LIMIT è un LncRNA immunogenico nell'immunità e nell'immunoterapia del cancro

Astratto

MHC-I presenta antigeni tumorali alle cellule T CD8+ e attiva l'immunità antitumorale. Gli esseri umani possono avere 30,000-60,000 RNA non codificanti (lncRNA) lunghi. Tuttavia, resta poco chiaro se gli lncRNA possano influenzare l’immunità tumorale. Qui identifichiamo un LncRNA, in grado di indurre MHC-I e immunogenicità del tumore (LIMIT) nell'uomo e nei topi. Abbiamo scoperto che l'IFN ha stimolato il cluster di geni LIMIT, la proteina legante il guanilato attivata cis (GBP) e che i GBP hanno interrotto l'associazione tra HSP90 e il fattore di shock termico -1 (HSF1), con conseguente attivazione di HSF1 e trascrizione di MHC-I macchinari, ma non PD-L1. L’attivazione CRISPR guidata da RNA di LIMIT ha potenziato GBP e MHC-I e ha potenziato l’immunogenicità del tumore e la terapia checkpoint.

Il silenziamento di LIMIT, GBP e/o HSF1 ha diminuito l’MHC-I, ha compromesso l’immunità antitumorale e ha ridotto l’efficacia dell’immunoterapia. Clinicamente, le trascrizioni e le proteine ​​di segnalazione LIMIT, GBP e HSF1- erano correlate con MHC-I, cellule T infiltranti il ​​tumore e risposta al blocco dei checkpoint nei pazienti affetti da cancro. Complessivamente, dimostriamo che LIMIT è un lncRNA immunogenico antitumorale precedentemente sconosciuto e che l'asse LIMIT-GBP-HSF1 può essere indirizzato all'immunoterapia antitumorale.

Parole chiave 

RNA lungo non codificante; LIMITE; MHC-I; IFN; STERLINA INGLESE; HSF1; HSP90; PD-L1; DP-1; Immunità delle cellule T; immunoterapia contro il cancro

introduzione

Il blocco dei checkpoint libera il potere immunitario mediato dalle cellule T CD8+ contro il cancro1. Il complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) svolge un ruolo chiave nel priming e nell'attivazione delle cellule T CD8+2. Tuttavia, l'MHC-I è spesso sottoregolato nelle cellule tumorali, con conseguente evasione immunitaria del tumore e resistenza all'immunoterapia3,4. È importante capire come recuperare l'espressione tumorale di MHC-I e rivitalizzare la risposta immunitaria antitumorale5. Gli LncRNA stanno emergendo rapidamente insieme al progresso nel sequenziamento profondo dell'RNA, coprendo molti più loci nel genoma umano rispetto ai geni codificanti proteine6. Gli LncRNA regolano i geni codificanti le proteine ​​a più livelli7-9 e svolgono un ruolo fondamentale nell'imprinting genomico10, nella differenziazione cellulare11 e nella progressione del cancro12. Tuttavia, l’identità, la modalità di azione, la funzione e la rilevanza clinica di specifici lncRNA nell’immunità e nell’immunoterapia del cancro rimangono sconosciute. Qui, identifichiamo LIMIT come un lncRNA immunogenico antitumorale precedentemente sconosciuto. LIMIT influenza il meccanismo MHC-I e l'immunità antitumorale. Abbiamo scoperto che LIMIT prende di mira localmente le GBP, formando così una cascata molecolare di LIMIT-GBP-HSF1-MHC per alterare l'immunità antitumorale e l'efficacia dell'immunoterapia tumorale. Il nostro lavoro non solo rivela la biologia precedentemente sconosciuta di un lncRNA immunogenico, LIMIT, ma suggerisce anche che l'asse LIMIT-GBP-HSF1 può essere bersaglio dell'immunoterapia antitumorale.

LIMIT è un lncRNA immunogenico

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Per esplorare i geni regolatori sconosciuti nell'immunità tumorale, sulla base dell'infiltrazione di cellule T CD8+ tumorali, abbiamo diviso il melanoma umano (TCGA, SKCM) in tipi di tumore caldi e freddi e analizzato le correlazioni dei geni immunogenici. Oltre alle trascrizioni CD8A, IFN e MHC-I (HLA-ABC), abbiamo scoperto che un candidato lncRNA era arricchito nel tumore caldo, tra 3926 candidati lncRNA annotati da GENCODE13 (Fig. 1a; Tabella supplementare 1). Sulla base di studi funzionali nei seguenti esperimenti, abbiamo designato questo candidato lncRNA come LIMIT: lncRNA Inducing MHC-I e Immunogenicità del tumore (LIMIT). Nel set di dati sul melanoma umano, i livelli di LIMIT erano correlati positivamente con quelli di IFN, MHC-I e CD8 (Fig. 1b-d). In linea con ciò, la Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ha rivelato che l'espressione LIMIT era correlata ai geni di risposta IFN, alla presentazione dell'antigene tramite MHC-I e all'attivazione immunitaria (Fig. 1e-h). Inoltre, i livelli di LIMIT erano correlati con tassi di risposta migliorati dell'immunoterapia al checkpoint 14-17 (Fig. 1i) ed erano associati alla sopravvivenza nei pazienti con melanoma (Fig. 1j). Inoltre, l'espressione di LIMIT era correlata con IFN, MHC-I e CD8 in più tipi di cancro (dati estesi Fig. 1a-l). Pertanto, LIMIT è un potenziale lncRNA immunogenico.

Abbiamo convalidato se LIMIT è un lncRNA. Il Northern blotting ha mostrato che LIMIT era lungo circa 2 kb nelle cellule di melanoma umano A375 (Fig. 1k). Abbiamo applicato una rapida amplificazione delle estremità del cDNA (RACE) e caratterizzato le estremità del cDNA di LIMIT sia nelle cellule di melanoma umano (A375) che in quelle di topo (B16) (Fig. 1l, m). Successivamente, abbiamo clonato l'intera lunghezza di LIMIT sia negli esseri umani che nei topi e l'abbiamo allineata con le corrispondenti sequenze del genoma (Dati estesi Fig. 2a, b). Il LIMITE umano era situato nel cromosoma 1, con 1967 nucleotidi e 6 esoni (Dati estesi Fig. 2a), mentre il limite del topo era situato nel cromosoma 3, con 1634 nucleotidi e 7 esoni (Dati estesi Fig. 2b). LIMIT non conteneva una sequenza Kozak valida. Quando abbiamo preparato l'RNA dalle frazioni nucleari e citoplasmatiche delle cellule A375, LIMIT è stato rilevato principalmente nella frazione nucleare (Fig. 1n). Pertanto, LIMIT non ha potenziale di codifica proteica. Collettivamente, LIMIT soddisfa tutti i criteri per essere definito un lncRNA. In particolare, nel locus LIMIT, un candidato lncRNA, uno pseudogene di GBP1 (GBP1P1) è stato trovato nel carcinoma epatocellulare (HCC)18. Tuttavia, LIMIT ha mostrato basse somiglianze con GBP1P1 o GBP1 (Dati estesi Fig. 2c, Tabella supplementare 2). Pertanto, LIMIT non è GBP1P1. Un'elevata correlazione tra LIMIT e la firma genica reattiva all'IFN (Fig. 1e) suggerisce che l'IFN può stimolare l'espressione LIMIT. Infatti, il trattamento con IFN ha indotto l'espressione di LIMIT, come mostrato dal Northern blotting (Fig. 1k) e dall'RNA-seq nelle cellule A375, HT29, Meijuso e A549 (Fig. 1o). Tuttavia, il trattamento con altre citochine, come IFN e TNF, non è riuscito a indurre l'espressione LIMIT (Fig. 1k). Inoltre, l'IFN non è riuscito a indurre LIMITE nelle cellule A375 knockout (KO) STAT1 (Fig. 1p). Quindi, LIMIT è un lncRNA reattivo all'IFN precedentemente sconosciuto sia nelle cellule umane che in quelle di topo.

LIMIT aumenta l'espressione di MHC-I

Benefici dell'integratore Cistanche: come rafforzare il sistema immunitario

Fare clic qui per visualizzare i prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Richiedi di più】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Per studiare la funzione di LIMIT nelle cellule tumorali, abbiamo prima abbattuto LIMIT con piccoli RNA a forcina (shLIMIT). Abbiamo utilizzato lo strumento Blast per selezionare LIMIT shRNA che non hanno candidati fuori target (Tabelle Supplementari 3-6). ShLIMIT non ha preso di mira i geni che codificano la GBP (Dati estesi Fig. 3a). Nelle cellule A375, shLIMIT ha soppresso l'espressione LIMIT (Fig. 2a), ma non ha influenzato la fosforilazione di STAT1 (Fig. 2b) in risposta all'IFN, suggerendo che LIMIT non ha influenzato la segnalazione globale del gene IFN. MHC-I e PD-L1 sono geni bersaglio dell'IFN19-21. ShLIMIT ha portato a una diminuzione dell'espressione di MHC-I (Fig. 2c), ma non di PD-L1 (Extended Data Fig. 3b), in risposta alla stimolazione dell'IFN. In linea con questi dati umani, il limite di silenziamento nella cellula di melanoma murino YUMM1.7 o nella cellula di cancro del colon CT26 ha comportato una ridotta espressione di MHC-I in risposta all'IFN (Fig. 2d-g). Nelle cellule A375, shLIMIT ha influenzato non solo l'espressione di MHC-I (HLA-ABC, HLA-E e HLA-F) ma anche l'espressione di MHC-II (HLA-DRA e HLA-DMA); mentre LIMIT non ha alterato l'espressione genica di segnalazione di altri IFN (Dati estesi Fig. 3c). Pertanto, LIMIT partecipa alla regolazione dell'espressione di MHC-I e MHC-II indotta dall'IFN senza alterare la via di segnalazione globale dell'IFN.

