La proteasi Calpain2a limita l'immunità innata prendendo di mira TRAF6 nei pesci teleostei

Il fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6) svolge un ruolo chiave di trasduzione del segnale sia nelle vie di segnalazione antibatteriche che antivirali. Tuttavia, i meccanismi di regolazione di TRAF6 nei vertebrati inferiori sono meno segnalati. In questo studio, identifichiamo calpain2a, come un membro della famiglia delle proteasi calcio-dipendenti con attività enzimatica idrolitica unica e funziona come regolatore chiave per l'immunità antibatterica e antivirale nei pesci teleostei. Dopo la stimolazione del lipopolisaccaride (LPS), l'abbattimento della calpaina2a promuove la sovraregolazione delle citochine infiammatorie. Meccanicamente, calpain2a interagisce con TRAF6 e riduce il livello proteico di TRAF6 idrolizzandosi. Dopo la perdita dell'attività enzimatica, la calpaina2a mutante inibisce competitivamente la formazione di dimeri e l'auto-ubiquitinazione di TRAF6. L'atterramento di calpain2a promuove anche la risposta antivirale cellulare. La calpaina2a mutante priva di attività idrolasica reprime l'ubiquitinazione del fattore regolatorio IFN (IRF) 3/7 da TRAF6. Nel loro insieme, questi risultati classificano calpain2a come un regolatore negativo delle risposte immunitarie innate prendendo di mira TRAF6 nei pesci teleostei.

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Come prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori, l’immunità innata esercita un ruolo importante nel proteggere il corpo dall’invasione batterica e dalle infezioni virali. I recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) sulla membrana riconoscono immediatamente i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP)1–3. I tre PRR più ampiamente studiati nell'immunità innata sono i recettori Toll-like (TLR), i recettori RIG-I-like (RLR) e i recettori NOD-like (NLR), che riconoscono diversi PAMP e attivano cascate di segnali per attivare citochine proinfiammatorie e fattore antivirale4-6. Il fattore associato al recettore del TNF (TRAF) 6 è una parte indispensabile della lotta contro l'invasione batterica e le infezioni virali. Essendo un'importante via di segnale attivata dal lipopolisaccaride (LPS), la via del fattore di trascrizione nucleare κB (NF-κB) è stata mappata in dettaglio. La maggior parte delle funzioni proteiche nella via di segnalazione NF-κB sono state ampiamente studiate1,7. Il fattore di differenziazione mieloide 88 (MyD88) viene attivato per la prima volta dai TLR in risposta a LPS e IRAK4 agisce come mediatore attivando IRAK1 e IRAK2, che collegano MyD88 a TRAF68-11. Ubc13 e Uev1A catalizzano l'ubiquitinazione di TRAF6 legata al K63-, che trasferisce la catena dell'ubiquitina K63 a TAB2 e TAB3, portando all'attivazione di TAK112–16. L'attivatore 2 IKK regolato da TRAF6- (TRIKA2), composto da TAK1, TAB1 e TAB2, attiva l'inibitore della chinasi IκB (IKK)/fosforilazione17–19. Il fattore di trascrizione NF-κB entra nel nucleo e promuove la produzione di citochine infiammatorie20. Quando TLR7/9 riconosce il virus, il complesso MyD88- IRAKs-TRAF6 trasmette segnali al fattore regolatorio IFN (IRF) 7, promuove l'ubiquitinazione di IRF7 e attiva la sua fosforilazione nel nucleo21,22. Nella via di segnalazione RLR, RIG I e il gene 5 associato alla differenziazione del melanoma (MDA5) attivano la proteina di segnalazione antivirale mitocondriale (MAVS)23,24. L'aggregazione di MAVS è una caratteristica importante dell'inizio della trasmissione del segnale RLR23,25,26. TRAF2/3/6 sono i primi fattori attivati ​​da MAVS27,28. TRAF3 attiverà la segnalazione TBK1-IRF3 e il complesso MAVS-TRAF6 attiverà la segnalazione NF-κB, che promuove l'espressione IFN-127,29.

