Trapianto di rene

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INTRODUZIONE

Renetrapiantoè la scelta migliore per il trattamento allo stadio terminale della malattia renale cronica. Attualmente, il rigetto mediato da anticorpi (AMR), caratterizzato dalla presenza di un anticorpo donatore specifico (DSA) diretto all'antigene leucocitario umano (HLA), è emersa come la principale causa di danno cronico all'innesto renale, che limita ampiamente la sopravvivenza a lungo termine dell'innesto. (1, 2). Tuttavia, gli schemi esistenti non sono riusciti a ottenere risultati promettenti in ambito clinicotrattamento della resistenza antimicrobica (1, 3, 4). Pertanto, è urgente identificare potenziali biomarcatori e fattori di rischio per l'AMR dopo il trapianto di rene, che è fondamentale per il trattamento e gli esiti dei pazienti.

Prove crescenti suggeriscono che in circostanze infiammatorie, i linfociti B possono differenziarsi in plasmablasti che secernono anticorpi e linfociti B regolatori (Bregs), che sono uno speciale sottoinsieme di cellule B che secernono citochine immunosoppressive, in particolare l'interleuchina (IL)-10. (1, 5–7). Pertanto, i plasmablasti producono alloanticorpi, con conseguente AMR, mentre i Bregs mostrano funzioni immunoregolatorie e aiutano a indurre l'omeostasi immunitaria. Pertanto, è stato riportato che Bregs è strettamente associato alla resistenza all'AMR dopo i trapianti di rene (1, 8, 9).

Sebbene i marcatori di superficie distinti dei sottoinsiemi di Breg non siano stati ancora identificati nell'uomo (1), studi precedenti hanno riportato quattro sottopopolazioni comuni di Bregs: Bregs di memoria (mBregs) definito con CD19 più CD24 più CD27 più (10), Bregs di transizione ( tBregs) definito con CD19 più CD24 più CD38 più (10, 11), IL{10}}produttore di memoria Bregs (IL-10 più mBregs) definito con CD19 più CD24 più CD27 più IL-10 più (12) e la-10-produzione di ILBregs di transizione (IL-10 più tBregs) definito con CD19 più CD24 più CD38 più IL-10 più (13). Laguna-Goya et al. riportato che la riduzione di tBregs e IL-10 più tBregs è positivamente associata al rigetto acuto dopo trapianti di rene (14). Tuttavia, Zhou et al. riportato che mBregs, piuttosto che tBregs, è diminuito significativamente in cinque pazienti con rigetto acuto al post-trapianto di fegato (10). Inoltre, Shabir et al. hanno riferito che i tBregs non erano associati al rigetto dell'allotrapianto renale in tre pazienti con AMR (15). Alla luce di questi risultati incoerenti, è necessario chiarire ulteriormente quale sottopopolazione di Breg svolge un ruolo vitale nei pazienti con AMR dopo un trapianto di rene.

Nel presente studio, le proporzioni di quattro sottopopolazioni di Breg circolanti sono state confrontate tra i gruppi sani, stabili (ST) e AMR. Quindi, è stata determinata la biodistribuzione dei linfociti B, IL{0}} e delle chemochine negli innesti renali di pazienti sani, ST e AMR. Inoltre, sono state studiate le dinamiche delle quattro sottopopolazioni di Breg circolanti nei pazienti con ST per 90 giorni dopo l'intervento chirurgico. Questi risultati attuali, insieme a quelli riportati da studi precedenti (1), suggeriscono che IL-10 più mBregs e IL-10 più tBregs circolanti sono le principali sottopopolazioni Breg che contribuiscono alla resistenza di AMR.

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Parole chiave:Fenotipizzazione Breg, trapianto renale, rigetto anticorpale, omeostasi, dinamica

MATERIALI E METODI

Pazienti e Gruppi

Tutti i pazienti hanno fornito un consenso informato firmato prima dello studio. Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Zhengzhou (2018-KY-72). Il numero di registrazione della sperimentazione clinica è ChiCTR1900022501.