LIMIT è un gene interrotto con grandi introni, che occupa circa 17 kb nel genoma. Non siamo riusciti a eliminare il locus LIMIT con sgRNA e Cas9 accoppiati. Dato che ci sono 5 siti di legame STAT1 / IRF1 previsti nel promotore LIMIT, abbiamo progettato 4 sgRNA accoppiati per eliminare questi siti di legame nel promotore LIMIT (Dati estesi Fig. 3d). Abbiamo generato cellule A375 con l'eliminazione del promotore LIMIT in tutte e 4 le combinazioni di sgRNA. Abbiamo scoperto che l'IFN non era più efficiente nell'indurre l'espressione di LIMIT e MHC-I nelle cellule tumorali con delezione del promotore LIMIT rispetto alle cellule wild-type (Fig. 2h, i). Abbiamo inoltre utilizzato un sistema di attivazione CRISPR guidato da RNA per attivare l'espressione del limite nelle cellule tumorali22. Abbiamo stabilito 4 RNA guida mirati alla regione del promotore di Limit (sgLimit) e co-espressi con dCas9-VPR, un attivatore trascrizionale tripartito fuso con Cas9 nucleasi-null, nelle cellule B16 (Extended Data Fig. 4a). Tutti e 4 i sgLimit hanno migliorato l'espressione di Limit, così come MHC-I (Extended Data Fig. 4b, c). Quando abbiamo trasfettato cellule B16 con sgLimit in pool e sgRNA non mirati (sgNT), sgLimit ha indotto l'espressione di Limit e MHC-I, ma non di PD-L1 (Fig. 2j, k). Pertanto, Limit prende di mira selettivamente MHC-I, ma non PD-L1. Nel complesso, gli esperimenti di perdita e guadagno di funzione dimostrano che LIMIT può alterare l'espressione di 1.5-3 volte-MHC-I in più cellule tumorali nei topi e negli esseri umani. Successivamente abbiamo studiato se l'espressione MHC-I alterata da LIMIT influisca sull'uccisione tumorale mediata dalle cellule T CD8+ specifica per TAA in vitro. A tal fine, abbiamo prima eliminato geneticamente il B2M con shRNA specifici nell'ovoalbumina (OVA)--che esprimono cellule B16. shRNA-B2M ha comportato una riduzione di 1.5-volte nell'espressione OVA-H2Kb (Dati estesi Fig. 4d). Quando le cellule B16-OVA che trasportavano shFluc e shB2M sono state incubate con cellule OT-I, abbiamo osservato una diminuzione dell'uccisione delle cellule OVA shB2M-B16-mediata da OT-I rispetto a shFluc-B{{63 }}Celle OVA (Dati estesi Fig. 4e-g). I dati suggeriscono che cambiamenti 1.5-3-volte nell'espressione MHC-I controllata da LIMIT potrebbero essere funzionalmente rilevanti nell'influenzare le attività CTL specifiche del TAA. Per convalidare ciò, abbiamo attivato LIMIT nelle celle B16-OVA che esprimono gommalacca e shB2M. Come previsto, l'attivazione CRISPR di LIMIT ha indotto un'espressione minima di MHC-I nelle cellule shB2M, rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2l). Di conseguenza, le cellule OT-I mediavano un'uccisione minima del tumore nelle cellule shB2M-OVA-B16 rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2m, n). I dati suggeriscono che l'espressione di MHC-I indotta da LIMIT è importante nell'attivazione e nella funzione delle cellule T specifiche del TAA. Le cellule presentanti l'antigene (APC), inclusi i macrofagi e le cellule dendritiche (DC), esprimono MHC-I, presentano antigeni e attivano le cellule T specifiche del TAA. Abbiamo esteso i nostri studi dalle cellule tumorali alle APC. L'IFN ha potentemente stimolato l'espressione limite nelle DC e nei macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (Dati estesi Fig. 4h, i). Abbiamo trasfettato i macrofagi con siRNA marcato con 5'FAM targeting Limit (siLIMIT). L'abbattimento di LIMIT ha comportato una minore espressione di MHC-I in risposta alla stimolazione dell'IFN, rispetto al controllo (Dati estesi Fig. 4j, k). Pertanto, LIMIT è un lncRNA responsivo all'IFN e può promuovere l'espressione di MHC-I sia nelle cellule tumorali che nelle APC.

LIMIT migliora l'immunità antitumorale

Benefici della cisanche tubulosa-Antitumor

Un'espressione insufficiente di MHC-I conferisce evasione immunitaria del tumore e resistenza all'immunoterapia3. Per comprendere il ruolo del limite nelle risposte immunitarie antitumorali in vivo, abbiamo inoculato cellule tumorali YUMM1.7 di controllo (shFluc) e con silenziamento limite (shLimit) in NOD scid c-deficiente (NSG, immunodeficiente) e wild-type C57BL/6 topi (immunocompetenti). Rispetto ai tumori di controllo, i tumori shLimit YUMM1.7 sono cresciuti in modo comparabile nei topi NSG (Fig. 3a), mentre sono progrediti più velocemente nei topi wild-type (Fig. 3b). Inoltre, abbiamo inoculato tumori shLimit CT26 in topi BALB/c wild-type. Ancora una volta, il limite di silenziamento ha comportato una maggiore crescita del tumore CT26 nel modello immunocompetente (Fig. 3c). I dati suggeriscono che il limite di silenziamento può compromettere l’immunità antitumorale e facilitare la crescita del tumore in modo immuno-dipendente. A sostegno di ciò, abbiamo rilevato una riduzione delle cellule T CD3+, IFN + e TNF + nei tumori shLimit YUMM1.7 (Fig. 3d, e). Insieme, il silenziamento del Limit compromette l’immunità antitumorale. Per determinare l'espressione di MHC-I e MHC-I: SIINFEKL in vivo, abbiamo stabilito cellule YUMM1.7 che esprimono stabilmente OVA (YUMM1.7-OVA) e trasdotte con shRNA mirato a Limit o Fluc. Dopo il trattamento con IFN, abbiamo rilevato una ridotta espressione superficiale di OVA-H2Kb nelle cellule shLimit-YUMM1.7 (Dati estesi Fig. 5a). Abbiamo inoculato cellule shLimit YUMM1.7-OVA e cellule shFluc-YUMM1.7-OVA in topi C57BL/6. Quindi, abbiamo sezionato i tessuti tumorali e rilevato l'espressione di H2Db e OVA-H2Kb nelle cellule tumorali. Abbiamo osservato una riduzione di H2Db e OVA-H2Kb nelle celle shLimit-YUMM1.7-OVA rispetto alle celle di controllo (Dati estesi Fig. 5b-f). I dati indicano che il limite può influenzare MHC-I e MHC-I: espressione dell'antigene in vivo. Abbiamo inoltre inoculato cellule B16 di controllo (sgNT) e di attivazione del limite (sgLimit) in topi C57/BL6 wild-type. Come previsto, sgLimit (attivazione del limite) ha ridotto drasticamente la crescita del tumore (Fig. 3f). Ciò è stato accompagnato da un aumento del numero e dell'attivazione delle cellule T infiltranti il ​​tumore (Fig. 3g, h). Il melanoma B16 è un modello tumorale relativamente insensibile al blocco PD-L123. Coerentemente con ciò, il blocco di PD-L1 non è riuscito a controllare la crescita del tumore sgNT B16 nei topi. È interessante notare che l'attivazione del limite nel tumore B16 con la risposta del tumore sensibilizzata sgLimit al blocco PD-L1, come mostrato dalla ridotta progressione del tumore (Fig. 3i). Nel complesso, Limit potenzia l’immunità del tumore e sensibilizza la risposta immunoterapica del tumore.

