indicano che il tipo di mutazione portato dai pazienti non ha avuto alcuna influenza sulla tipica morfogenesi dell'epiblasto. Sono ancora necessari ulteriori studi per valutare più adeguatamente l'espressione delle molecole cardine coinvolte in questa fase dello sviluppo embrionale.

Secondo il protocollo sviluppato da Freedman et al. [14], abbiamo osservato che gli sferoidi si differenziavano in organoidi tubulari 26 giorni dopo l'induzione della differenziazione e la tempistica era simile sia per i pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) che per HC (Fig③). Tuttavia, abbiamo notato una certa variabilità per quanto riguarda il calendario di espressione ei livelli dei marcatori di differenziazione. D'altra parte, la morfologia delle strutture tubolari era simile e comparabile tra i campioni dei pazienti con ADPKD e HC. Al contrario, utilizzando iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) provenienti da biopsie renali di pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante), il gruppo Cruz et al, hanno riscontrato una maggiore variabilità nella capacità di queste cellule di formare organoidi [6]. In Oltre all'enorme diversità di mutazioni inerenti a questa malattia, queste differenze nell'efficienza nell'ottenere organoidi possono essere spiegate anche dai tipi cellulari eterogenei presenti nei campioni bioptici, in contrasto con i progenitori eritroidi, che costituiscono una popolazione cellulare più omogenea. Presi insieme, questi risultati indicano che, nonostante la variabilità e le differenze nell'efficienza dei diversi cloni iPSC nel formare organoidi renali, l'ottenimento di questi ultimi da pazienti con ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) può costituire un modello unico per lo studio delle molteplici forme di manifestazioni fenotipiche di questa malattia. Inoltre, è importante notare che se c'è una notevole variabilità delle mutazioni nella popolazione affetta da ADPKD, le iPSC specifiche per il paziente (cellule staminali pluripotenti indotte), essendo totalmente immunocompatibili, potrebbero essere utilizzate in futuro per terapie rigenerative individuali , oltre a consentire lo sviluppo di un modello in vitro per verificare se le manifestazioni fenotipiche molto precoci sono anche diverse quanto la presentazione clinica.

Gli organoidi non stimolati derivati ​​da pazienti con HCor ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) non hanno formato spontaneamente cisti. La morfologia tipica delle cisti e l'espressione dei marker di cistogenesi non erano rilevabili in nessun campione, estendendo anche la differenziazione organoide in coltura fino al completamento dei 35 giorni. È stato dimostrato che la sola proliferazione cellulare non produce cisti[24]. Inoltre, è necessario un terzo evento indipendente (noto come terzo colpo) per accelerare la formazione e la crescita di cisti in vivo [23]. Al contrario, la formazione di cisti indotta dalla forskolina si è verificata negli organoidi di pazienti con ADPKD ma non in quelli di HC. Da notare, sebbene presenti, le cisti sono state osservate in bassa percentuale nei campioni di ADPKD anche in presenza di forskolina, come è stato osservato anche da Freedman et al. [14] in organoidi formati dal modello CRISPR/Cas9 della malattia di ADPKD. Alcune ipotesi possono essere sollevate per spiegare la bassa frequenza delle cisti riscontrate nel presente modello. 1) Gli organoidi coltivati ​​in un ambiente di sospensione 3D hanno mostrato un'efficienza della cistogenesi molto più elevata rispetto agli organoidi aderenti [6], indicando che il microambiente è direttamente implicato nella cistogenesi.2) Il protocollo sperimentale impiegato nel presente studio ha formato organoidi del tubulo prossimale, ma non porzioni distali del nefrone [23]. Sebbene tutti i segmenti del nefrone possano dare origine a cisti compresi i tubuli prossimali [25], apparentemente quelli derivati ​​dai dotti collettori sembrano essere più grandi e in numero maggiore rispetto a quelli di altri segmenti [26], 3) Infine, è stato recentemente dimostrato che l'origine delle cisti può essere correlato alla presenza di molteplici mutazioni PKD1 che determinano la gravità della malattia e che la formazione di cisti nei dotti collettori era associata alla gravità della malattia [27, 28].

In conclusione, i presenti risultati hanno mostrato che è possibile generare organoidi con strutture tridimensionali simili all'architettura del progenitore renale utilizzando iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) riprogrammate da progenitori eritroidi che sono stati facilmente isolati dall'ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante) pazienti e che questi organoidi sono in grado di formare cisti sotto stimolazione con forskolina. Questa promettente metodologia svela un metodo per aumentare la comprensione dei primissimi passaggi genetici, fenotipici e fisiologici nella formazione di cisti nell'impostazione dell'ADPKD (malattia del rene policistico autosomico dominante).

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