3.2. Effetto della concentrazione del mediatore sulla decolorazione della melanina mediante LMS

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale è il cistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche esbiancamento della pellerisiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi di cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contienecistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, quindiinibendo la produzione di melanina.

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È stato studiato l'effetto della concentrazione del mediatore sulla resa di decolorazione da parte di LMS (Figura 3). L'LMS che utilizzava lacT e 100 µM di acetosiringone ha mostrato la resa di decolorazione più alta, che era 4.4-volte superiore a quella senza il mediatore. L'LMS che utilizzava lacM e 100 µM di acetosiringone ha mostrato la resa di decolorazione più alta, che era 6.7-volte superiore a quella senza il mediatore. Quando lacT è stato utilizzato per LMS, le rese di decolorazione utilizzando acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone sono aumentate con l'aumentare della concentrazione e quindi hanno raggiunto un massimo a concentrazioni di 100, 50 e 200 μM, rispettivamente (Figura 3a). L'acetosiringone e la siringaldeide hanno migliorato in modo più efficiente la resa di decolorazione a una concentrazione inferiore rispetto all'acetovanillone. Quando il pizzo è stato utilizzato per LMS, l'effetto della concentrazione del mediatore è stato molto simile al risultato ottenuto con lacT. Le rese di decolorazione utilizzando acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone hanno raggiunto un massimo a concentrazioni rispettivamente di 100, 50 e 200 μM (Figura 3b). Una concentrazione di mediatore di oltre 200 µM ha ridotto significativamente la resa di decolorazione (dati non mostrati). Pertanto, un mediatore di 100 µM è stato scelto come concentrazione ottimale per i seguenti esperimenti. Loret et al. riferito che dovrebbe essere utilizzata la concentrazione ottimale del mediatore perché la laccasi può essere inattivata da un'alta concentrazione di mediatore [6], mentre Khammuang e Sarnthima hanno riferito che l'attività di decolorazione della melanina di LMS utilizzando vanillina e acido vanillico non è stata significativamente influenzata da alte concentrazioni di fino a 10 mm [28]. La concentrazione ottimale del mediatore può dipendere dal tipo di mediatore e dal composto bersaglio della reazione catalizzata dalla laccasi [5,6]. Quando l'LMS catalizzava la degradazione dell'isoproturon, la resa della degradazione aumentava con l'aumentare delle concentrazioni di acetosiringone, mentre le concentrazioni di vanillina e siringaldeide non erano correlate alla resa della degradazione [7].

3.3. Citotossicità dei mediatori naturali

Per utilizzare mediatori naturali come ingredienti cosmetici sbiancanti per la pelle, è stata studiata la citotossicità dei mediatori (acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone) utilizzando la linea cellulare di melanoma B16F10. I mediatori naturali sono stati trattati sulle cellule in coltura e la vitalità cellulare è stata misurata mediante il saggio NR. Quando sono stati aggiunti mediatori di oltre 22 mM alle cellule in coltura, hanno ridotto notevolmente la vitalità cellulare (Figura 4). Quando la concentrazione del mediatore era superiore a 5 mM, la vitalità cellulare aumentava nel seguente ordine: acetosiringone > siringaldeide > acetovanillone. Inoltre, i mediatori inferiori a 1 mM non hanno mostrato alcun effetto inibitorio sulle cellule di melanoma B16F10. Questi risultati indicano che la concentrazione ottimale del mediatore di 0,1 mM utilizzata in questo lavoro ha mostrato una citotossicità trascurabile.

3.4. L'effetto del pH sulla decolorazione della melanina mediante LMS

La Figura 5 mostra l'effetto del pH sulla resa di decolorazione LMS. La mancanza di un mediatore ha mostrato la più alta resa di decolorazione a pH 4 e la resa di decolorazione è diminuita con l'aumento del pH (Figura 5a). Questo profilo è simile all'effetto del pH sull'ossidazione di ABTS catalizzata dalla laccasi [37]. In generale, lacT ha un'attività ottimale in condizioni acide inferiori a pH 5 e la sua attività diminuisce con un aumento del pH. A pH più elevati, gli anioni idrossido si combinano con i rame T2/T3 di lacT e disturbano il trasferimento di elettroni e causano una diminuzione dell'attività catalitica. Tuttavia, l'effetto del pH su LMS è più complicato e può essere influenzato dall'attività e dalla stabilità della laccasi e dei mediatori ossidati [1,7]. La resa di decolorazione di lacT con acetosiringone è aumentata con l'aumento del pH fino a 7 (41%). Le rese di decolorazione ottimali di lacT con siringaldeide e acetovanillone erano rispettivamente del 32% e del 42% a pH 6. Sebbene la mancanza mostrasse un'attività catalitica inferiore a pH più elevato, la decolorazione della melanina aumentava con l'aumento del pH. Questi risultati potrebbero essere spiegati dall'elevata attività e stabilità delle forme ossidate dei mediatori naturali a pH elevato.