LIMIT cis-attiva le GBP per potenziare l'MHC-I e l'immunità ai tumori

Successivamente abbiamo esplorato il modo in cui LIMIT influisce sull'MHC-I e sull'immunità al tumore. Gli LncRNA possono regolare localmente l'espressione dei geni vicini24. LIMIT è localizzato strettamente in un cluster di geni, proteine ​​leganti il ​​guanilato (GBP), sia nel genoma umano che in quello del topo (Dati estesi Fig. 2a, b). Abbiamo chiesto se LIMIT potrebbe regolare l’espressione delle GBP. Il silenziamento LIMIT ha ridotto i livelli di mRNA precursori e maturi di GBP (Fig. 4a) e di proteine ​​GBP1-5 (Fig. 4b) nelle cellule umane A375 in risposta al trattamento con IFN. I dati suggeriscono che LIMIT può promuovere la trascrizione di GBP in cis. A sostegno di questa possibilità, il silenziamento Limit ha anche diminuito l'espressione di Gbp2 nelle cellule YUMM1.7 e CT26 del topo (Dati estesi Fig. 6a, b). Inoltre, l'attivazione di CRISPR di Limit ha indotto l'espressione di Gbp2 nelle cellule B16 (Fig. 4c). Per verificare se LIMIT potesse transregolare le GBP, abbiamo forzato l'espressione del cDNA LIMIT nelle cellule A375. Abbiamo scoperto che GBP1 e diversi fattori immunitari (inclusi IRF1, HLA-ABC e PD-L1) erano inalterati dalla sovraespressione di LIMIT (Dati estesi Fig. 6c). Pertanto, LIMIT è un lncRNA ad azione cis in grado di indurre l'espressione di GBP. Tra i membri della famiglia Gbp, Gbp2 è un membro predominante della famiglia Gbp nelle cellule di topo (Dati estesi Fig. 6d). Per verificare se LIMIT può regolare MHC-I tramite GBP, abbiamo stabilito cellule YUMM1.7 stabili che trasportano gommalacca, shLimit, shGbp2 o shLimit più shGbp2. Abbiamo scoperto che in risposta alla stimolazione dell'IFN, shLimit e shGbp2 hanno portato a una diminuzione comparabile nell'espressione di Gbp2 e MHC-I; il silenziamento simultaneo di Limit e Gbp2 non è riuscito a alterare ulteriormente l'espressione di Gbp2 e MHC-I (Fig. 4d, e). Inoltre, ci siamo chiesti se la sovraespressione della GBP possa salvare l'espressione downregolata di MHC-I nel limite dell'abbattimento delle cellule tumorali. Abbiamo forzato l'espressione di GBP1 nelle cellule shLIMIT A375 (GBP1OE) e abbiamo trattato queste cellule con IFN. Abbiamo osservato che shLIMIT ha comportato una ridotta espressione di MHC-I nelle cellule di controllo, ma non nelle cellule GBP1OE (Dati estesi Fig. 6e). L'espressione di PD-L1 e IRF1 non è stata influenzata da shLIMIT o GBP1OE (Dati estesi Fig. 6e, f). Pertanto, Limit può regolare l'espressione di MHC-I in modo dipendente dalla GBP. Successivamente abbiamo inoculato le cellule YUMM1.7 con silenziamento Limit e/o Gbp2- nei topi C57BL/6. Il silenziamento del limite e il silenziamento dei GBP hanno comportato in modo simile una crescita del tumore più rapida rispetto al gruppo di controllo, mentre il silenziamento simultaneo di LIMIT e GBP non ha influenzato ulteriormente la progressione del tumore (Fig. 4f). Inoltre, abbiamo rilevato una diminuzione del numero di cellule T infiltranti il ​​tumore e l'attivazione nei tumori shLimit, nei tumori shGbp2 e nei tumori shLimit più shGbp2 (Fig. 4g e Dati estesi Fig. 6g). Insieme, LIMIT aumenta l’espressione di MHC-I e l’immunità al tumore in modo dipendente dalla GBP. I GBP sono geni che rispondono all'IFN nei fibroblasti25 e nei macrofagi26 nel contesto della difesa dell'ospite contro i patogeni. Tuttavia, il ruolo delle GBP nell’immunità al cancro è sconosciuto. Dato che il silenziamento dei GBP ha ridotto l'espressione di MHC-I e l'attivazione delle cellule T CD8+ (Fig. 4g e Dati estesi Fig. 6g), abbiamo ipotizzato che i GBP potrebbero influenzare l'efficacia dell'immunoterapia contro il cancro. Per verificare questa ipotesi, abbiamo silenziato Gbp2 nelle cellule MC38, un modello tumorale sensibile all'immunoterapia23. Come previsto, il silenziamento di Gbp2 nelle cellule MC38 ha ridotto l'espressione di MHC-I dopo il trattamento con IFN (Fig. 4h) e ha ampiamente annullato l'efficacia del blocco PD-L1 (Fig. 4i). Ciò, insieme ai dati sopra menzionati, suggerisce il coinvolgimento di LIMIT e GBP nel controllo dell’efficacia dell’immunoterapia contro il cancro. A sostegno di questa possibilità, l'analisi dei dati clinici ha rivelato che alti livelli di espressione di GBP erano correlati con LIMIT, espressione di MHC-I e risposta immunoterapica (Dati estesi Fig. 6h-j) in pazienti con melanoma14-17. Inoltre, i livelli di espressione della GBP erano positivamente associati alla sopravvivenza del paziente (Extended Data Fig. 6k). Per verificare se i GBP sono geni responsivi all'IFN nelle cellule tumorali, abbiamo stimolato le cellule A375 con IFN e altre citochine. I GBP sono stati indotti dall'IFN, ma minimamente influenzati da altre citochine immunitarie (Fig. 4j). Successivamente, abbiamo utilizzato il sistema CRISPR-Cas9 per individuare le sequenze condivise tra GBP1-5 e generato celle A375 GBP1-5 knockout (KO) (Fig. 4k). Abbiamo osservato che l'IFN stimolava scarsamente le trascrizioni del macchinario genetico MHC-I (Fig. 4l) e le proteine ​​HLA-ABC superficiali nelle cellule GBP KO A375 (Fig. 4m). Pertanto, LIMIT cis-attiva le GBP per potenziare il macchinario MHC-I e l'immunità al tumore.

Le GBP attivano HSF1 per stimolare l'MHC-I e l'immunità al tumore

Per dimostrare come le GBP possano regolare l'espressione di MHC-I e l'immunità al tumore, abbiamo forzato l'espressione delle GBP nelle cellule A375. È interessante notare che la sovraespressione di GBP ha aumentato l'espressione umana di MHC-I, come mostrato da qRT-PCR (Fig. 5a), colorazione della superficie della membrana (Fig. 5b) e Western blotting (Fig. 5c). I dati suggeriscono che le GBP possono attivare MHC-I a livello trascrizionale. Coerentemente, la sovraespressione di Gbp2 ha aumentato l'espressione di MHC-I del topo nelle cellule YUMM1.7 e B16 (Fig. 5d). Per identificare i fattori di trascrizione che regolano MHC-I tramite GBP in risposta all'IFN, abbiamo eseguito la previsione bioinformatica con PROMO27. Abbiamo trovato 8 fattori di trascrizione alterati dall'IFN nelle cellule A375, che possono colpire HLA-ABC, HSPA5, CALR e TAP1. Oltre a diversi fattori ben noti, l'attività dell'HSF1 è stata fortemente indotta dall'IFN (Extended Data Fig. 7a). Elaborando i set di dati ChIP-seq in ENCODE28, abbiamo scoperto che sia STAT1 che HSF1 erano arricchiti nei promotori di geni associati a MHC-I con diversi modelli di legame (Dati estesi Fig. 7b). Abbiamo eseguito il test ChIP con anticorpo anti-HSF1 in cellule A375 stimolate con IFN. HSF1 è stato arricchito nei promotori di HLA-ABC, HSPA5, CALR e TAP1, ma non HPRT1, un controllo negativo (Fig. 5e). I risultati suggeriscono che HSF1 è un fattore di trascrizione per MHC-I. HSF1 viene solitamente attivato dall'interruzione della proteostasi29. Per verificare se l'attivazione di HSF1 migliorerà l'espressione di MHC-I, abbiamo trattato le cellule A375 con un elenco di fattori di stress30: shock termico, stress ossidativo (Luperox), inibitori della traduzione (puromicina), proteasoma (MG-132) e accompagnatore (17-AAG). È interessante notare che questi fattori di stress stimolano universalmente l'espressione di MHC-I, mentre KRIBB11, un inibitore di HSF1, riduce questo effetto (Fig. 5f e Dati estesi Fig.7c). Pertanto, l'attivazione di HSF1 generalmente induce l'espressione di MHC-I. Successivamente ci siamo chiesti se le GBP potessero attivare HSF1. L'espressione forzata di GBP ha indotto l'attività luciferasica del reporter HSF1 HSE-Luc (Fig. 5g), così come la fosforilazione di HSF1 (Fig. 5h). Ciò suggerisce che le GBP potrebbero attivare HSF1. L'IFN non è riuscito a indurre l'espressione di HSPA5 nelle cellule GBP-KO A375 (Fig. 5i). Pertanto, l'IFN attiva l'HSF1 inducendo l'espressione della GBP. Inoltre, il trattamento con KRIBB11, un inibitore di HSF1, ha abrogato la sovraregolazione di MHC-I mediata dalla sovraespressione di GBP1 (Fig. 5j). Pertanto, le GBP stimolano l'espressione di MHC-I in modo dipendente dall'HSF1-. Per consolidare la relazione meccanicistica tra GBP e HSF1, abbiamo silenziato Gbp2 e/o Hsf1 nelle celle MC38 (Fig. 5k). Dopo il trattamento con IFN, il solo silenziamento di Gbp2 o Hsf1 ha ridotto l'espressione di MHC-I, ma simultaneamente il silenziamento di Gbp2 e Hsf1 non è riuscito a modulare ulteriormente l'espressione di MHC-I (Fig. 5l). Per dimostrare la rilevanza funzionale dell'interazione tra GBP e HSF1 nell'immunità tumorale, abbiamo inoculato cellule tumorali MC38 che esprimono gommalacca, shGbp2, shHSF1 o shGbp2 più shHSF1 in topi C57BL/6. Rispetto ai controlli shFluc, il silenziamento di Gbp2 e il silenziamento di Hsf1 hanno accelerato in modo comparabile la crescita del tumore (Fig. 5m) e hanno ridotto il numero e l'attivazione delle cellule T infiltranti il ​​tumore (Fig. 5n e Dati estesi Fig. 7d). Inoltre, il silenziamento simultaneo di Gbp2 e Hsf1 non è riuscito a influenzare ulteriormente la crescita del tumore e le cellule T infiltranti il ​​tumore (Fig. 5m, n e Dati estesi Fig. 7d). Complessivamente, le GBP stimolano l'espressione di MHC-I e l'immunità antitumorale attivando HSF1.