Questi pazienti sono stati divisi in tre gruppi: (1) gruppo di controllo sano (sano, n=9): donatori di rene sani di età compresa tra 18 e 55 anni (senza malattia), composto dai fratelli e dai coniugi dei riceventi; (2) gruppo riceventi con funzione del trapianto stabile (ST, n=25): pazienti di età compresa tra 18 e 55 anni, la cui funzione renale era stabile (senza infezioni o rigetto prima e dopo il trapianto di rene) durante il follow-up periodo (maggiore o uguale a 6 mesi); (3) destinatari con gruppo AMR (AMR, n=18): pazienti di età compresa tra 18 e 55 anni a cui è stata diagnosticata la AMR. Sono stati ottenuti gli innesti renali di riceventi con ST e AMRdonatore di rene sanoS. La diagnosi differenziale tra i gruppi ST e AMR è stata confermata da due patologi renali, secondo il consenso Banff 2017 (3, 16).

Sangue periferico, tessuti renali e campioni cellulari

I campioni di sangue periferico del gruppo sano sono stati raccolti prima dell'operazione ea 1, 7 e 14 giorni dopo l'operazione. I campioni ottenuti dal gruppo ST sono stati raccolti prima dell'operazione ea 1, 7, 14, 30 e 90 giorni dopo l'operazione. I campioni ottenuti dal gruppo AMR sono stati raccolti quando si è verificato il rigetto (prima della terapia anti-rigetto per AMR). Sono state isolate le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).

5 ml di sangue mediante centrifugazione a gradiente Ficoll-Paque e conservato con il 10% di dimetilsolfossido (Solarbio Inc., Pechino, Cina) in azoto liquido.

I campioni di biopsia renale con ago centrale ottenuti dal gruppo sano sono stati raccolti prima dell'intervento chirurgico per biopsie renali di donatori a tempo zero. I campioni di biopsia renale con ago centrale ottenuti dal gruppo ST sono stati raccolti 90 giorni dopo l'operazione dopo che la loro funzione renale si era stabilizzata a causa della biopsia del protocollo. Alla luce della seconda compromissione della funzione renale mediante puntura, tutti i pazienti con AMR hanno rifiutato la biopsia renale con ago centrale dopo la terapia anti-rigetto per AMR. Pertanto, i campioni di biopsia renale con ago centrale dal gruppo AMR sono stati raccolti solo quando si è verificato il rigetto (prima della terapia anti-rigetto per AMR). Un totale di tre donatori sani, nove pazienti ST e nove pazienti AMR hanno fornito un consenso informato firmato prima della biopsia renale con ago centrale. I restanti sei donatori sani, 16 pazienti ST e nove pazienti AMR hanno rifiutato la biopsia renale con ago centrale per paura di emorragie maggiori in associazione alla biopsia. Singole cellule sono state isolate dai campioni bioptici renali con ago centrale di tre donatori sani, tre pazienti con ST e tre pazienti con AMR, combinando la dissociazione meccanica con la degradazione enzimatica della matrice extracellulare, che mantiene l'integrità strutturale dei tessuti (Multi Tissue Dissociation Kit 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania). Le cellule renali sono state conservate con il 10% di dimetilsolfossido (Solarbio Inc., Pechino, Cina) in azoto liquido e i restanti campioni di biopsia renale con ago centrale sono stati incorporati in paraffina a 4 gradi .

