Il fattore inducibile dall'ipossia dei periciti renali regola l'eritropoiesi ma non la fibrosi renale
Mar 13, 2022
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Szu-Yu Pan1,2,3 et al
Gli inibitori dell'enzima del dominio della prolilidrossilasi (PHD) sono efficaci nel trattamento dimalattia renale cronica(CKD) - anemia associata stabilizzando il fattore inducibile dall'ipossia (HIF), aumentando così l'eritropoietina e di conseguenza l'eritropoiesi. Tuttavia, la preoccupazione per la progressione della CKD deve essere affrontata negli studi clinici. Sebbene gli studi preclinici abbiano mostrato un effetto antinfiammatorio inrenemodelli di malattia, l'effetto degli inibitori della PHD surenefibrosiera incoerente probabilmente perché gli effetti di HIF dipendono dal tipo di cellula e dal contesto. Il sindacoreneLe cellule produttrici di eritropoietina sono periciti che producono eritropoietina attraverso la trascrizione del gene HIF-2a-dipendente. La preoccupazione per l'impatto di HIF nei periciti surenefibrosideriva dal fatto che i periciti sono le principali cellule precursori dei miofibroblasti nell'insufficienza renale cronica. Poiché le cellule che esprimono Gli1 soddisfano i criteri morfologici e anatomici per i periciti, abbiamo indotto Gli1 più la stabilizzazione HIF specifica per cellula o il knockout per studiare l'impatto di HIF nei periciti surenepatologia di topi con o senza danno fibrotico indotto da ostruzione ureterale unilaterale. Rispetto ai controlli della cucciolata, i topi con stabilizzazione HIF specifica per pericite dovuta alla proteina von Hippel-Lindau o al knockout PHD2 hanno mostrato un aumento dell'eritropoietina sierica e della policitemia piuttosto che una differenza distinguibile inrenefibrosi. Rispetto a Gli1piùpericiti selezionati dai controlli dei compagni di lettiera, Gli1piùi periciti selezionati da topi knockout PHD2 hanno mostrato una maggiore espressione del gene dell'eritropoietina piuttosto che cambiamenti distinguibili nell'espressione di Col1a1 o Acta2. Inoltre, il knockout specifico del pericito di HIF-1a o HIF-2a non ha influitorenefibrosi. Pertanto, il nostro studio supporta l'assenza di effetti negativi sugli inibitori della PHDrenefibrosidi topi nonostante la stabilizzazione HIF nei periciti.
PAROLE CHIAVE: eritropoietina;fibrosi; fattore inducibile dall'ipossia; pericite
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Dichiarazione traslazionale
Gli inibitori dell'enzima del dominio della prolilidrossilasi (PHD) sono efficaci nel trattamento dell'anemiacronicorenepatologia(CKD) attraverso la stabilizzazione del fattore inducibile dall'ipossia (HIF), aumentando così l'eritropoietina (EPO) e l'eritropoiesi. I periciti renali producono EPO attraverso HIF-2a nella normale fisiologia, ma si differenziano dai miofibroblasti che producono cicatrici nella CKD. Non è chiaro se l'espressione di HIF nei periciti renali abbia un impattorenalefibrosi. Con modelli murini preclinici di manipolazione HIF e fibrosi renale, dimostriamo che la manipolazione HIF specifica per pericite e Gli1 influenza la produzione di EPO e l'eritropoiesi ma nonfibrosi renale. Il nostro studio sostiene l'assenza di effetti negativi degli inibitori della PHD sulla fibrosi renale.
Il cardine del trattamento per l'anemia nei pazienti concronicorenepatologia(CKD) sono agenti stimolanti l'eritropoiesi e integratori di ferro. 1,2 Recentemente, l'inibitore dell'enzima del dominio della prolilidrossilasi (PHD) emerge come un promettente agente terapeutico per l'anemia associata a CKD principalmente attraverso la stabilizzazione del fattore inducibile dall'ipossia (HIF) e quindi l'aumento della produzione di eritropoietina (EPO). l'applicazione di inibitori della PHD o stabilizzatori dell'HIF in pazienti con insufficienza renale cronica è imminente nel prossimo futuro se le preoccupazioni relative alla possibile angiogenesi, alla crescita del tumore, al metabolismo anormale del glucosio e al declino acceleratorenefunzione devono essere affrontate negli studi clinici.
L'HIF è il più importante macchinario cellulare noto per il rilevamento dell'ossigeno.6,7 L'HIF funzionale è costituito da subunità aeb. HIF-a è una subunità labile all'ossigeno che viene rapidamente degradata in condizioni normossiche in presenza di cofattori. HIF-b non è regolato dalla tensione di ossigeno. La degradazione dell'HIF-a è preceduta dall'idrossilazione della prolina e dalla poliubiquitinazione. L'idrossilazione della prolina è catalizzata dal PHD in presenza di ossigeno, ferro e 2-ossoglutarato come cofattori. La poliubiquitinazione viene quindi catalizzata da un'ubiquitina ligasi E3 composta dal complesso della proteina von Hippel Lindau (pVHL)-Elongina BC-CUL2. Il requisito di ferro, PHD e pVHL per la degradazione dell'HIF consente di stabilizzare l'HIF nella condizione normossica con l'inibizione o la diminuzione di uno qualsiasi di questi componenti chiave.