Il lacM senza mediatore ha mostrato la più alta resa di decolorazione a pH 6 e lacM ha mostrato una resa di decolorazione inferiore in tutti gli intervalli di pH rispetto all'ultimo. Il pH ottimale del pizzo era di circa 6 per l'ossidazione di ABTS [38]. Pertanto, il pH ottimale di lacM senza un mediatore era simile a quello di lacM per l'ossidazione di ABTS. Quando i mediatori naturali sono stati utilizzati con lacM, le rese di decolorazione erano fortemente dipendenti dal pH della reazione (Figura 5b). La resa di decolorazione di lacM con mediatori naturali aumentava con l'aumentare del pH fino a pH 7. Le rese di decolorazione massime di lacM con acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone erano rispettivamente del 40%, 32% e 33% a pH 7. L'alto livello di melanina l'attività di decolorazione a pH neutro rende migliore per la pelle l'uso di LMS con mediatori naturali perché l'intervallo di pH ottimale è simile a quello della pelle normale (intorno a 5,5).

3.5. Studio cinetico della decolorazione della melanina mediante LMS

Uno studio cinetico sulla decolorazione della melanina mediante LMS con acetosiringone è stato studiato quantitativamente per comprendere l'effetto potenziante dei mediatori naturali (Tabella 1). Il valore Km di lacT senza mediatore era 10.6-volte superiore a quello di lacT con acetosiringone. Ciò significa che l'affinità per la melanina è stata notevolmente migliorata dall'uso di un mediatore. Il valore cat di lacT con il mediatore era 22.6-volte superiore a quello di lacT senza mediatore. Ciò indica che il tasso di decolorazione è stato notevolmente aumentato dal mediatore. La costante di specificità (kcat/Km) di lacT è stata migliorata 247 volte utilizzando l'acetosiringone come mediatore. Questi risultati mostrano chiaramente che l'accesso limitato della melanina al sito attivo della laccasi è stato superato dall'acetosiringone. Il valore Km di lacM senza mediatore era 2.4-volte superiore a quello di lacM con acetosiringone. L'affinità della melanina può essere migliorata utilizzando un mediatore. Tuttavia, l'effetto crescente per l'affinità alla melanina da parte di lacM con acetosiringone era inferiore a quello di lacT con acetosiringone. Il valore del gatto del pizzo era circa il 26 percento di quello degli ultimi tempi. Il pizzo senza mediatore ha mostrato un'attività molto bassa per la decolorazione della melanina. Tuttavia, il valore cat di lacM con il mediatore era 161-volte superiore a quello di lacM senza mediatore. Il tasso di decolorazione da parte di lacM è stato notevolmente aumentato dal mediatore. Pertanto, la costante di specificità del pizzo è stata migliorata di 334 volte utilizzando l'acetosiringone come mediatore. Questi risultati dimostrano l'utilità dell'acetosiringone come mediatore delle laccasi per la decolorazione della melanina.

3.6. Decolorazione del film di melanina/cellulosa mediante LMS

È stato preparato un film di idrogel composto di melanina/cellulosa per imitare la melanina nella pelle. Il film di idrogel di melanina/cellulosa potrebbe essere preparato dalla co-dissoluzione di melanina e cellulosa in [Emim][Ac], che è seguita dalla rigenerazione con acqua. Il film ottenuto presentava un colore marrone scuro trasparente. La decolorazione del film di idrogel di melanina/cellulosa è stata eseguita mediante lacM con acetosiringone in tampone fosfato di acido citrico 0.1 M (pH 5,5). Il colore del film di melanina/cellulosa è cambiato da marrone scuro a marrone chiaro dopo la reazione catalizzata da LMS (Figura 6a). Quando l'assorbanza del film di melanina/cellulosa è stata misurata dopo la reazione di decolorazione nell'intervallo 400-700 nm, l'assorbanza del film di melanina/cellulosa è diminuita significativamente nell'intero intervallo di lunghezze d'onda (Figura 6b). La decolorazione della melanina è stata confermata anche attraverso la misurazione dei valori di colore (L*, a* e b*) del film di melanina/cellulosa utilizzando un colorimetro. I valori ∆L, ∆E, YI e WI sono stati calcolati dai parametri del colore (Tabella 2). Dopo la reazione di decolorazione della melanina mediante LMS, il valore L* (chiarezza) del film di melanina/cellulosa è stato notevolmente aumentato, mentre i valori a* (rossore) e b* (giallo) sono leggermente diminuiti. Il valore ∆E che rappresenta la differenza di colore tra i campioni era 31,1. Un valore di ∆E maggiore di 12 indica che i colori del film prima e dopo la reazione sono molto diversi tra loro [31]. Il giallo (YI) del film è diminuito da 209 a 92 dopo la reazione di decolorazione, mentre il bianco (WI) è aumentato da 16 a 43. Łopusiewicz et al. ha riportato che l'YI del film di poli(acido lattico)/melanina aumentava con l'aumentare del contenuto di melanina, mentre il WI del film diminuiva [32]. Pertanto, i cambiamenti nelle proprietà del colore spiegano quantitativamente la decolorazione della melanina nella pellicola di idrogel di melanina/cellulosa. Questi risultati mostrano che LMS può decolorare efficacemente la melanina in un ambiente di idrogel di cellulosa.