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Il meccanismo molecolare dell'attivazione di TRAF6 è già stato dimostrato. TRAF6 in forma dimerica subisce autoubiquitinazione sotto la catalisi di Ubc13 e Uev1A, che è correlato al dominio del dito anulare e al dominio delle dita ZF. Il modello di TRAF6/Ubc13~UB conferma l'importante ruolo del dimero TRAF6 nell'aggregazione e nella trasmissione della catena ubiquitina K6330. Inoltre, è stato riportato che il dominio dell'anulare e delle dita ZF recluta coniugati E2~ub nel modello cristallino TRAF6 del pesce zebra ed è stato scoperto che TRAF6 potrebbe formare per la prima volta un eterodimero con TRAF5 della stessa famiglia TRAF16. Le proteine ​​della famiglia della deubiquitinazione: A20, CYLD, USP2a, USP4 e USP20 prendono di mira TRAF6 per rimuovere l'ubiquitinazione legata al K63- e ridurre la segnalazione a valle31–35. Il sistema a due ibridi di lievito elimina l'interazione tra UBE2O e TRAF6 e conferma che questa interazione influenza direttamente l'attivazione di TRAF6 da parte di MyD8836. Nel processo di trasduzione del segnale a valle di TRAF6, ECSIT come proteina intermedia interagisce rispettivamente con TRAF6 e TAK1 e questa interazione rafforza il legame di TRAF6 e TAK137. Nella segnalazione TLR4 indotta da LPS, i PRDX impediscono a TRAF6 di reclutare ECSIT per fornire la catena ubiquitina K63 e inibiscono anche BECN1 attivato da TRAF6 nella via dell'autofagia38. MST4 attiva la fosforilazione di TRAF6 su Thr463 e Thr486 e inibisce la dimerizzazione e l'ubiquitinazione di TRAF639. Nei mammiferi, il meccanismo di regolazione proteica di TRAF6 è stato ampiamente studiato nell'immunità antibatterica e antivirale. Tuttavia, la ricerca su TRAF6 nei vertebrati inferiori è meno studiata. La risposta immunitaria nei pesci teleostei si basa principalmente sulle vie TLR e RLR per eseguire la risposta immunitaria dopo l'infezione da agenti patogeni. Pertanto, è fondamentale esplorare il meccanismo di regolamentazione dei percorsi di segnalazione mediati da TRAF6-. calpain2 (m-calpain) è una famiglia di proteasi calcio-dipendenti, composta da più di 16 membri nei mammiferi e in molti altri organismi40. Il primo studio sulla famiglia delle proteine ​​calpaine è legato al movimento cellulare41. la calpaina promuove la migrazione cellulare ed è stato scoperto che inibisce la migrazione dei neutrofili e l'attivazione di p38 MAPK e ERK MAPK42. L'attività dell'idrolasi è una delle funzioni importanti della calpaina. Nella regolazione immunitaria, la calpaina-2 promuove il rilascio di NF-κB idrolizzando IkB e attiva la via di segnalazione43. In questo studio, abbiamo determinato che calpain2a interagisce con TRAF6 e agisce come regolatore negativo nelle risposte antibatteriche e antivirali nei pesci teleostei, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a promuove la degradazione del livello della proteina TRAF6 attraverso la sua attività idrolasi. Nel frattempo, la calpaina2a mutante priva di attività idrolasica inibisce la formazione della catena ubiquitina K63 inibendo il dimero di TRAF6. Si riflette che sia calpain2a che calpain2a mutante interrompono l'ubiquitinazione di TRAF6 in ECSIT/ BENC1/ IRF3/ IRF7. calpain2a interrompe il processo di segnalazione di NF-κB e IFN prendendo di mira TRAF6. I nostri risultati forniscono una molecola per lo studio della regolazione immunitaria mediata da TRAF6-nei vertebrati inferiori.

Risultati

calpain2a interagisce con TRAF6 e regola negativamente la segnalazione NF-κB.