I periciti renali sono incorporati all'interno della membrana basale microvascolare e in stretto contatto con le cellule endoteliali per supportare la microvascolatura e regolare il flusso sanguigno.8-13 Abbiamo riportato che i periciti renali sono cellule produttrici di EPO renali (REPC) che producono EPO attraverso HIF{{3 }}trascrizione del gene a-dipendente indotta da anemia o ipossia.14 I periciti sono stati dimostrati come la principale fonte di miofibroblasti che producono cicatrici nell'insufficienza renale cronica,8,10,11,15,16 un risultato supportato da altri rapporti indipendenti.17, 18 Sebbene il passaggio ai miofibroblasti porti alla repressione della trascrizione di Epo, la sovraespressione di HIF-2a ripristina parzialmente la produzione di EPO nei miofibroblasti.14,17
I nostri studi lo hanno dimostratofibrosi renalepuò essere attenuato dall'interruzione della transizione pericito-miofibroblasto attraverso il blocco farmacologico del fattore di crescita trasformante-b, 19 fattore di crescita derivato dalle piastrine,20 fattore di crescita endoteliale vascolare,21 o vie WNT/b-catenina.22
Per quanto riguarda la preoccupazione per il declino accelerato direnefunzione nei pazienti in trattamento con inibitori della PHD, poco si sa sugli effetti dell'attività HIF nei periciti o nei miofibroblasti sufibrosi renale.23 Al contrario, gli effetti della sovraespressione o del knockout HIF sufibrosi renalesono stati ampiamente studiati, in modo non selettivo24-27 o selettivamente in cellule tubulari,28,29 cellule endoteliali,30 e podociti.31,32 Tuttavia, i risultati sono stati incoerenti probabilmente perché gli effetti dell'HIF dipendono dal tipo cellulare e dal contesto.
Studi in vitro utilizzando fibroblasti renali umani isolati33 e cellule interstiziali midollari renali di ratto34 hanno suggerito un ruolo profibrotico di HIF-1a. Tuttavia, Souma et al.17 hanno riportato che il concomitante knockout di PHD1, PHD2 e PHD3 nei REPC di topi Tg(Epo-Cre) che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Epo non influiscefibrosi renalenel modello di ostruzione ureterale unilaterale (UUO). Tuttavia, l'espressione renale di Epo è bassa e la dimensione del pool di REPC è piccola allo stato stazionario senza ipossia o anemia,35 suggerendo che il transgene Epo-Cre definisce solo una piccola frazione delle REPC totali. Recentemente, è stato dimostrato che le cellule renali che esprimono Gli1- sono periciti e si differenziano in miofibroblasti surenelesione.11,36 L'ablazione delle cellule Gli1 plus migliora l'UUO-indottarenalefibrosi.11 Qui abbiamo usato topi con Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore/potenziatore Gli1 per studiare gli effetti della stabilizzazione HIF specifica pericita o del knockout surfibrosi anale.
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METODI
Topi
Gli1CreERT2/ più, Tg(UBC-CreERT2), VhlF/F,ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodoro, Hif1aF/Fe Hif2aF/F i topi sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Egln1F/F i topi sono stati gentilmente forniti dal professor Guo-Hua Fong (University of Connecticut Health Center, Farmington, CT). Tutti gli studi sono stati condotti secondo un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee, National Taiwan University College of Medicine (IACUC 20160499).
Ostruzione ureterale unilaterale
La procedura era stata dettagliata in uno studio precedente.14 In breve, in topi adulti di età compresa tra 7 e 9 settimane sotto anestesia con ketamina/xilazina (ketamina 100 mg/kg, xilazina 10 mg/kg), la parte sinistra gli ureteri dei topi sono stati esposti e legati con sutura di nylon attraverso un'incisione sul fianco sinistro. La data dell'intervento chirurgico UUO è stata identificata come giorno 0 dell'esperimento.
analisi statistiche
I dati sono stati espressi come mediapiùSD. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). La significatività statistica è stata determinata dal test t di Student o dal test U di Mann-Whitney come mostrato nelle didascalie.
Metodi supplementari
Metodi completi tra cui topi, UUO, somministrazione di tamoxifene, reazione a catena della polimerasi quantitativa, immunoblot, immunoistochimica, ibridazione in situ dell'RNA, microscopia, citometria a flusso e isolamento delle cellule renali Gli1 plus sono nei metodi supplementari.
RISULTATI
Aumento della produzione di EPO e dell'eritropoiesi nei topi con knockout Gli1 più PHD2 specifico per i periciti
Per dimostrare che Gli1 plus periciti produceva EPO prima di andare a studiare l'effetto della manipolazione HIF specifica per periciti sufibrosi renale, abbiamo generato Gli1CreERT2/ più; Egln1F/Ftopi per indurre il knockout PHD2 in Gli1 più periciti condizionatamente (Figura 1a). Rispetto al compagno di cucciolata Egln1F/Ftopi, Gli1CreERT2/ più; Egln1F/Fi topi hanno mostrato un livello più elevato di EPO sierico (Figura 1b), un peso splenico più pesante (Figura 1c), più TER-119piùstirpe eritroide negli splenociti entro il giorno 14 dopo il tamoxifene (Figura 1d), ma una variazione del peso corporeo simile dopo la somministrazione di tamoxifene (Figura supplementare S1A). L'ematocrito (Hct) era più alto in Gli1CreERT2/ più; Egln1F/Ftopi al giorno 21 (Figura 1e). Abbiamo analizzato l'mRNA renale di Epo e l'emocromo periferico 14 giorni dopo il tamoxifene. Rispetto al compagno di cucciolata Egln1F/Ftopi, Gli1CreERT2/ più; Egln1F/Fi topi avevano una maggiore espressione di Epo renale (Figura 1f) e reticolociti periferici (Figura 1g), mentre il conteggio dei globuli bianchi periferici e il conteggio delle piastrine non erano diversi (Figura supplementare S1B e C). Per identificare le cellule renali responsabili dell'espressione di Epo, abbiamo eseguito l'ibridazione in situ di Epo surenesezioni da Egln1F/F e Gli1CreERT2/più; Egln1F/Ftopi (Figura supplementare S2A-F). L'aumento delle cellule interstiziali che esprimono Epo potrebbe essere identificato principalmente nella giunzione corticomidollare e, in misura minore, nel midollo interno e nella corteccia nel Gli1CreERT2/più; Egln1F/Ftopi. Questi risultati hanno suggerito che il knockout di Gli1 più PHD2 specifico per i periciti ha indotto la produzione renale di EPO e l'eritropoiesi.