3.7. Decolorazione della melanina naturale prodotta dalle cellule del melanoma

La melanina naturale nella pelle umana è suddivisa in eumelanina (dal nero al marrone) e feomelanina (dal giallo al rosso), mentre la melanina sintetica preparata dall'ossidazione della tirosina con perossido di idrogeno è un analogo dell'eumelanina. Pertanto, in questo lavoro è stata studiata anche la decolorazione della melanina naturale prodotta dalle cellule di melanoma. La decolorazione della melanina sintetica e della melanina naturale mediante LMS con pizzo e acetosiringone è stata confrontata misurando l'assorbanza nell'intervallo 400-700 nm (Figura 7). L'assorbanza della melanina sintetica è diminuita rapidamente con l'aumentare del tempo di reazione a tutte le lunghezze d'onda. Tuttavia, l'assorbanza della melanina naturale decolorata ha mostrato un modello diverso rispetto a quello della melanina sintetica decolorata. L'assorbanza della melanina naturale decolorata è diminuita a lunghezze d'onda superiori a 450 nm, mentre l'assorbanza è aumentata a lunghezze d'onda inferiori a 450 nm. Sono necessari ulteriori studi per comprendere l'aumento dell'assorbanza della melanina naturale decolorata.

4. Conclusioni

In questo studio, la decolorazione della melanina è stata ottenuta utilizzando il sistema "O2/laccase/mediator", poiché la laccasi ha mostrato una bassa attività catalitica per l'ossidazione diretta della melanina a causa del suo basso potenziale redox e dell'accesso limitato della melanina nel sito attivo della laccasi. Sette tipi di mediatori naturali sono stati utilizzati con successo per sostituire i mediatori sintetici (HOBt) per la decolorazione della melanina mediante LMS utilizzando lacT e lace. Tra i mediatori naturali testati, l'acetosiringone e la siringaldeide, contenenti due gruppi metossi, hanno mostrato alti tassi di decolorazione e rese. Anche l'acetovanillone contenente un gruppo metossi e un gruppo chetonico ha mostrato un'elevata resa di decolorazione nello stato di equilibrio. L'LMS con mediatori naturali ha mostrato un'elevata attività di decolorazione al pH della pelle normale e la citotossicità dei mediatori naturali era molto bassa. Uno studio cinetico di LMS utilizzando l'acetosiringone per la decolorazione della melanina ha dimostrato che l'acetosiringone ha superato efficacemente i limiti di lacT e lacM aumentando l'affinità per la melanina e l'attività di decolorazione. LMS con acetosiringone ha decolorato la melanina presente nel film di idrogel di cellulosa, che imita la pelle. Inoltre, LMS con acetosiringone potrebbe decolorare non solo gli analoghi sintetici dell'eumelanina preparati dall'ossidazione della tirosina, ma anche la melanina naturale prodotta dalle cellule di melanoma. Pertanto, LMS che utilizza mediatori naturali può essere utilizzato come efficace agente sbiancante per la pelle nell'industria cosmetica.

Materiali supplementari:I seguenti sono disponibili online, Figura S1: La decolorazione della melanina da parte di LMS utilizzando laccasi da T. versicolor e M. thermophila, Figura S2: Il tasso iniziale per la reazione di decolorazione della melanina da parte di laccasi da T. versicolor e M. thermophila.

Contributi dell'autore:Concettualizzazione, SP, DJ e SHL; Cura dei dati, SHL; Analisi formale, SP; Acquisizione di finanziamenti, SHL; Indagine, SP, DJ e HD; Metodologia, SP, DJ e HD; Amministrazione del progetto, SHL; Risorse, SHL; Software, JY, DL e SH; Supervisione, SHL; Convalida, JY, DL, SH e SHL; Visualizzazione, JY, DL e SH; Scrittura: bozza originale, SP e DJ; Scrittura—revisione e modifica, SHL Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:Questo lavoro è stato sostenuto dalla Konkuk University nel 2018.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato:Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:Non applicabile.

Conflitto di interessi:Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

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