Per ottenere informazioni dettagliate sulle proteine ​​associate a TRAF6- nella risposta dell'immunità innata nei pesci teleostei, abbiamo caratterizzato l'interattoma TRAF6 del miiuy croaker utilizzando la purificazione per affinità e la spettrometria di massa. Ordinati per intensità di quantificazione senza etichetta (LFQ), abbiamo intercettato parte dei dati e li abbiamo visualizzati (Fig. 1a). Tra le proteine ​​associate a TRAF6-, la calpaina2a potrebbe regolare l'attività di TRAF6 e influenzare le vie di segnalazione mediate da TRAF6-. In primo luogo, dovrebbe essere studiata la relazione tra calpain2a e TRAF6 a livello proteico, abbiamo controllato l'interazione di calpain2a con TRAF6 nelle linee cellulari renali di Miiuy croaker (MKC). Esperimenti di coimmunoprecipitazione endogena hanno indicato che calpain2a interagisce con TRAF6 (Fig. 1b, c). Come dimostrato da esperimenti di trasfezione transitoria e coimmunoprecipitazione, calpain2a e TRAF6 sovraespressi hanno interagito tra loro (Fig. 1d, e). Tutto ciò indica che calpain2a interagisce con TRAF6 e sono necessari ulteriori esperimenti per studiare il meccanismo della loro azione. Mediante l'allineamento multiplo di sequenze di proteine ​​calpain2a umane, di topo, di pesce zebra e di maggio, la calpain2a è conservata evolutivamente tra pesci e mammiferi (Fig. 1f). Per determinare la funzione della calpaina2a nell'immunità innata, abbiamo esaminato se la calpaina2a fosse associata all'attivazione di NF-κB indotta dalla stimolazione dell'LPS. Abbiamo trasfettato cellule ciprinidi (EPC) dell'epitelioma papuloso con reporter luciferasi NF-κB, reporter luciferasi renilla di controllo interno e vettore che codifica calpain2a o vettore vuoto. calpain2a ha sostanzialmente ridotto l'attività reporter di NF-κB dopo la stimolazione dell'LPS in modo dose-dipendente (Fig. 1g). Inoltre, le citochine proinfiammatorie come il promotore IL-1 e IL-8 responsivi alla stimolazione dell'LPS erano marcatamente diminuite nelle cellule EPC sovraespresse con calpain2a (Fig. 1h, i), suggerendo un potenziale ruolo di calpain2a nella segnalazione infiammatoria percorsi indotti dalla stimolazione LPS.

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Regolazione negativa della segnalazione NF-κB indotta da LPS da parte di calpain2a.

Per studiare il potenziale ruolo di calpain2a nella segnalazione di NF-κB, abbiamo trasfettato calpain2a in MKC con un gradiente temporale di LPS e valutato le citochine proinfiammatorie sensibili a LPS. La sovraespressione di calpain2a ha portato alla sottoregolazione dell'espressione di IL-1, IL-8 e IL-6 (Fig. 2a). Successivamente, abbiamo progettato due piccoli RNA interferenti (siRNA) specifici per calpain2a che hanno sottoregolato efficacemente calpain2a (Fig. 2b, d). L'atterramento di calpain2a ha migliorato significativamente le citochine proinfiammatorie indotte da LPS, tra cui IL-1 e IL-8 nelle linee cellulari dell'intestino MKC e Miiuy croaker (MIC) (Fig. 2c, e). Nel gruppo di cellule stimolate con LPS, l'abbattimento della calpaina2a ha migliorato la proliferazione cellulare. Allo stesso modo, in assenza di qualsiasi stimolazione, abbiamo scoperto che l'abbattimento di calpain2a ha anche migliorato la proliferazione cellulare (Fig. 2f). Per determinare se calpain2a ha inibito le proteine ​​nella segnalazione NF-κB indotta da LPS, calpain2a ha inibito marcatamente il livello di proteine ​​endogene di TRAF6 ma non MyD88, IRAK4 o TAK1 (Fig. 2g). In sintesi, la cinetica della calpain2a e l'espressione delle citochine proinfiammatorie hanno suggerito un coinvolgimento funzionale della calpain2a nella segnalazione di NF-κB indotta da LPS.

Fig. 1 calpain2a interagisce con TRAF6 e inibisce la via di segnalazione NF-κB. un elenco di interattomi TRAF6 basato sull'intensità di quantificazione senza etichetta (sezione). b, c Cellule MKC seminate in piastre da 6 cm2. Dopo 24 ore, i lisati cellulari sono stati immunoprecipitati (IP) con gel di affinità anti-TRAF6 o anti-calpain2a. Quindi gli immunoprecipitati e i lisati cellulari sono stati analizzati mediante IB con gli anticorpi anti-TRAF6 e anti-calpain2a, rispettivamente. d, e Le cellule HEK 293 seminate in piastre da 6 cm2 sono state trasfettate con i plasmidi calpain2a-Flag e TRAF6-Myc (2 ug ciascuno). Dopo 24 ore, i lisati cellulari sono stati immunoprecipitati (IP) con gel di affinità anti-Myc d o anti-Flag e. Quindi gli immunoprecipitati e i lisati cellulari sono stati analizzati mediante IB rispettivamente con gli anticorpi anti-Myc e anti-Flag. f Gli stessi amminoacidi tra calpain2a umano (Hu-calpain2), calpain2a di topo (Mu-calpain2), calpain2a di pesce zebra (ZF-calpain2a) e miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) sono evidenziati con sfondo nero. Le cellule EPC g-I sono state trasfettate con calpain2a-Flag o vettore vuoto insieme ai reporter luciferasi NF-κB, IL-1 e IL-8 luciferasi. A 24 ore dalla trasfezione, le cellule non sono state trattate (Mock) o trattate con LPS per 6 ore. Il valore dell'attività luciferasica è stato ottenuto contro l'attività luciferasica di Renilla (n=3 per gruppo). L'analisi Western blot è stata utilizzata per misurare l'espressione della bandiera calpain2a transfettata transitoriamente. L'espressione di tubulina è stata utilizzata come controllo del caricamento. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie (g, h, i). **p < 0.01. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti.