Per determinare se PHD2 regola la produzione di EPO in tipi cellulari e organi diversi dai periciti nelrene, abbiamo generato Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/Ftopi per indurre il knockout globale di PHD2 (Figura supplementare S3A). Dopo la somministrazione di tamoxifene, knockout del gene Egln1 nelrene, fegato, milza, cuore e polmone potrebbero essere rilevati (Figura supplementare S4). Nelrene, l'espressione dell'mRNA di Egln1 ridotta al 4%, indicando un'elevata efficienza del knockout di PHD2 (Figura supplementare S3B). Come in Gli1CreERT2/ più; Egln1F/Ftopi, Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/Fi topi hanno mostrato un progressivo aumento di Hct rispetto alla cucciolata Egln1F/Ftopi (Figura supplementare S3C). In particolare, Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/Fi topi hanno mostrato una diminuzione del peso corporeo (Figura supplementare S3D). Nella Tg(UBC-CreERT2) è stato riscontrato un livello notevolmente elevato di EPO sierico, circa 130,000 pg/ml; Egln1F/F topi, che era molto più alto di quello ottenuto dalla flebotomia (meno di 5,000 pg/ml) nei topi wild-type (Figura supplementare S3E). Per identificare la fonte di EPO sierica, abbiamo controllato i livelli di mRNA di Epo in diversi organi da Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/F,e topi di controllo della cucciolata al giorno 15. Nei topi di controllo della cucciolata, l'mRNA di Epo è stato appena rilevato in nessun organo. In 5 organi principali (rene, fegato, polmone, cuore, milza) di Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/F topi, solo ilreneha mostrato un notevole aumento di Epo mRNA, implicando ilrenecome una delle principali fonti di EPO sierico (Figura supplementare S3F e G). Ibridazione in situ di Epo mRNA surenele sezioni hanno rivelato che le cellule renali con espressione di Epo erano cellule interstiziali con morfologia dei periciti in Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/Ftopi (Figura supplementare S5). Pertanto, questi dati hanno confermato che i periciti renali Gli1 più hanno prodotto EPO su PHD2 knockout, aumentando così l'eritropoiesi e l'ematocrito.
Gli1 più knockout pVHL pericite-specifico porta alla policitemia ma non ha alcun effetto sulla fibrosi renale
Coerentemente con le precedenti segnalazioni,11,36 ha incrementato Gli1piùi periciti sono stati mostrati nella giunzione corticomidollare e nel midollo dopo la lesione UUO in Gli1CreERT2/più; ROSA26fstdPomodoro/ fstdPomodorotopi reporter (Figura supplementare S6), suggerendo che i periciti Gli1 più proliferano e contribuiscono notevolmente ai miofibroblasti durantefibrosi renale.Abbiamo quindi studiato l'effetto della stabilizzazione HIF o knockout in Gli1piùpericiti sufibrosi renale.