L'asse LIMIT-GBP-HSF1 guida l'MHC-I e l'immunità al tumore

benefici della cistanche per il sistema immunitario degli uomini

Successivamente abbiamo esaminato come i GBP attivano HSF1 per alterare l'espressione di MHC-I e l'immunità al tumore. In condizioni normali, l'HSF1 monomerico è associato e soppresso dagli accompagnatori, come HSP9031. L'interruzione della loro interazione consente la trimerizzazione e l'accumulo di HSF1 nel nucleo, con conseguente attivazione trascrizionale dei suoi geni bersaglio32. Abbiamo ipotizzato che le GBP possano disturbare l'associazione tra HSP90 e HSF1, con conseguente attivazione di HSF1. Per testare questa possibilità, abbiamo trattato le cellule A375 con IFN ed eseguito Co-IP con un anticorpo HSP90. Abbiamo scoperto che i GBP endogeni indotti da IFN erano associati a HSP90 (Fig. 6a). Inoltre, abbiamo trasfettato cellule A375 con Flag-GBP1 esogeno ed eseguito l'esperimento Co-IP con anticorpo Flag. HSP90 è stato rilevato nel prodotto IP da cellule trasfettate con Flag-GBP1, ma non da cellule di controllo trasfettate con vettore (Fig. 6b). La colorazione con immunofluorescenza ha dimostrato che GBP e HSP90 erano in gran parte co-localizzati nel citoplasma (Fig. 6c). Quando abbiamo trasfettato cellule 293T con dosi crescenti di plasmidi GBP1, l'HSF1 associato a HSP90- è stato ridotto in modo dose-dipendente (Fig. 6d). I dati suggeriscono che le GBP hanno interagito con HSP90 e questa interazione ha interrotto l’associazione tra HSF1 e HSP90. HSP90 è un chaperone per il ripiegamento e la stabilità di più proteine, ci siamo chiesti se i GBP possano alterare l'attività chaperone di HSP90. Sebbene l'inibitore di HSP90 abbia soppresso l'espressione delle proteine ​​​​clienti HSP90 (come RAF1, BCL2 e CDK433), la sovraespressione di GBP non è riuscita a farlo (Fig. 6e). Pertanto, le GBP interagiscono con HSP90 e rilasciano HSF190-associato a HSP, ma non alterano l'attività di HSP90. Quindi, abbiamo esaminato direttamente il ruolo di HSF1 nell'espressione di MHC-I. Abbiamo trattato le cellule A375 con IFN in presenza dell'inibitore di HSF1 KRIBB11. Come previsto, il trattamento con KRIBB11 ha ridotto l'espressione di mRNA stimolata dall'IFN dei geni correlati a MHC-I, inclusi HLA-ABC, TAP1, HSPA5 e CALR, ma non IRF1 (Fig. 6f). È interessante notare che KRIBB11 ha ridotto l'espressione di MHC-I indotta da IFN, ma ha avuto un effetto minimo sull'espressione di PD-L1 (Fig. 6g). Pertanto, HSF1 può regolare l'espressione di MHC-I indotta dall'IFN senza alterare la segnalazione globale dell'IFN. Per verificare se l'MHC-I regolato dall'HSF1-era funzionale, abbiamo coltivato B16-OVA con cellule OT-I in presenza di KRIBB11 e IFN. KRIBB11 ha inibito l'espressione indotta da IFN di MHC-I legato a OVA (Dati estesi Fig. 8a). In linea con ciò, KRIBB11 ha anche soppresso gli effetti citotossici mediati dalle cellule OT-I su B16-OVA (Dati estesi Fig. 8b). Per estendere le nostre osservazioni ad ulteriori tumori, abbiamo messo a tacere Hsf1 con shHsf1 nelle cellule YUMM1.7 e CT26. Il silenziamento di Hsf1 ha comportato una diminuzione dell'espressione di MHC-I nelle cellule YUMM1.7 (Fig. 6h, i) e CT26 (Dati estesi Fig. 8c) in risposta alla stimolazione dell'IFN. Nelle cellule YUMM1.7, il silenziamento di HSF1 non è riuscito a influenzare l'espressione di Gbp2 in risposta all'IFN (Fig. 6h), indicando che Gbp2 non è un gene bersaglio di HSF1. Nelle cellule shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 non è riuscito a sopprimere l'espressione MHC-I stimolata dall'IFN (Dati estesi Fig. 8d). I dati suggeriscono che HSF1 ha potenziato l'espressione di MHC-I in risposta all'IFN e Hsf1 è il bersaglio meccanicistico di KRIBB11 per regolare MHC-I. Dato che HSF1 influenza l'espressione di MHC-I, abbiamo ipotizzato che HSF1 regolasse l'immunità antitumorale in vivo. Per verificare questa ipotesi, abbiamo inoculato cellule tumorali di controllo e shHsf1 YUMM1.7 in topi NSG e C57BL/6. Abbiamo osservato che il silenziamento di HSF1 ha parzialmente rallentato la progressione del tumore YUMM1.7 nei topi NSG (Fig. 6j), supportando che Hsf1 ha contribuito a mantenere l'omeostasi proteica e la progressione del tumore nel modello immunodeficiente. Tuttavia, il silenziamento di Hsf1 ha accelerato notevolmente la crescita del tumore YUMM1.7 nei topi C57BL / 6 di tipo selvaggio (Fig. 6k). I dati indicano che Hsf1 può sorprendentemente promuovere una potente immunità antitumorale nel modello immunocompetente. A sostegno di ciò, abbiamo rilevato una riduzione delle percentuali di cellule T CD3+, Ki67+, IFN + e TNF + infiltranti il ​​tumore (Fig. 6l e Dati estesi Fig. 8e) in i tumori shHsf1 YUMM1.7 rispetto ai controlli scramble shFluc. Inoltre, abbiamo inoculato cellule shHsf1 CT26 in topi BALB/c wild-type. Ancora una volta, il silenziamento di Hsf1 ha comportato una maggiore crescita del tumore CT26 (Dati estesi Fig. 8f). Ciò è stato accompagnato da una riduzione delle percentuali di cellule T CD3+, Ki67+, IFN + e TNF + infiltranti il ​​tumore (Dati estesi Fig. 8g, h). Complessivamente, i dati suggeriscono che l’asse GBP-HSF1 guida l’espressione di MHC-I e l’immunità antitumorale. Per connettere meccanicamente Hsf1 e LIMIT, abbiamo silenziato LIMIT nelle celle A375. Il silenziamento LIMIT ha ridotto l'attività trascrizionale di HSF1 in risposta all'IFN, come determinato dal test reporter della luciferasi (HSE-luc) (Fig. 6m). I dati suggeriscono che LIMIT contribuisce all'attivazione di HSF1 in risposta all'IFN. Per testare un potenziale coinvolgimento di HSF1 nell'induzione di MHC-I mediata da LIMIT, abbiamo stimolato LIMIT tramite l'attivazione di CRISPR nelle cellule B16, in presenza di KRIBB11. Abbiamo osservato che la sovraregolazione di MHC-I, indotta dall'attivazione di LIMIT, è stata abrogata da un inibitore di HSF1 (Fig. 6n). I dati suggeriscono che LIMIT aumenta l'espressione di MHC-I in modo dipendente dall'HSF. Infine, abbiamo analizzato un collegamento tra LIMIT, GBP e HSF1 nel contesto dell'espressione di MHC-I, dell'immunità tumorale e dell'immunoterapia in pazienti affetti da cancro. L'analisi clinica ha mostrato che i geni di segnalazione dell'HSF1- erano correlati all'espressione di MHC-I, all'infiltrazione di cellule T CD8+ e alla sopravvivenza del paziente (Dati estesi Fig. 9a-c). In uno studio sul blocco del checkpoint immunitario in pazienti con carcinoma basocellulare34, l'analisi di sequenziamento dell'RNA a cellula singola ha rivelato 2 cluster tumorali; un cluster di tumori era più sensibile al trattamento anti-PD-1, come dimostrato da una popolazione tumorale ampiamente ridotta (Dati estesi Fig. 9d). È interessante notare che questo cluster di tumori sensibili al checkpoint immunitario esprimeva livelli più elevati di geni di segnalazione HSF1-e di macchinari genetici MHC-I (Dati estesi Fig. 9e). Inoltre, in uno studio sul blocco del checkpoint immunitario in pazienti con melanoma35, l'analisi proteomica ha dimostrato che l'espressione proteica di GBP, geni di segnalazione HSF1 e MHC-I era più elevata nei pazienti con risposta clinica rispetto a quelli che non hanno risposto (Dati estesi, Fig. 9f). Inoltre, abbiamo osservato una correlazione positiva tra i geni di segnalazione GBP1 e HSF1-nei tumori umani (Extended Data Fig. 9g). I dati supportano che l'asse LIMIT-GBP-HSF1 può attivare l'espressione MHC-I e favorire l'immunità antitumorale (Dati estesi Fig. 10).