L'interazione di calpain2a con TRAF6.

L'analisi del dominio è stata eseguita utilizzando il NCBI Conserved Domain Database (CDD). calpain2a comprende tre domini: un dominio della proteasi della cisteina della famiglia Calpain (CysPc) (aa 46-339), un dominio centrale III della subunità grande della Calpain (aa 360-499) e un dominio della mano Penta-EF C-terminale ( aa 500-697). Per determinare quali domini di calpain2a erano necessari per la sua interazione con TRAF6, abbiamo creato tre mutanti di troncamento: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) e calpain (500-697) (Fig. 3a). Le cellule HEK293 sono state trasfettate con calpain2a-Flag wild type (WT), mutanti di troncamento calpain2a-Flag o vettore TRAF6-HA. Abbiamo scoperto che sia calpain2a a lunghezza intera che tre mutanti di troncamento potrebbero interagire con TRAF6 (Fig. 3c). TRAF6 è composto da un dominio TRAF C-terminale, un dominio a spirale, un dominio di dita di zinco e un dominio di dito ad anulare38. Per esaminare quali domini di TRAF6 erano necessari per la sua interazione con calpain2a, abbiamo creato una serie di mutanti troncati di TRAF6, inclusi TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) e TRAF6 (400-574). Nel frattempo, abbiamo creato i mutanti del dominio: TRAF6ΔRing (in cui viene eliminato il dominio Ring finger), TRAF6ΔZF (in cui viene eliminato il dominio Zinc finger), TRAF6ΔCC (in cui viene eliminato il dominio coiled-coil) e TRAF6ΔTRAF-C ( in cui il dominio TRAF C-terminale viene eliminato) (Fig. 3b). calpain2a ha interagito con l'intera lunghezza TRAF6 e con i troncamenti di TRAF6 che contenevano il dominio TRAF C-terminale, un dominio a spirale, un dominio di dita di zinco (Fig. 3d, f), ma non con il dominio di anulare (Fig. 3e) . I test di luciferasi hanno mostrato che la sovraespressione di calpain2a e questi mutanti di troncamento hanno significativamente inibito l'attività reporter di NF-κB e IL-1 nelle cellule EPC (Fig. 3h). Inoltre, sono state studiate le colocalizzazioni subcellulari di calpain2a con TRAF6. Abbiamo trasfettato le cellule EPC con TRAF6-GFP e un vettore vuoto o calpain2a-mCherry. L'analisi al microscopio confocale ha dimostrato che i segnali verdi di TRAF6 si sovrapponevano ai segnali rossi di calpain2a, il che indicava che calpain2a co-localizza con TRAF6 nelle cellule EPC (Fig. 3i, j). Questi dati indicano che la base strutturale di più domini di TRAF6 (dominio TRAF C-terminale, dominio coiled-coil, dominio Zinc finger) ma non il dominio Ring finger è determinante per la sua associazione con calpain2a (Fig. 3g).