Abbiamo usato topi con Gli1piùknockout pericyte-specifico di pVHL, non PHD2 a causa della possibile ridondanza in 3 diversi PHD. Per studiare l'effetto a lungo termine della stabilizzazione HIF specifica per i pericitireninei topi senza CKD, Gli1CreERT2/più; VhlF/Ftopi e VhlF/Fai compagni di cucciolata è stato somministrato tamoxifene a 6 settimane di età e quindi osservati fino a 30 settimane di età (Figura supplementare S7A). Una morte inaspettata in Gli1CreERT2/più; VhlF/Fi topi sono avvenuti a 25 settimane di età (tasso di mortalità del 14,3%), ma non ci sono stati decessi in VhlF/Fcompagni di cucciolata. Debolezza e diminuzione dell'aumento di peso corporeo sono stati riscontrati in Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi già a 16 settimane di età (Figura supplementare S7B). A causa del dimagrimento e della morte inaspettata, alcuni topi sono stati soppressi prima delle 30 settimane di età. La patologia ha rivelato una grave eritropoiesi diffusa nella milza e una congestione dei globuli rossi nel fegato, nei polmoni erenea 18 settimane di età (Figura supplementare S8). Fatta eccezione per la congestione dei globuli rossi, non distinguibilefibrosiè stato osservato nei principali organi tra cuireni. I livelli di ematocrito e di EPO sierica sono aumentati a 87 più -2,6 percento e 1604 più -141 pg/ml a 30 settimane di età (cioè, 24 settimane dopo il tamoxifene) (Figura supplementare S9A e B)
A causa di nessun discernibilefibrosi renalenei topi con knockout pVHL specifico per Gli1 più pericite, abbiamo indotto UUO nei topi e valutato la gravità della fibrosi renale 7 o 14 giorni dopo (Figura 2a). Eliminati gli alleli Vhl in Gli1CreERT2/þ; VhlF/Fsono stati rilevati topireneDNA genomico mediante reazione a catena della polimerasi, che indica il knockout del pVHL nei periciti (Figura supplementare S10). Hct è stato aumentato in Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi anche dopo l'intervento chirurgico UUO (Figura 2b). In particolare, l'espressione dell'mRNA di EPO è stata aumentata sia in controlaterale che in UUOrenidi Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi (Figura 2c), suggerendo che la stabilizzazione HIF potrebbe attivare la trascrizione di Epo sia nei periciti che nei miofibroblasti. Tuttavia, nessuna differenza infibrosi renaletra Gli1CreERT2/ più; VhlF/Fe compagno di cucciolata VhlF/F i topi potrebbero essere rilevati, come misurato dall'area macchiata di rosso picrosirius (Figure 2d e 3a e b) e dall'espressione di Col1a1 mRNA (Figura 2e) nelrene. Inoltre, i livelli di mRNA e proteine dell'actina muscolare liscia non erano diversireni(Figura 2f e g e Figura supplementare S11). Per confermare che i miofibroblasti hanno mantenuto la capacità di espressione di Epo dopo il knockout di pVHL, abbiamo eseguito l'ibridazione in situ di Epo e Acta2 surenesezioni (figure supplementari S12 e S13). L'espressione di Acta2 renale è aumentata drasticamente e in modo comparabile dopo l'infortunio UUO in entrambi Gli1CreERT2/ più; VhlF/Fe VhlF/Ftopi. Più cellule interstiziali che esprimono Epo potrebbero essere osservate in Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi che in VhlF/F topi, indipendentemente dalla presenza di lesioni UUO. Inoltre, in UUO potrebbero essere identificate cellule con espressione concomitante di Acta2 ed Eporeneda Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi ma non VhlF/Ftopi. In effetti, difficilmente potremmo identificare cellule che esprimono Epo nell'UUOreneda VhlF/Ftopi. Questi risultati hanno suggerito che l'eliminazione di Gli1 più il pVHL limitato dai periciti promuovesse l'espressione di Epo ma non la differenziazione del miofibroblasto o la produzione di collagene anche dopo la lesione UUO.
Poiché la lesione UUO provoca danni alle cellule tubulari prossimali e reclutamento di macrofagi, 37 livelli di mRNA di Havcr1 (codificarenemolecola di lesione-1) (Figura 4a) e Adgre1 (codificante un modulo simile al fattore di crescita endoteliale contenente un recettore dell'ormone simile alla mucina 1, noto anche come F4/80) (Figura 4b) aumentato in UUOreni, ma non è stato possibile rilevare alcuna differenza tra Gli1CreERT2/ più; VhlF/Fe compagno di cucciolata VhlF/F topi. I livelli di mRNA di Vegfa, Hmox1, Egln1 ed Egln3 (che codificano rispettivamente per il fattore di crescita delle cellule endoteliali vascolari-A, eme ossigenasi-1, PHD2 e PHD3) inreninon sono stati modificati (Figura 4c-f), probabilmente riflettendo che queste trascrizioni non sono state prodotte in modo dominante da Gli1 più periciti o non sono state modificate dopo il knockout VHL Gli1 più pericite limitato. Abbiamo valutato la lesione tubulo-interstiziale in periodica colorazione con acido di Schiffrenesezioni e non è stata rilevata alcuna differenza tra Gli1-CreERT2/ più; VhlF/F,e compagno di cucciolata VhlF/Ftopi (Figure 4g e 5a e b). Perché si dice che il tamoxifene si attenuifibrosi,38,39 abbiamo esteso il periodo di washout tra l'ultima somministrazione di tamoxifene e l'intervento chirurgico con UUO da 2 settimane a 4 settimane (Figura supplementare S14A). Anche in questo caso, non è stata rilevata alcuna differenza tra Gli1CreERT2/ più; VhlF/F e compagno di cucciolata VhlF/F topi (Figura supplementare S14B-E). Questi risultati hanno indicato che il knockout pVHL specifico per Gli1 più pericite porta alla produzione di EPO e alla policitemia ma non ha alcun effetto surenalefibrosi.
Cistanche è buono perrene
Gli1 plus knockout PHD2 specifico pericite aumenta la produzione di EPO ma non la produzione di collagene o la differenziazione dei miofibroblasti
Per confermare gli effetti della stabilizzazione HIF nei periciti Gli1 plus a livello cellulare, abbiamo selezionato le cellule tdTomato plus dalrenidi Gli1CreERT2/ più; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodoroe Gli1CreERT2/ più; Egln1F/F; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi dopo la lesione UUO (Figure supplementari S15 e S16). Sotto l'esame microscopico, le cellule ordinate emettevano fluorescenza rosso-arancio all'eccitazione (Figura supplementare S17A-C). Rispetto a quelli di Gli1CreERT2/ più; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi, il livello di mRNA di Egln1 nelle cellule tdTomato plus ordinate da controlaterale e UUOrenidi Gli1CreERT2/ più; Egln1F/F; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodoroi topi 7 giorni dopo la lesione UUO si sono ridotti rispettivamente al 46% e al 33% (Figura supplementare S17D ed E).