Discussione

Pianta cinese di cistanche alle erbe-Antitumorale

Gli esseri umani hanno 30,000-60,000 lncRNA. Tuttavia, le identità e le funzioni biologiche della stragrande maggioranza di questi potenziali lncRNA rimangono poco conosciute. Nel campo della biologia del cancro, gli lncRNA sono stati ampiamente studiati nel modello immunodeficiente, lasciando una lacuna nella conoscenza degli lncRNA nel contesto del sistema immunitario. È stato riportato che alcuni lncRNA influenzano la funzione delle cellule immunitarie36,37, la progressione del cancro e l'efficacia della chemioterapia38,39. Tuttavia, rimane senza risposta se specifici lncRNA siano coinvolti nell’immunità antitumorale e nella risposta immunoterapica. Nel presente studio, abbiamo identificato che LIMIT è un lncRNA responsivo all'IFN precedentemente non caratterizzato sia nelle cellule umane che in quelle di topo. LIMIT può indurre l'espressione di MHC-I e MHC-II, promuovendo la risposta immunitaria tumorale mediata dalle cellule T e migliorando l'efficacia dell'immunoterapia. Pertanto, LIMIT è un lncRNA immunogenico tumorale precedentemente sconosciuto. La via di segnalazione dell'IFN svolge un ruolo chiave nel determinare la risposta terapeutica all'immunoterapia antitumorale40 attraverso molteplici meccanismi19,20,41,42. Le mutazioni genetiche nei geni di segnalazione dell'IFN contribuiscono alla resistenza al blocco dei checkpoint nei pazienti affetti da cancro43-48. Tuttavia, la segnalazione dell'IFN può indurre l'espressione inibitoria di PD-L149. Pertanto, è ideale identificare e prendere di mira un gene chiave di segnalazione dell'IFN che media selettivamente l'immunità antitumorale, piuttosto che l'evasione immunitaria del tumore. In linea con questa nozione, dimostriamo che LIMIT media la sovraregolazione di MHC-I e MHC-II, ma non influenza l'espressione di PD-L1 in risposta all'IFN. Pertanto, LIMIT può essere posizionato in modo univoco per essere un bersaglio immunogenico per l’immunoterapia del cancro. Sono state proposte diverse strategie per colpire terapeuticamente gli lncRNA patogeni50. Tuttavia, come elevare i livelli di lncRNA benefici rimane una sfida. Poiché gli lncRNA ad azione cis funzionano localmente, l'espressione forzata di questi lncRNA potrebbe non essere in grado di localizzarsi con precisione51. Sebbene gli lncRNA trans-agenti possano funzionare attraverso specifiche strutture secondarie, la sovraespressione di questi lncRNA potrebbe non essere in grado di generare le loro strutture naturali a causa della mancanza di chaperoni di RNA appropriati52. Utilizzando una strategia di attivazione CRISPR guidata da RNA22, abbiamo attivato direttamente l'espressione LIMIT nelle cellule tumorali in modelli preclinici. L’attivazione di CRISPR LIMIT guidata da RNA può guidare l’espressione del tumore MHC-I e potenziare la terapia di blocco del checkpoint. Dato che la perdita delle firme dei geni MHC-I e IFN si verifica frequentemente nei tumori umani, suggeriamo che l'attivazione CRISPR di lncRNA benefici, come LIMIT, possa salvare l'espressione tumorale di MHC-I ed essere un potenziale approccio terapeutico. Mentre cercavamo il meccanismo attraverso il quale LIMIT influenza l’immunità tumorale, abbiamo chiarito che LIMIT prende di mira le GBP in modo cis. Le GBP svolgono un ruolo nell’immunità innata26,53,54. I topi privi dell'intero cluster di Gbps manifestano una scarsa risposta anti-Toxoplasma gondii55. Tuttavia, prima del nostro lavoro, la connessione meccanicistica tra LIMIT e GBP e la funzione biologica delle GBP nell’immunità tumorale e nell’immunoterapia erano indeterminate. Abbiamo scoperto che le GBP sono necessarie per l'espressione del MHC-I tumorale indotto dall'IFN, per l'efficienza nell'uccisione delle cellule T CD8+ e per un'efficace terapia checkpoint. I dati suggeriscono che i GBP sono potenziali geni bersaglio per aumentare l’immunogenicità del tumore. Abbiamo inaspettatamente scoperto che le GBP attivano HSF1 per stimolare l'espressione genica correlata a MHC-I e MHC-I. L'attivazione di HSF1 mediata dagli inibitori di HSP90 è correlata al controllo del tumore nei modelli immunocompetenti. Tuttavia, nonostante numerosi studi clinici con inibitori HSP90, finora nessuno degli inibitori HSP90 valutati è stato approvato dalla FDA per la terapia del cancro. Questo fatto deludente aumenta la possibilità che gli inibitori dell’HSP90 possano essere dannosi per l’immunità tumorale. La tossicità di questi inibitori di HSP90 può favorire la distruzione di diverse proteine ​​clienti di HSP90, come RAF1 e BCL2, che possono essere fondamentali per la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule T effettrici59,60. Dato che le GBP interagiscono con HSP90 e rilasciano HSP90-HSF1 ingannato, ma non alterano l'attività di HSP90, i nostri dati suggeriscono che prendere di mira le GBP potrebbe essere una strategia precedentemente non apprezzata e sicura per attivare HSF1 per l'immunoterapia antitumorale. In sintesi, identifichiamo LIMIT come un lncRNA immunogenico antitumorale precedentemente sconosciuto. Il nostro lavoro suggerisce che il targeting dell'asse di segnalazione LIMIT-GBP-HSF1 può salvare l'espressione e la funzione di MHC-I, presentando un promettente approccio immunoterapeutico contro il cancro.

Metodi

Esperimenti sugli animali

Femmina NSG di sei-otto settimane (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, stock n. 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, stock n. 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651) e topi OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory. Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni. La stanza degli animali ha una temperatura controllata (18-23 gradi), un'umidità (40-60%) e un ciclo di 12 luci/12 buio. Le cellule YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2,5 × 106) e B16 (1 × 105) sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco destro dei topi. Per il trattamento anti-PD-L1 nel modello MC38, 5 mg/kg di anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) e anticorpo di controllo (InVivoMAb, LTF-2) sono stati somministrati per via intraperitoneale nei giorni 6, 9, e 12 inoculazione post-tumorale. Per il trattamento anti-PD-L1 nel modello B16, 5 mg/kg di anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) e anticorpo di controllo (InVivoMAb, LTF-2) sono stati somministrati per via intraperitoneale il giorno 0, 3, 6, 9, 12 e 15 inoculazione post tumore. I diametri del tumore sono stati misurati utilizzando calibri. Il volume del tumore è stato calcolato da Lunghezza × Larghezza × Larghezza/2. Gli studi sugli animali sono stati condotti sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Michigan (PRO00008278). Lo studio è conforme a tutte le normative etiche pertinenti relative alla ricerca sugli animali. In nessuno degli esperimenti le dimensioni del tumore dello xenotrapianto superavano i 2 cm in qualsiasi dimensione e nessun animale presentava una grave distensione addominale (aumento del peso corporeo originale maggiore o uguale al 10%). La dimensione del campione è stata scelta sulla base di dati preliminari. Dopo l'inoculazione del tumore, i topi sono stati randomizzati e assegnati a diversi gruppi per il trattamento.