Fig. 2 calpain2a negativo regola la via di segnalazione NF-κB indotta da LPS. un mRNA di IL-1, IL-8 e IL-6 in MKC trasdotto con calpain2a-Flag o vettore vuoto e trattato con soluzione salina (0) o sfidato con LPS per vari volte (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 per gruppo). b, d Le cellule MKC e le cellule MIC sono state trasfettate con si-calpain2a #1 e si-calpain2a #2 (100 nM) o si-ctrl (100 nM). A 48 ore dopo la trasfezione, l'espressione di calpain2a è stata misurata mediante qRT PCR (n=3 per gruppo). Il livello della proteina calpain2a è stato determinato mediante Western blotting. c, e mRNA di IL-1, IL-8 in MKC e MIC trasdotti stabilmente con si-calpain2a #1 o si-ctrl (vettore di controllo) e trattati con soluzione salina (0) o sottoposti a test con LPS per vari volte (4 h, 8 h) (n=3 per gruppo). f Le cellule MKC sono state trasfettate con si-ctrl o si-calpain2a #1. A 36 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state stimolate con LPS per 12 ore, quindi è stato misurato il test di proliferazione cellulare (n=3 per gruppo). Barra della scala, 100 μm. g calpain2a-Flag è stato trasfettato in cellule MKC che sono state attaccate con LPS in tempi diversi (3 ore, 6 ore, 9 ore). Analisi immunoblot dei lisati cellulari con Abs indicati. Il livello relativo di mRNA è stato normalizzato rispetto all'espressione del gene che codifica per -actina in ciascun campione. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie (a, c, e, f) o ANOVA a una via (b, d). *p<0,05, **p<0,01.

Fig. 3 L'interazione di calpain2a con TRAF6. a, b In questo studio sono stati utilizzati diagrammi schematici dell'organizzazione del dominio in miiuy croaker calpain2a, TRAF6 e mutanti. "+" rappresenta l'interazione con TRAF6 o calpain2a, "-" significa nessuna interazione. c Le cellule HEK293 sono state trasfettate con mutanti fittizi, calpain2a-Flag wild type (WT) e calpain2a-Flag troncati, o TRAF6-HA come indicato. A 24 ore dalla trasfezione, le cellule trasfettate sono state estratte e i lisati cellulari sono stati sottoposti a immunoprecipitazione con anticorpi anti-HA seguiti da IB utilizzando anticorpi anti-HA o anti-Flag. Le cellule d–f HEK293 sono state trasfettate con mutanti mock, TRAF6-HA wild type (WT) e TRAF6-HA troncati o calpain2a-Flag come indicato. A 24 ore dalla trasfezione, le cellule trasfettate sono state estratte e i lisati cellulari sono stati sottoposti a immunoprecipitazione con anticorpo anti-HA d, f o anticorpo anti-Flag e seguito da IB utilizzando anticorpo anti-HA o anti-Flag. g Il sito di interazione di TRAF6 e calpain2a. h Le cellule EPC sono state trasfettate con mutanti troncati TRAF6-HA, calpain2a-Flag o calpain2a-Flag insieme ai reporter della luciferasi NF-κB e IL-1. Dopo 36 ore dopo la trasfezione, il valore dell'attività della luciferasi è stato raggiunto contro l'attività della renilla luciferasi (n=3 per gruppo). Le cellule EPC Ij sono state trasfettate con mock, calpain2a-mCherry e TRAF6-GFP. I nuclei colorati con DAPI sono mostrati in blu. calpain2a è stato rilevato con fluorescenza rossa e TRAF6 è stato rilevato con fluorescenza verde. Barra della scala, 10 μm. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA unidirezionale (h). **p<0,01.

calpain2a inibisce il livello di espressione della proteina TRAF6 mediante attività proteolitica.

Per esplorare il meccanismo di regolazione della calpain2a su TRAF6, abbiamo prima esaminato se calpain2a avesse un effetto su TRAF6 a livello proteico. calpain2a-Myc e TRAF6-Flag sono stati co-trasfettati in cellule EPC, il livello proteico di TRAF6 è stato parzialmente degradato a 30 ore (Fig. 4a). Come mostrato in Fig. 4b, calpain2a ha promosso la degradazione di TRAF6 in modo dose-dipendente. In presenza di calpain2a, non ha influenzato il livello di mRNA di TRAF6, indicando che calpain2a influenza solo il livello proteico di TRAF6. Nel frattempo, il test dell'inibitore della cicloesimide (CHX) ha dimostrato che la calpaina2a potrebbe accelerare l'emivita della proteina TRAF6 (Fig. 4c). La sovraespressione di calpain2a nelle cellule MKC ha provocato la destabilizzazione del TRAF6 endogeno (Fig. 4d). Per indagare se la degradazione di TRAF6 mediata da calpain2a dipendesse dalle vie ubiquitina-proteasoma, autofagosoma, lisosomiale o altre, le cellule EPC sono state trattate con i reagenti che inibiscono queste vie: MG132, 3-MA e NH4Cl. Tuttavia, la destabilizzazione di TRAF6 mediata dalla calpaina2a non è stata invertita dall'inibitore proteosomiale MG132, dall'inibitore autofagico 3-MA o dall'inibitore lisosomiale NH4Cl (Fig. 4e). Successivamente, le cellule EPC sono state trattate con i reagenti: E-64 (un inibitore della calpaina che inattiva l'attività della calpaina idrolasi) e PMSF (inibitore non specifico della serina proteasi). Abbiamo scoperto che l'inibitore della calpaina E-64 previene la degradazione a livello della proteina TRAF6 (Fig. 4f). Come mostrato in Fig. 4g, E-64 ha anche invertito la degradazione dei livelli di proteina TRAF6 endogena da parte di calpain2a.