Abbiamo analizzato i livelli di mRNA di Epo, Col1a1, Col3a1 e Acta2 nel tdTomato più Gli1 più periciti da Gli1CreERT2/ più;ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodoroe Gli1CreERT2/ più; Egln1F/F; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi. Coerentemente con i risultati ottenuti dai topi con knockout pVHL specifico per Gli1 più pericite, il knockout PHD2 in Gli1 più periciti ha comportato un aumento dell'espressione di Epo, ma non ha avuto alcun effetto sull'espressione di Col1a1, Col3a1 e Acta2 a livello cellulare (Figura 6) , confermando l'effetto neutro della stabilizzazione HIF sulle proprietà profibrotiche dei periciti/miofibroblasti.
Gli1þ knockout HIF specifico pericite non influenza la fibrosi renale
Poiché questi esperimenti hanno confermato l'effetto neutro della stabilizzazione HIF sulle proprietà profibrotiche di periciti/miofibroblasti, abbiamo generato Gli1CreERT2/plus; Hif1aF/F; Hif2aF/F topi per studiare l'effetto del knockout HIF nei periciti/miofibroblastifibrosi renale(Figura 7a). Eliminazione di Hif1a e Hif2a nelrenepotrebbe essere rilevato inreneDNA genomico dopo somministrazione di tamoxifene (Figura supplementare S18). Rispetto al controllo del compagno di lettiera, Gli1CreERT2/ più; Hif1aF/F; Hif2aF/F i topi avevano una variazione del peso corporeo e un livello di Hct simili 7 giorni dopo l'UUO (Figura 7b e c). In termini difibrosi renale, nessuna differenza è stata rilevata nell'area macchiata di rosso picrosirius, livelli di mRNA di Col1a1 e Acta2 nelrene(Figura 7d-f). Anche i livelli di mRNA di Havcr1 e Adgre1 non erano diversi (Figura 7g e h). Abbiamo modificato la dose e il periodo di washout del tamoxifene (Figure supplementari S19A e S20A) e i risultati per la deposizione di collagene e l'espressione genica erano simili (Figure supplementari S19B–E, S20B–E). Abbiamo ripetuto gli esperimenti in Gli1CreERT2/ più; Hif1aF/F(Figura 8a–c) e Gli1- CreERT2/ plus ; Hif2aF/F(Figura 8d-f) topi e non hanno dimostrato la differenza nell'indotto da UUOfibrosi renalerispetto al controllo del compagno di cucciolata.
DISCUSSIONE
I risultati principali di questo studio includevano quanto segue: (i) la stabilizzazione renale di Gli1 più pericite-specifica HIF ha portato alla produzione di EPO e all'eritropoiesi ma nessun effetto sulla patologia dei reni con o senza danno UUO; e (ii) Gli1 renale più HIF specifico del pericito-1a e HIF-2un knockout non ha influenzatofibrosi renaleo.
In precedenza abbiamo segnalato che Foxd1 renale più periciti derivati dal progenitore sono REPC e regolati da HIF-2a. 14 In questo studio, abbiamo dimostrato che anche le cellule renali Gli1 plus sono REPC. Sebbene nessuna prova diretta spieghi la relazione tra FOXD1 e GLI1 nei periciti, studi precedenti hanno dimostrato che sia le cellule renali Foxd1 più derivate dal progenitore che le cellule Gli1 più sono periciti e sono in grado di differenziarsi in miofibroblasti sulla lesione.10,11,36 Il nostro i dati hanno mostrato che il knockout di PHD2 o pVHL in particolare nei periciti Gli1 più ha provocato un aumento della produzione renale di EPO, eritropoiesi e policitemia, che è in linea con un recente rapporto di Greenwald et al.40 Inoltre, rispetto a una marcata diminuzione di Epo espressione nel rene UUO di compagni di cucciolata wild-type, l'espressione di Epo nel rene UUO di topi con knockout pVHL specifico per Gli1- era paragonabile al livello mostrato nel controlaterale di controllorene, l'approvazione della stabilizzazione dell'HIF potrebbe superare il meccanismo della repressione dell'Epo nei miofibroblasti renali fibrotici.14,17 In linea con la nostra scoperta, Souma et al.17 hanno riportato che la sintesi di EPO è ripristinata in UUO-renemiofibroblasti nei topi con knockout PHD2. In corrispondenza con i nostri risultati, uno studio molto recente41 ha riportato che le cellule renali Gli1 plus sono una sottopopolazione del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine più REPC e mantengono la capacità di produzione di EPO in UUOreni.