Reagenti

KRIBB11 e 17-AAG sono stati acquistati da Cayman Chemical. MG-132, Puromycin e Luperox provenivano da Sigma-Aldrich. IFN umano ricombinante (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) e IFN del mouse (485-MI) provenivano da ricerca e sviluppo.

Plasmidi

Per generare HSE-LUC, le sequenze di DNA corrispondenti agli elementi di shock termico (HSE) sono state sintetizzate, ricotte e legate in un plasmide PGL3-basico (Promega). FLAG-HSF1 è stato un regalo di Stuart Calderwood (Addgene #32537). Per l'espressione forzata di GBP1, GBP2, GBP5 e Gbp2 di topo umani, le rispettive sequenze codificanti sono state amplificate tramite PCR dal cDNA generato da cellule A375 o cellule B16 pretrattate con IFN e successivamente inserite nel plasmide PCI-Flag. Il plasmide PCI-Flag è stato preparato inserendo la seguente sequenza Kozak più il tag Flag più la sequenza 5 × Glicina nel plasmide PCI-neo (Promega) tra NheI e XhoI. Per abbattere il LIMIT umano e il LIMIT del topo, gli shRNA sono stati progettati e inseriti nel plasmide PLKO.1 (Addgene # 10879). Lo shRNA mirato alla luciferasi della lucciola (shFluc) fungeva da controllo negativo. Per colpire la regione del promotore del limite per l'attivazione di CRISPR, gli sgRNA (sgLimit) sono stati progettati e inseriti nel plasmide phU6- sgRNA (Addgene #53188). Lo sgRNA non mirato (sgNT) fungeva da controllo negativo. Per eliminare i siti di legame STAT1/IRF1 nel promotore LIMIT, sono stati progettati sgRNA accoppiati (psgLIMIT) e inseriti nel plasmide PX459 (Addgene #48139). Per abbattere Hsf1 e Gbp2 del topo, gli shRNA sono stati progettati e inseriti nel plasmide PLKO.1 (Addgene # 10879). Per eliminare GBP1-5, lo sgRNA è stato progettato e inserito nel plasmide PX459 (Addgene #48139). Le sequenze target sono elencate nella Tabella supplementare 7. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella supplementare 8.

Coltura cellulare

Linea cellulare di melanoma umano A375 (CRL-1619), linee cellulari di melanoma di topo, B16-F0 (CRL-6322) e YUMM1.7 (CRL-3362 ), la linea cellulare di cancro del colon di topo CT26 (CRL-2638) e 293T (CRL-3216) sono state acquistate dall'American Type Culture Collection (ATCC). La linea cellulare MC38 di cancro del colon di topo è stata utilizzata in precedenza nel laboratorio Zou23,48. Le cellule B16- OVA sono state stabilite come riportato in precedenza42. In questo studio sono state generate le linee cellulari A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO e A375 LIMIT con delezione del promotore. Tutte le linee cellulari sono state testate di routine per la contaminazione da micoplasma e sono state confermate negative per il micoplasma. Le cellule sono state coltivate in terreno RMPI (Gibco n. 11875) integrato con il 10% di FBS, ad eccezione delle cellule A375 e 293T, le ultime 2 linee sono state coltivate in DMEM (Gibco n. 11965) integrato con il 10% di FBS. Tutte le celle sono state mantenute a 37 gradi e al 5% di CO2. Per lo shock termico, le cellule sono state poste in un'incubatrice a 43 gradi e al 5% di CO2 per 2 ore. Per generare linee cellulari knockdown, le particelle lentivirali sono state prodotte mediante trasfezione del plasmide shRNA PLKO.1 con psPAX2 (Addgene #12260) e pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) in cellule 293T e successivamente trasdotte in cellule tumorali cellule con polibrene (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) durante la notte. 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state selezionate con puromicina (1-2 ug/ml) per altre 2 settimane. Per stabilire linee cellulari knock-out, i plasmidi PX459- sgRNA sono stati trasfettati in cellule tumorali per 2 giorni e selezionati con puromicina (1-2 ug/ml) per altri 2 giorni. Le cellule sono state quindi diluite in serie e seminate in piastre da 96 pozzetti. Dopo 2-3 settimane, le colonie di singole cellule sono state dissociate e ripiastrate in piastre da 6 pozzetti. Dopo la confluenza cellulare, metà delle cellule sono state raccolte e convalidate per l'efficienza di knock-out (KO) tramite Western blotting. Per applicare il sistema di attivazione CRISPR per attivare il limite del mouse, gli phU6-sgRNA sono stati trasfettati insieme a SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) nelle cellule B16. Tutte le trasfezioni sono state condotte con lipofectamina 2000 (Thermofisher) in un rapporto di 1 ug di plasmide: 2 ul di regente di trasfezione. Il dosaggio della trasfezione è stato determinato mediante titolazione.

Saggio dell'attività della luciferasi

Le cellule A375 sono state trasfettate con HSE-LUC e PRL-SV40P (Addgene #27163) per 24 ore, insieme a PCI-neo (vettore) o GBP1, GBP2 per 48 ore. Le cellule A375 shFluc o A375 shLIMIT sono state trasfettate con HSE-LUC e PRL-SV40P (Addgene #27163) per 24 ore e quindi trattate con IFN per altre 48 ore. L'attività della luciferasi per la luciferasi della lucciola (HSE-LUC) e la renilla luciferasi (PRL-SV40P) è stata misurata con il Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). L'attività relativa della luciferasi della lucciola è stata normalizzata con l'attività della renilla luciferasi.

Colorazione superficiale e analisi di citometria a flusso (FACS)

Le cellule sono state trypsinizzate e lavate con tampone MACS (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). La colorazione della superficie è stata eseguita aggiungendo i seguenti anticorpi alla sospensione cellulare in 50 ul di tampone MACS: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) e anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Dopo l'incubazione per 30 minuti, le cellule sono state lavate con tampone MACS e analizzate su un citometro a flusso BD Fortessa.

Analisi PCR quantitativa (qPCR).

L'RNA totale è stato isolato dalle cellule mediante purificazione su colonna (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) con trattamento con DNasi. Il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit di sintesi del cDNA RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) con primer esamerici casuali. La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita su cDNA utilizzando Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) su un sistema PCR in tempo reale StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). L'espressione genica è stata quantificata utilizzando i primer elencati nella Tabella supplementare 8. I cambiamenti di piega nell'espressione dell'mRNA sono stati calcolati con il metodo ΔΔCt utilizzando ACTB come controllo endogeno. I risultati sono espressi come cambiamento di piega normalizzando rispetto ai controlli.

Nord blotting

L'analisi Northern blot è stata eseguita con 10 ug di RNA totali preparati da cellule A375 pretrattate con IFN, IFN e TNF. Gli RNA sono stati risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio denaturante (Ambion) e trasferiti su membrane Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT è stato rilevato utilizzando sonde di DNA marcate con digossina con DIG Northern Starter Kit (Roche). Le sequenze di sonde destinate a LIMIT sono elencate nella Tabella supplementare 7.

Amplificazione rapida delle estremità del cDNA (RACE)

RACE è stato eseguito per identificare le estremità del cDNA del LIMIT umano o del limite del topo con il kit di amplificazione del cDNA SMARTer RACE (Clontech). I primer per RACE sono elencati nella Tabella supplementare 8.

Clone dell'intero LIMIT

Dopo aver ottenuto le sequenze finali del cDNA, il LIMIT a lunghezza intera è stato amplificato tramite PCR e inserito nel plasmide PCI-neo tra XhoI e NotI. I primer clone per LIMIT umano e Limite murino sono elencati nella Tabella supplementare 8.

Frazionamento cellulare per RT-PCR

Le cellule A375 pretrattate con IFN sono state raccolte da piastre da 15 cm mediante raschiatura e lavate una volta con PBS freddo. Le cellule sono state pellettizzate mediante centrifugazione a 700 g per 5 minuti e lisate con tampone di lisi ipotonico (Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, 0,3% (vol/vol) NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) glicerolo) per raccogliere la frazione citoplasmatica. L'RNA citoplasmatico è stato ottenuto mediante precipitazione in etanolo durante la notte a -20 gradi, seguita da riestrazione utilizzando il reagente TRIZOL. Il pellet nucleare rimanente è stato lavato tre volte con il tampone di lisi ipotonico, seguito dall'estrazione con il reagente TRIZOL secondo le istruzioni del produttore. Gli RNA isolati dalle frazioni nucleari o citoplasmatiche sono stati retrotrascritti e RT-PCR per LIMIT con i primer indicati. Gli ACTB non giuntati o maturi sono stati utilizzati come controlli per l'RNA nucleare o citoplasmatico. I primer per ACTB sono elencati nella Tabella supplementare 8.