Fig. 4 calpain2a inibisce l'espressione della proteina TRAF6. a L'esperimento sul gradiente temporale di vettori vuoti o plasmidi calpain2a-Myc insieme al flag TRAF6- è stato condotto in cellule EPC. I lisati cellulari sono stati sottoposti a IB con anticorpi anti-Myc, anti-Flag e anti-tubulina. L'RNA è stato estratto dalle cellule e trascritto al contrario, quindi TRAF6 e actina sono stati amplificati mediante primer PCR. b Le cellule EPC sono state seminate in piastre a pozzetti 12- durante la notte e co-trasfettate con TRAF6-Flag e calpain2a-Myc (0.3, 0.6 o {{ 18}}.9 ug) per 48 ore. L'espressione delle proteine ​​TRAF6-Flag e calpain2a-Myc è stata rilevata mediante Western blotting. L'RNA è stato estratto dalle cellule e trascritto al contrario, quindi TRAF6 e actina sono stati amplificati mediante primer PCR. c calpain2a-Myc o vettori vuoti sono stati co-trasfettati con TRAF6-Flag in cellule EPC. A 36 ore dalla trasfezione, le cellule trasfettate sono state trattate con cicloesimide (CHX) per 2 o 4 ore. d Le cellule MKC sono state trasfettate con calpain2a-Flag o vettori vuoti. A 48 ore dopo la trasfezione, i lisati cellulari sono stati sottoposti a IB con anticorpi anti-TRAF6, anti-Flag e anti-tubulina. e, f Le cellule EPC sono state trasfettate con i plasmidi indicati in presenza o assenza di MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 o 75 μM) o PMSF per 6 h prima che fosse eseguita l'analisi immunoblot. g Le cellule MKC sono state trasfettate con calpain2a-Flag in presenza o assenza di E{{50}} (50 o 75 μM) per 6 ore prima che fosse eseguita l'analisi immunoblot. h calpain2a-Flag e calpain2a-ΔCysPc-Flag sono stati co-trasfettati con TRAF6-HA in cellule EPC. A 48 ore dopo la trasfezione, i lisati cellulari sono stati sottoposti a IB con Abs indicati. I calpain2a-Flag e calpain2a-ΔCysPc-Flag sono stati cotrasfettati in cellule MKC. A 48 ore dopo la trasfezione, i lisati cellulari sono stati sottoposti a IB con anticorpi anti-TRAF6, anti-Flag e anti-tubulina. j mRNA di IL-1, IL-8 in MKC trasdotto stabilmente con calpain2a-Flag e calpain2a-ΔCysPc-Flag e trattato con soluzione salina (0) o trattato con LPS per 4 ore (n=3 per gruppo). Il livello relativo di mRNA è stato normalizzato rispetto all'espressione del gene che codifica per -actina in ciascun campione. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie (j). **p<0,01.