Gli studi clinici hanno dimostrato l'efficacia degli inibitori della PHD nel trattamento dell'anemia associata a CKD.3–5,42–45 È importante sottolineare che le analisi aggregate degli studi di fase III su roxadustat hanno dimostrato un esito cardiovascolare non inferiore o addirittura migliore.46 Tuttavia, nessun Finora è stato pubblicato un rapporto sull'effetto degli inibitori della PHD sulla progressione della CKD. Sperimentalmente, il ruolo dell'ipossia e dell'HIF infibrosi renaleè controverso.47,48 Nei topi sottoposti a danno renale acuto (AKI) indotto da danno da ischemia-riperfusione, Kapitsinou et al.24 hanno dimostrato che l'inibizione del PHD prima dell'AKI migliorafibrosi, mentre l'inibizione nella fase di recupero iniziale dell'AKI non lo fa. Inoltre, Uchida et al.26 hanno dimostrato che l'inibitore del PHD può migliorarefibrosi renalein associazione con la riduzione delle citochine proinfiammatorie e il ripristino della densità capillare nel rene di un modello di CKD di ratto indotto da 5/6 subtotale nefrectomia, sebbene non sia mostrato alcun effetto sulla proteinuria e sul livello di creatinina sierica. Al contrario, un recente rapporto ha mostrato che l'inibitore della PHD contribuisce alla policitemia e all'attenuazione della nefrite tubulo-interstiziale, ma non ha alcun effetto sulla fibrosi renale in un modello di nefrite tubulo-interstiziale cronica indotta da adenina.25 È stato anche dimostrato l'effetto antinfiammatorio degli inibitori della PHD nel rene di un modello murino obeso con diabete di tipo 2.27 Se gli inibitori della PHD migliorano la fibrosi renale attraverso l'attenuazione dell'infiammazione interstiziale merita ulteriori studi. Sebbene questi studi non abbiano riportato gli effetti degli inibitori della PHD sull'attivazione del miofibroblasto renale, l'assenza di un effetto negativo sulla fibrosi renale potrebbe supportare l'effetto ignorabile dell'espressione di HIF sulla produzione di collagene nei periciti renali. La valutazione dell'effetto dell'HIF sul rene è sofisticata.49 Primo, diversi tipi cellulari possono esprimere diverse isoforme HIF.50 Secondo, anche la stessa isoforma HIF può regolare diversi geni bersaglio in diversi tipi cellulari.51 Terzo, l'espressione e la regolazione dell'HIF nella condizione fisiologica può essere diverso dal rene malato.50 Inoltre, la rapida degradazione dell'HIF in condizioni normossiche aumenta la difficoltà di analisi imprecise dei livelli di proteina HIF nei tessuti.52 Pertanto, sono probabilmente risultati precedenti incoerenti sull'effetto sulla fibrosi renale perché gli effetti di HIF dipendono dal tipo di cellula e dal contesto. Ad esempio, l'evidenza ha dimostrato che l'inibitore della PHD prima dell'AKI indotto dal danno da ischemia-riperfusione migliora la fibrosi post-AKI attraverso un meccanismo endoteliale HIF-2a-dipendente,24,30 mentre l'infiammazione HIF-1a-dipendente , fibrosi e displasia delle cellule renali sono state trovate in Tg(Hoxb7-Cre); VhlF/Ftopi che hanno knockout pVHL nei dotti collettori e un sottoinsieme di tubuli distali.29 Nel nostro studio incentrato sulla modulazione dell'attività HIF nei pericitifibrosi renale,abbiamo dimostrato che la produzione di EPO era sostanzialmente aumentata nei periciti renali nei topi con stabilizzazione HIF specifica per Gli1 più pericita dal knockout pVHL o PHD2 specifico per cellula e, in particolare, l'espressione di Epo è stata mantenuta nei miofibroblasti renali UUO. Tuttavia, non abbiamo riscontrato che la stabilizzazione HIF specifica del pericito abbia influenzato la transizione pericito-miofibroblasto, la produzione di collagene nei miofibroblasti o l'UUO-indottarenefibrosi. Inoltre, le espressioni di Havcr1 e Adgre1 non sono state influenzate nel rene UUO, il che implica che la gravità della lesione tubulare renale e l'infiammazione renale non sono state influenzate nei topi con stabilizzazione HIF specifica per pericite. Perché il miofibroblasto è il tipo di cellula che produce cicatrici durantefibrosi renale, i nostri risultati possono fornire prove sperimentali dell'assenza di effetti negativi della stabilizzazione dell'HIF da parte degli inibitori della PHD sulla fibrosi renale. In linea con il nostro studio, anche Souma et al.17 lo hanno riportatofibrosi renalenon è influenzato dal knockout concomitante di PHD1, PHD2 e PHD3 nei REPC di topi Tg(Epo-Cre).