Citometria a flusso

Le cellule conservate in azoto liquido sono state rapidamente scongelate a bagnomaria a 37 gradi per 3 minuti. Un totale di 2-3 × 106 PBMC sono stati incubati con il cocktail di stimolazione delle cellule di diluizione 1640 del Roswell Park Memorial Institute (500 ×), che comprendeva il PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Acetate), un ionoforo di calcio (Ionomicina) e inibitori del trasporto proteico Brefeldin A e Monensin, (eBioscience, San Diego, CA), a 37 gradi con il 5% di CO2 per 5 ore. Le cellule morte sono state escluse mediante colorazione con 7-Aminoattinomicina D (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) e i marcatori di superficie di Bregs sono stati colorati con anticorpi marcati con fluorocromo (Brilliant Violet 421™ anti-CD19 umano, ficoeritrina (PE)/Cy7 CD24 antiumano, Alexa FluorR647 CD27 antiumano, Alexa FluorR488

CD38 antiumano e CD45 antiumano Brilliant Violet 510™; i controlli isotipici appropriati: Brilliant Violet 421™ Mouse

Controllo dell'isotipo IgG1 k, controllo dell'isotipo IgG2a k del mouse PE/Cy7, controllo dell'isotipo IgG1 k del mouse Alexa FluorR647, controllo dell'isotipo IgG1 k del mouse Alexa FluorR488 e viola brillante

Controllo isotipo IgG1 k del mouse 510™; Bioleggenda, San Diego, CA,

USA) per 30 min a 4 gradi, con protezione dalla luce. Per la colorazione intracellulare, le cellule sono state colorate con anticorpi mirati alle citochine intracellulari di Bregs (PE anti-IL umana -10; i controlli isotipici appropriati: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, USA) per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Le cellule marcate sono state analizzate utilizzando lo strumento BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, USA). Un totale di 100,{7}} eventi sono stati acquisiti nel gate dei linfociti. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, USA).

Immunoistochimica

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 positività, punteggio=quattro

Analisi statistica

Nello studio caso-controllo nidificato, l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) è stata eseguita da MedCalc v18.11.3. Le restanti analisi statistiche sono state eseguite utilizzando IBM SPSS 21.0. I dati di misurazione normalmente distribuiti con un'omogeneità della varianza sono stati espressi come media ± deviazione standard (x ± s) e analizzati mediante test t per campioni indipendenti (confronti tra gruppi) o analisi della varianza unidirezionale (confronti tra gruppi). I dati di misurazione che non avevano una distribuzione normale o l'omogeneità della varianza sono stati espressi in mediana con intervallo interquartile (IQR) e analizzati mediante il test U di Mann-Whitney (confronti tra gruppi) o il test di Kruskal-Wallis (confronti tra gruppi). I dati di conteggio sono stati analizzati mediante il test c2, un test c2 corretto o il test esatto di Fisher, secondo necessità. Analisi della varianza con misure ripetute unidirezionale

è stato utilizzato in vari momenti. P-valori<0.05 were="" considered="" statistically="">

RISULTATI

Caratteristiche di base dei pazienti

Un totale di nove donatori sani, 25 pazienti ST e 18 pazienti AMR sono stati inclusi nel presente studio. Come mostrato nella Tabella 1, il sesso dei riceventi, l'età, l'indice di massa corporea (BMI), la nefropatia iniziale, il disadattamento HLA, i CNI, il tempo di ischemia calda e il tempo di ischemia fredda non differivano tra i gruppi o tra i gruppi (P > 0.05, per tutti). Tuttavia, l'incidenza sia della positività ai DSA anti-classe I che anti-classe II nel gruppo AMR era significativamente più alta rispetto a quella del gruppo ST (P < 0.001="" per="" anti="" -classe="" i="" dsa,="" p="">< 0,001;="" p="0.001" per="" anti="" classe="" ii="" dsa).="" inoltre,="" rispetto="" ai="" pazienti="" con="" st,="" i="" pazienti="" con="" amr="" avevano="" punteggi="" significativamente="" più="" alti="" in="" termini="" di="" tubulite="" (t),="" infiammazione="" interstiziale="" (i)="" e="" capillare="" peritubulare="" (ptc)="" (p="0.012" per="" t;="" p=""><0.001 per="" i="" e="" ptc)="" ),="" secondo="" la="" classificazione="" di="" banff="" (normale,="" punteggio="0;" lieve,="" punteggio="1;" moderato,="" punteggio="2;" grave,="" punteggio="3)" (3,="" 16)="" (="" tabelle="" supplementari="" 1="" e="">

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