Blotting occidentale

Le cellule sono state lavate in PBS freddo e lisate in 1 × tampone di lisi RIPA (Pierce) con 1 × inibitore della proteasi (Pierce). I lisati sono stati incubati su ghiaccio per 10 minuti e purificati mediante centrifugazione a 15,000g per 15 minuti. La concentrazione proteica è stata quantificata utilizzando un kit di analisi proteica BCA (Thermo Fisher). Trenta microgrammi di proteina sono stati miscelati con tampone campione (Thermo Fisher) con -ME e denaturati a 95 gradi per 5 minuti. Il campione è stato separato mediante SDS–PAGE e trasferito su una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad). Le membrane sono state bloccate con latte in polvere scremato al 5% p/v e incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 gradi e anticorpi secondari coniugati con HRP (CST) per 1 ora a temperatura ambiente. Il segnale è stato rilevato utilizzando i substrati blotting Clarity e Clarity Max Western ECL (Bio-Rad) e catturato utilizzando il sistema di imaging ChemiDoc (Bio-Rad). Gli anticorpi erano i seguenti: anti-umano GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1: 1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) e anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5.000). Per il Western blotting MHC-I umano, i lisati cellulari totali sono stati denaturati nel tampone del campione senza -ME (non riducente) per mantenere i ponti disolfuro e la conformazione delle proteine ​​da rilevare mediante l'anticorpo anti-HLA-ABC (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1: 1.000).

Co-immunoprecipitazione (Co-IP)

Le cellule sono state raccolte con tampone di lisi IP (Pierce, 87787) più inibitore della proteasi. La concentrazione proteica è stata determinata con un kit di analisi proteica BCA. 200-500 ug di campioni di proteine ​​sono stati aggiunti a 1-3 ug di anticorpi primari anti-HSP90 (Proteintech, 13171) o anti-HSF1 (CST, 12972) e incubati con leggera oscillazione a 4 gradi durante la notte. Quindi, i campioni sono stati ulteriormente incubati con 20 ul di Proteina A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) per 2 ore a 4 gradi; e centrifugato a 7500 ×g per 30 secondi a 4 gradi. I pellet cellulari sono stati lavati 4 volte con tampone di lisi IP, risospesi con 40 ul 2 × tampone campione con -ME e riscaldati per 5 minuti a 95 gradi. I campioni di proteine ​​denaturate sono stati analizzati mediante Western blot. Per Flag IP, i lisati cellulari sono stati incubati con 20 ul di EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) e lavati, denaturati e analizzati come descritto sopra.

Colorazione con immunofluorescenza

Le cellule A375 montate su vetrini coprioggetto sono state trattate con IFN per 24 ore. Dopo aver lavato 2 volte con PBS, le cellule sono state fissate con PFA al 4% per 15 minuti e lavate 2 volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Quindi, le cellule sono state permeabilizzate con 0,5% triton x-100 in PBS per 10 minuti e risciacquate 2 volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Gli antigeni sono stati bloccati con siero di capra normale al 10% in PBS per 30 minuti. Quindi, gli anticorpi primari sono stati aggiunti a diluizioni 1:50 di anticorpo anti-umano di topo GBP1-5 (Santa Cruz, 166960) o di anticorpo anti-umano di coniglio HSP90 (CST, 4877) e incubati a 4 gradi durante la notte. Successivamente, le cellule sono state lavate e incubate con diluizioni 1:500 di anticorpo anti-topo di capra secondario marcato con Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) o anticorpo anti-coniglio di capra secondario marcato con AF488- (Thermo Fisher, A11034), e poi montato su vetrini con il reagente ProLong Gold contenente DAPI. Le immagini in fluorescenza confocale sono state raccolte utilizzando un obiettivo a immersione in olio 63X (confocale Leica SP5 invertito 2-Photon FLIM).

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

I ChIP sono stati eseguiti con cromatina reticolata da cellule A375 trattate con IFN e anticorpo HSF1 (CST, 12972) o IgG di coniglio normale (CST, 2729), utilizzando il kit IP di cromatina enzimatica Simple ChIP Plus (perline magnetiche) (CST, 9005). Il DNA arricchito è stato quantificato mediante PCR in tempo reale utilizzando i primer elencati nella Tabella supplementare 8. La quantità di DNA immunoprecipitato in ciascun campione è stata rappresentata come un segnale relativo alla quantità totale di cromatina in ingresso, che è equivalente a 1.

Isolamento delle cellule OT-I e co-coltura con cellule tumorali OVA+

I topi C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (stock JAX n. 003831) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. La milza è stata omogeneizzata e le singole cellule sono state sospese in 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (Sigma-Aldrich) per 1 minuto. Gli splenociti sono stati pellettizzati, lavati e risospesi a 2 × 106 cellule per ml in terreno di coltura RPMI contenente 1 ug/ml di peptide OVA257-264, 5 ug/ml di IL ricombinante di topo-2 e 40 μM di { {15}} mercaptoetanolo. Le cellule sono state incubate a 37 gradi per 5 giorni. Per impostare la co-coltura di cellule tumorali OT-I e OVA+, gli splenociti sono stati raccolti dopo 5-giorno di attivazione. Le cellule OT-I sono state purificate utilizzando il kit di isolamento delle cellule T CD8+ di topo EasySep (Stemcell). Le cellule B16-OVA sono state seminate durante la notte. Le cellule OT-I sono state quindi aggiunte alla coltura in rapporti diversi. Tutte le cellule sono state raccolte mediante trypsinizzazione e analizzate mediante citometria a flusso (FACS).

Cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC) e macrofagi (BMDM)

Il midollo osseo è stato isolato da femori di topo C57BL/6 e coltivato in terreno completo RPMI1640 con 20 ng/ml GM-CSF (R & S). Le cellule sono state incubate a 37 gradi e al 5% di CO2. Il giorno 3 è stato aggiunto un ulteriore mezzo da 10 ml con 20 ng/ml di GM-CSF. Il giorno 7, le cellule non aderenti e scarsamente aderenti nel surnatante della coltura sono state raccolte mediante lavaggio delicato con PBS e considerate BMDC. Le cellule aderenti erano considerate BMDM.

Profilazione intratumorale delle cellule immunitarie

Per quantificare l'espressione delle cellule T intratumorali e delle citochine effettrici delle cellule T, sono state preparate sospensioni di cellule singole da tessuti tumorali freschi facendo passare fisicamente attraverso filtri cellulari da 100 μm. Le cellule immunitarie sono state arricchite mediante centrifugazione in gradiente di densità. Per la colorazione con citochine, le cellule immunitarie intratumorali sono state incubate in terreno di coltura RPMI contenente PMA (5 ng/ml), ionomicina (500 ng/ml), brefeldina A (1: 1,000) e Monessen (1: 1 ,000) a 37 gradi per 4 ore. 2-3 ul di Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), anticorpi anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) e anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) sono stati aggiunti per 20 minuti per la colorazione della superficie. Le cellule sono state quindi lavate e risospese in 1 ml di soluzione Fix/Perm appena preparata (BD Biosciences) a 4 gradi durante la notte. Dopo essere state lavate con tampone Perm/Wash (BD Biosciences), le cellule sono state colorate con 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), e anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) per 30 minuti, lavati e fissati in formaldeide al 4% (Sigma Aldrich). Tutti i campioni sono stati letti su un citometro LSR Fortessa e analizzati con il software FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Calcolo del punteggio della firma

Abbiamo utilizzato l'espressione normalizzata dei geni per definire le seguenti firme: infiltrazione di cellule T CD8+ (CD8A, CD8B, PRF1 e GZMB), espressione MHC-I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) e segnalazione HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 e HSP90B1).

analisi statistica

Per gli esperimenti cellulari, in generale sono stati eseguiti triplicati biologici in ogni singolo esperimento, salvo diversa indicazione. Per gli studi sugli animali sono state impiegate non meno di 5 repliche per gruppo. Gli animali sono stati randomizzati in diversi gruppi dopo l'inoculazione delle cellule tumorali. I ricercatori non erano ciechi rispetto all'assegnazione durante gli esperimenti e alla valutazione dei risultati. I dati sono mostrati come valori medi con derivazione standard. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). È stato utilizzato il t-test 2-a due code per confrontare i gruppi di trattamento con i gruppi di controllo; La funzione di sopravvivenza è stata stimata mediante metodi Kaplan-Meier e il test dei ranghi logaritmici è stato utilizzato per calcolare le differenze statistiche.

Disponibilità dei dati

I dati RNA-seq (GSE99299) e i dati elaborati di singola cellula (GSE123814) sono stati ottenuti da Gene Expression Omnibus (GEO). I dati di proteomica MS (PXD006003) sono stati ottenuti dall'archivio PRIDE. I set di dati sul cancro TCGA sono stati ottenuti da UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). I dati RNA-seq e le informazioni cliniche per gli studi clinici sull'ICB sono stati forniti dai rispettivi autori corrispondenti. Tutti i dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta. I dati di origine sono forniti in questo documento.