Cistanche è buono perrenale
Nel nostro studio, Gli1CreERT2/ plus ; VhlF/F i topi erano caratterizzati sia da una maggiore produzione endogena di EPO che da policitemia. Influenza l'aumento del livello sierico di EPO di policitemiafibrosi renaleè controverso. Esistono studi approfonditi sugli effetti dell'EPO ricombinante esogena su AKI o CKD.53-57 In studi precedenti, è stato riportato che l'EPO ricombinante ad alte dosi causa policitemia, ipertensione e deterioramento della funzione renale.56,58 È interessante notare che alcuni studi hanno rivelato che l'analogo esogeno dell'EPO a basso dosaggio, basso da non indurre l'eritropoiesi, provoca effetti renoprotettivi nel residuorenee modelli di topi db/db.59,60 Inoltre, è stato dimostrato che la flebotomia per normalizzare la policitemia migliora l'aumento dell'albuminuria nei topi db/db sottoposti ad analogo esogeno di EPO ad alte dosi.60 In una coorte clinica di pazienti con policitemia vera, un malattia caratterizzata da policitemia senza aumento dell'EPO endogena,61 la frequenza di CKD (definita come velocità di filtrazione glomerulare stimata<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2="" )="" was="" 27%,="" which="" was="" higher="" than="" in="" the="" general="" population.62,63="" however,="" the="" annual="" decline="" rate="" of="" estimated="" glomerular="" filtration="" rate="" was="" slower="" in="" patients="" with="" polycythemia="" vera="" than="" with="" other="" myeloproliferative="" diseases.="" in="" the="" study="" of="">CreERT2/ più; VhlF/F topi sottoposti a lesione UUO, i nostri dati hanno mostrato un aumento dell'espressione renale di Epo e policitemia, ma nessuna alterazionefibrosi renale, infiammazione e lesione tubulare. Pertanto, gli effetti complessivi della stabilizzazione HIF pericitespecifica su danno renale, infiammazione e fibrosi erano neutri, a sostegno della sicurezza degli inibitori della PHD nella progressione della CKD. I periciti renali possono essere definiti come una popolazione eterogenea di fibroblasti a stretto contatto con le cellule endoteliali nelrene.8–13 A causa della complessità dello sviluppo,64,65 funzione biologica eterogenea,8,11–13,23 e della regolazione differenziale di PHD e HIF,17,41,66 il marcatore genetico ottimale per i periciti renali deve ancora essere definito. Le cellule Gli1 plus soddisfano i criteri morfologici e anatomici per i periciti. Dopo la lesione UUO, le cellule renali Gli1 plus proliferano e si differenziano in miofibroblasti. Le cellule renali Gli1 plus rappresentavano circa il 45% del pool totale di miofibroblasti renali e l'ablazione delle cellule renali Gli1 plus si è ridottafibrosi renale.11,36 Eravamo consapevoli che le cellule renali Gli1 plus sono una sottopopolazione di cellule recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine-b plus 11,36,41 e che gli effetti della manipolazione genetica Gli1 plus pericita-limitata possono essere mascherati da altri fibroblasti. Tuttavia, i nostri esperimenti su cellule renali Gli1 plus ordinate hanno dimostrato che la stabilizzazione HIF era in grado di aumentare l'espressione di Epo ma non di collagene o Acta2 a livello cellulare. Non possiamo escludere la possibilità che la stabilizzazione HIF guidata da altri marcatori periciti possa avere risultati diversi. I topi con Cre ricombinasi sono guidati dal promotore Col1a1, Foxd1 o Pdgfrb non sono stati utilizzati per definire i periciti in questo studio perché la loro Cre ricombinasi è attiva anche nei podociti glomerulari,8 cellule mesangiali glomerulari,67 cellule muscolari lisce vascolari,68 e probabilmente alcuni tubulari cellule epiteliali.69 È stato riportato che il knockout del pVHL nei podociti e nelle cellule tubulari induce patologie renali come la glomerulonefrite a mezzaluna31 e le cisti renali.70 Inoltre, abbiamo utilizzato Cre inducibile per eliminare il PHD2 o il pVHL dopo 5 settimane di età perché Foxd1 è espresso nell'embrione stadio e knockout di pVHL o PHD2 nei periciti che esprimono Foxd1- hanno dimostrato di compromettere la nefrogenesi.71,72
In cellule renali Gli1 plus ordinate con knockout PHD2 utilizzando Gli1CreERT2/ più; Egln1F/F; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi, abbiamo osservato un aumento significativo dell'espressione dell'mRNA di Epo cellulare ma non Col1a1 o Acta2. L'aumento di 50-volte dell'mRNA di Epo ha confermato la sovraespressione di HIF nei periciti renali selezionati Gli1 più con knockout PHD2. Inoltre, il knockout in vivo di pVHL o PHD2 nei periciti Gli1 più ha portato a un aumento dell'espressione renale di Epo e alla policitemia, ma nonfibrosi renale. Riteniamo che se le molecole a valle dell'HIF nei periciti fossero interessatefibrosi renale, sarebbe osservato nel nostro studio. Gli effetti dell'inattivazione di PHD2 sulla stabilizzazione HIF possono essere mascherati dalla ridondanza biologica di PHD1 e PHD3. Tuttavia, abbiamo osservato effetti coerenti sulla produzione di EPO e collagene nei periciti Gli1 più con knockout pVHL o PHD2, supportando ulteriormente la stabilizzazione HIF nei periciti promuove l'eritropoiesi ma nonfibrosi. Non siamo stati in grado di generare Gli1CreERT2/ più;VhlF/F; ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi attraverso l'incrocio di Gli1CreERT2/þ; VhlF/Fe ROSA26fstdPomodoro/fstdPomodorotopi perché sia Vhl che ROSA26 si trovano sul cromosoma 6.
Abbiamo usato UUO come arenemodello di lesione per studiare gli effetti della manipolazione specifica del pericito di HIF sufibrosi renaleperché nel modello UUO la maggior parte dei periciti Gli1 plus si sono differenziati in miofibroblasti e l'ablazione delle cellule Gli1 plus ha migliorato la fibrosi renale.11,36 Il modello UUO è stato anche utilizzato con successo per dimostrare i cambiamenti della produzione di collagene ed EPO durante la transizione pericito-miofibroblasto dal nostro gruppo e altri.14,17,41 Tuttavia, UUO ha i suoi limiti come modello di CKD ei nostri risultati in questo studio potrebbero non essere generalizzati ad altri modelli di CKD. Sono necessari studi futuri per testare gli effetti della manipolazione HIF specifica per i periciti in diversi modelli di CKD.
In conclusione, abbiamo dimostrato che la stabilizzazione HIF di Gli1 più pericitespecifica aumenta l'EPO, l'eritropoiesi, ma non ha alcun impattofibrosinei modelli con o senza lesione UUO. A livello cellulare, la stabilizzazione HIF specifica per Gli1 più pericite aumenta l'espressione di Epo, ma non un'espressione di Col1a1, Col3a1 e Acta2. Il knockout HIF specifico per pericyte non ha avuto effettofibrosi renale, o. Questi risultati forniscono prove sperimentali dell'assenza di effetti negativi degli inibitori della PHD sulla fibrosi renale e sulla progressione della CKD.
Cistanche per migliorarerenefunzione
CHIARIMENTI
Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.
RINGRAZIAMENTI
SYP è supportato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (sovvenzioni 106-2314-B-418-006, 107-2314-B-418-001 e 108-2314-B-418-004) e Far Eastern Memorial Hospital (concede 2017-C-037 e 2020-C- 037). SLL è supportato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia (sovvenzioni 108-2314-B-002-078-MY3 e 109-2314-B-002-260), National Health Research Institutes (sovvenzioni EX108-10633 SI), National Taiwan University Hospital (NTUH; borse 108-T16 e 109-T16), NTUH e NTU College of Medicine (borsa NSCCMOH-131-43), la signora Hsiu-Chin LeeReneResearch Foundation e Taiwan Health Foundation.
Ringraziamo il professor Guo-Hua Fong (Centro sanitario dell'Università del Connecticut) per Egln1F/Ftopi; Dr. Yi-Ting Tsai (NTU College of Medicine) per l'esame patologico di Gli1CreERT2/ più; VhlF/Fe VhlF/Ftopi; e il Dipartimento di ricerca medica di NTUH, il Cell Sorting and Imaging Core Facility del First Core Laboratory, il Transgenic Mouse Model Core Facility e il Gene Knockout Mouse Core Laboratory del NTU College of Medicine per il supporto delle apparecchiature e l'assistenza tecnica.
CONTRIBUTI D'AUTORE
SYP, PZT, YHC, YTC, FCC, YLC e WCC hanno condotto esperimenti e analizzato i dati. SYP, YLC, TH, YMC e TSC hanno partecipato alla progettazione degli esperimenti e all'analisi dei dati. SLL ha ideato e diretto il progetto. SYP e SLL hanno scritto il manoscritto.
MATERIALE SUPPLEMENTARE
File supplementare (PDF)
Metodi Supplementari.
Figura S1. Il peso corporeo, la conta dei globuli bianchi periferici e la conta piastrinica non sono cambiate nei topi con knockout PHD2 specifico per i periciti.
Figura S2. Immagini rappresentative dell'mRNA di Epo rilevati dall'ibridazione in situ dell'RNA nelrenedi Egln1F/F e Gli1CreERT2/þ; Egln1F/F topi. Figura S3. Il knockout globale di PHD2 promuove la produzione di EPO e
eritropoiesi.
Figura S4. Analisi PCR del DNA genomico estratto dalrene, fegato, milza, cuore e polmone in Tg(UBC-CreERT2); Egln1F/F e topi di controllo della cucciolata.
Figura S5. Immagini rappresentative dell'mRNA di Epo rilevati dall'ibridazione in situ dell'RNA nelrenedi topi Egln1F/F.
Figura S6. Immagini rappresentative dei periciti Gli1þ nel CLK e nell'UUOrenidopo l'infortunio UUO.
Figura S7. Effetti a lungo termine della stabilizzazione HIF specifica per periciti in
Gli1CreERT2/þ; topi VhlF/F.
Figura S8. Referto patologico di Gli1CreERT2/ plus ; Topi VhlF/F.
Figura S9. Aumento dei livelli di ematocrito e di EPO sierico in Gli1CreERT2/plus; VhlF/Ftopi.
Figura S10. Analisi PCR direneDNA genomico dopo l'induzione del tamoxifene.
Figura S11. Immagini complete del gel per l'immunoblotting di a-SMA e a[1] tubulina.
Figura S12. Espressione renale di Epo e Acta2 nel VhlF/F e Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi 7 giorni dopo la lesione UUO.
Figura S13. Espressione renale di Epo e Acta2 nel VhlF/F e Gli1CreERT2/ più; VhlF/Ftopi 14 giorni dopo la lesione UUO.
Figura S14.Fibrosi renalenel modello di washout esteso del tamoxifene.
Figura S15. Schema sperimentale per etichettare le cellule renali Gli1þ con tdTomato.
Figura S16. Strategia di gating per lo smistamento delle cellule renali tdTomatoþ.
Figura S17. Convalida dell'espressione di tdTomato e della delezione di Egln1 nelle cellule renali tdTomatoþ selezionate.
Figura S18. Analisi PCR direneDNA genomico da Gli1CreERT2/ plus ; Hif1aF/F; Hif2aF/Fe il compagno di cucciolata Hif1aF/F; Hif2aF/Ftopi di controllo dopo la somministrazione di tamoxifene.
Figura S19. UUO indottofibrosi renalein Gli1CreERT2/ più; Hif1aF/F; Hif2aF/Ftopi dopo alte dosi e un breve periodo di washout di tamoxifene.
Figura S20. UUO indottofibrosi renalein Gli1CreERT2/ più; Hif1aF/F; Hif2aF/F topi dopo metà dose e un lungo periodo di washout di tamoxifene.
Tabella S1. Primer utilizzati per la genotipizzazione.
Tabella S2. Primer utilizzati per la PCR quantitativa.
Macro supplementare. Macro per la quantificazione automatica del picrosirio colorato in rossorenearea di ImageJ.
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