Disponibilità del codice

Tutte le analisi utilizzate in questo studio sono state eseguite seguendo i manuali di Prism Graphpad versione 8.0 e il sito web online all'indirizzo http://xena.ucsc.edu/. Durante questo studio non sono stati sviluppati nuovi codici o algoritmi.

Dati estesi

Dati estesi Fig. 1:

LIMIT è correlato ai geni immunitari effettori di più tipi di cancro.

Dati estesi Fig. 2:

Loci genetici e sequenze del LIMIT umano e del topo.

Dati estesi Fig. 3: LIMIT aumenta l'espressione MHC-1

Dati estesi Fig. 5:

LIMIT aumenta l'espressione di MHC-1 caricato con l'antigene in vivo.

Dati estesi Fig. 6:

LIMIT cis-attiva le GBP per potenziare l'MHC-1 e l'immunità ai tumori.

Dati estesi Fig. 7:

Le GBP attivano HSF1 per stimolare l'espressione di MHC-I.

Dati estesi Fig. 8:

HSF1 guida l'espressione di MHC-I e l'immunità al tumore.

Dati estesi Fig. 9:

I geni di segnalazione HSF1 erano correlati con MHC-I e immunità al tumore.

Dati estesi Fig. 10: Schema che mostra come l'asse LIMIT-GBP-HSF1 influenza MHC-I e l'immunità al tumore

Materiale supplementare

Fare riferimento alla versione Web su PubMed Central per materiale supplementare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per il loro contributo intellettuale. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai finanziamenti di ricerca degli Stati Uniti NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) e (CA216919, CA213566, CA120458 (MC), e dal NIH attraverso l'Università del Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

Riferimenti

1. Zou W, Wolchok JD e Chen L Blocco del percorso PD-L1 (B7-H1) e PD-1 per la terapia del cancro: meccanismi, biomarcatori di risposta e combinazioni. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN e Schreiber RD Neoantigeni nell'immunoterapia del cancro. Scienza 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Antigeni MHC di classe I Garcia-Lora A, Algarra I e Garrido F, sorveglianza immunitaria e fuga immunitaria del tumore. J Cell Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Antigeni MHC Festenstein H e Garrido F e malignità. Natura 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM e van Hall T L'urgente necessità di recuperare l'MHC di classe I nei tumori per un'immunoterapia efficace. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. On. CC et al. Un atlante di RNA umani lunghi non codificanti con estremità 5' precise. Natura 543, 199–204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME e Mattick JS RNA lunghi non codificanti: approfondimenti sulle funzioni. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL e Reik W Evoluzione e funzioni di RNA lunghi non codificanti. Cella 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​RNA lunghi non codificanti: sorprese funzionali dal mondo dell'RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D e Lee JT RNA lunghi non codificanti: passato, presente e futuro. Genetica 193, 651–669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA e Chang HY RNA lunghi non codificanti nella programmazione e riprogrammazione del destino cellulare. Cellula staminale 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Il ruolo emergente degli lncRNA nel cancro. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. Annotazione di riferimento GENCODE per i genomi umani e di topo. Acidi nucleici Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz Net et al. Evoluzione del tumore e del microambiente durante l'immunoterapia con Nivolumab. Cella 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Caratteristiche genomiche e trascrittomiche della risposta alla terapia anti-PD-1 nel melanoma metastatico. Cella 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16.Van Allen EM et al. Correlati genomici della risposta al blocco CTLA-4 nel melanoma metastatico. Science 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Mutazioni somatiche e omologia del neoepitopo nei melanomi trattati con blocco CTLA-4. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Analisi sistematiche di una nuova firma associata a lncRNA come biomarcatore prognostico per il carcinoma epatocellulare. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Dimostrazione di un sistema di sorveglianza del tumore interferone gamma-dipendente in topi immunocompetenti. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Presentazione dell'antigene Fruh K e Yang Y da parte dell'MHC di classe I e sua regolazione da parte dell'interferone gamma. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. Il B7-H1 associato al tumore promuove l'apoptosi delle cellule T: un potenziale meccanismo di evasione immunitaria. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Attivazione genica guidata dall'RNA mediante fattori di trascrizione basati su CRISPR-Cas9-. Metodi Nat 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H et al. L'espressione dell'ospite di PD-L1 determina l'efficacia della regressione tumorale mediata dal blocco della via PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q e Prasanth KV Nuclear Long Noncoding RNA: regolatori chiave dell'espressione genica. Tendenze Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ e Yin FH Induzione dell'interferone delle proteine ​​dei fibroblasti con attività legante il guanilato. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH et al. Proteine ​​leganti il ​​guanilato indotte dall'interferone nell'attivazione dell'inflammasoma e nella difesa dell'ospite. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messaggero X et al. PROMO: rilevamento di elementi regolatori della trascrizione noti utilizzando ricerche su misura per specie. Bioinformatica 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Consortium, EP Un'enciclopedia integrata degli elementi del DNA nel genoma umano. Natura 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Guardiano della proteostasi nel cancro. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y e Morano KA Attivatori di piccole molecole della risposta allo shock termico: proprietà chimiche, bersagli molecolari e promessa terapeutica. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF e Voellmy R Repressione dell'attivazione del fattore di trascrizione HSF1 da shock termico da parte di HSP90 (complesso HSP90) che forma un complesso sensibile allo stress con HSF1. Cella 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Regolazione del fattore di shock termico dei mammiferi 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 e lo chaperoning del cancro. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Sostituzione clonale di cellule T tumore-specifiche dopo il blocco del PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel Metal et al. La proteomica della risposta del melanoma all'immunoterapia rivela la dipendenza mitocondriale. Cella 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA RNA lunghi non codificanti nella regolazione della risposta immunitaria. Trends Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M e Onate AA Long RNA non codificanti nella regolazione della risposta immunitaria e dell'immunità addestrata. Fronte Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM e Chang HY RNA lunghi non codificanti nelle vie del cancro. Cancer Cell 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. SunTT et al. LncRNA GClnc1 promuove la carcinogenesi gastrica e può agire come un'impalcatura modulare dei complessi WDR5 e KAT2A per specificare il modello di modificazione dell'istone. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA e Ribas A Resistenza primaria, adattiva e acquisita all'immunoterapia contro il cancro. Cella 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Il silenziamento epigenetico delle chemochine di tipo TH1- modella l'immunità tumorale e l'immunoterapia. Natura 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. Le cellule T CD8(+) regolano la ferroptosi tumorale durante l'immunoterapia antitumorale. Natura 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Perdita dei geni della via dell'IFN-gamma nelle cellule tumorali come meccanismo di resistenza alla terapia anti-CTLA-4. Cella 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Mutazioni associate alla resistenza acquisita al blocco del PD-1 nel melanoma. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT et al. Lo screening CRISPR in vivo identifica Ptpn2 come bersaglio dell’immunoterapia contro il cancro. Natura 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Resistenza primaria al blocco del PD-1 mediato dalle mutazioni JAK1/2. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. La resistenza acquisita all'IFNgamma compromette l'immunità antitumorale e dà origine a lesioni del melanoma resistenti alle cellule T. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Mutazioni epigenetiche del driver in ARID1A modellano il fenotipo immunitario del cancro e l'immunoterapia. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. La segnalazione dell'interferone tumorale regola un programma di resistenza multigenica al blocco dei checkpoint immunitari. Cella 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD e Spector DL ​​Targeting terapeutico di RNA lunghi non codificanti nel cancro. Tendenze Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Regolazione dell'espressione genica mediante RNA lunghi non codificanti ad azione cis. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Sfide e prospettive per la biologia strutturale degli lncRNA: l'esempio dell'Xist lncRNA A si ripete. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR et al. GBP5 promuove l'assemblaggio e l'immunità dell'inflammasoma NLRP3 nei mammiferi. Scienza 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A e MacMicking JD Proteine ​​leganti il ​​guanilato indotte dall'interferone: guardiani della difesa dell'ospite in salute e malattia. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Un cluster di GTPasi p65 inducibili dall'interferone gamma svolge un ruolo fondamentale nella difesa dell'ospite contro il Toxoplasma gondii. Immunità 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. L'inibizione di HSP90 migliora l'immunoterapia antitumorale sovraregolando i geni di risposta dell'interferone. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA e Kaufmann GF mirati alla proteina Heat-Shock 90 (HSP90) come strategia complementare al blocco del checkpoint immunitario per la terapia del cancro. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A et al. Valutazione clinica e profilazione dei biomarcatori degli inibitori Hsp90. Metodi Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. La sovraespressione di Bcl-2 migliora la sopravvivenza delle cellule T tumore-specifiche. Cancer Res 65, 2001– 2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Raf-1 è necessario per la produzione di IL2 delle cellule T. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]