Determinare se la degradazione di TRAF6 dipendesse dall'attività idrolasica di calpain2a. Approfittando di precedenti studi strutturali e biochimici sulla calpain2a nei mammiferi, abbiamo mutato i residui di cisteina, istidina e asparagina della calpain2a in alanina (calpain2a C105A, H262A, N286A e 3 A), che ha perso la coordinazione della triade catalitica44-46. Abbiamo osservato che la degradazione di TRAF6 non è stata influenzata da questa mutazione (Figura 1a supplementare). Quindi, abbiamo mutato il dominio della proteasi, che è il dominio della proteasi della cisteina della famiglia Calpain (CysPc) di calpain2a (designato come calpain2a-ΔCysPc). Né il TRAF6 sovraespresso né il TRAF6 endogeno sono influenzati da calpain2a-ΔCysPc (Fig. 4h, i). Tuttavia, le citochine proinfiammatorie IL-1 e IL-8 sono simultaneamente influenzate dalla calpaina2a wild-type o mutata dopo stimolazione dell'LPS (Fig. 4j). La calpain2a mutante priva di attività idrolasica non influenza il livello proteico di TRAF6, ma la calpain2a mutante priva di attività idrolasica influenza comunque l'espressione delle citochine proinfiammatorie a valle. Ciò ha innescato la nostra indagine sui potenziali meccanismi con cui calpain2a regola TRAF6. Presi insieme, questi risultati rivelano che calpain2a regola la segnalazione di NF-κB sopprimendo l'espressione dei livelli di proteina TRAF6, attraverso la sua attività di calpaina idrolasi.

calpain2a inibisce l'attività dell'ubiquitina-ligasi TRAF6.

Successivamente, abbiamo esplorato i meccanismi molecolari mediante i quali calpain2a regola negativamente la segnalazione di NF-κB attivata da TRAF6- e se l'interazione di calpain2a con TRAF6 in seguito alla perdita di attività enzimatica modula la sua attività di ubiquitina ligasi. Abbiamo trattato le cellule MKC con LPS e poi TRAF6 immunoprecipitato. Il test di ubiquitinazione con proteine ​​ricombinanti purificate ha confermato che calpain2a e calpain2a-ΔCysPc hanno ridotto l'ubiquitinazione di TRAF6 (Fig. 5a). Come mostrato in Fig. 5b, c, sia calpain2a che calpain2a-ΔCysPc hanno ridotto significativamente le proteine ​​ubiquitinate WT e K63 di TRAF6. I gradienti di concentrazione di calpain2a e calpain2a-ΔCysPc hanno ridotto le proteine ​​ubiquitinate WT e K63 di TRAF6 in modo dose-dipendente. calpain2a-ΔCysPc impediva ancora l'aggregazione della catena ubiquitina K63 di TRAF6 senza influenzare il livello della proteina TRAF6 (Fig. 5d, e). Quindi abbiamo trasfettato le cellule MKC per esprimere TRAF6 marcato con Myc in presenza o assenza di calpain2a-ΔCysPc marcato con Flag, quindi eseguito esperimenti di immunoprecipitazione con un anticorpo anti-Myc e analizzati mediante immunoblot con anti-UB. Tale ubiquitinazione di TRAF6 è stata sostanzialmente attenuata da calpain2a- ΔCysPc (Fig. 5f). Stimolato da LPS, TRAF6 trasporta la catena ubiquitina legata al K63-a TAK1, che stimola l'autofosforilazione di TAK1 e attiva NF-κB18. Le proteine ​​​​ubiquitina WT e K63 di TAK1 sono state significativamente potenziate in presenza di TRAF6, mentre l'ubiquitinazione legata a TAK1- è stata inibita in presenza di calpain2a-ΔCysPc (Fig. 5g, h). Questi dati supportano che la calpain2a mutante priva di attività idrolasica inibisce in modo simile l'attività dell'ubiquitina ligasi TRAF6 senza influenzare i livelli della proteina TRAF6.

Benefici della cisanche tubulosa-rafforzare il sistema immunitario

calpain2a inibisce l'omo-oligomerizzazione di TRAF6.

La catena ubiquitina Lys63 sintetizzata da TRAF6 svolge un ruolo chiave nella trasduzione del segnale. È stato riportato che la dimerizzazione di TRAF6 è essenziale per la sintesi della sua catena ubiquitina16. Il modello di dimerizzazione è strettamente correlato alla combinazione di Ubc13 per produrre l'ubiquitinazione di K6316,30. Per verificare se TRAF6 dei pesci potesse formare dimeri, abbiamo utilizzato plasmidi TRAF6 con tag diversi: TRAF6 con tag Myc e TRAF6 con tag HA per esperimenti di co-IP. Il test IP è stato eseguito utilizzando un anticorpo anti-HA, HATRAF6 ha interagito con Myc-TRAF6 (Fig. 6a). Per esplorare l'effetto inibitorio della calpain2a nell'interazione del dimero TRAF6-, calpain2a marcata con Flag, TRAF6 marcata con HA e TRAF6 marcata con Myc sono stati espressi transitoriamente nelle cellule HEK293. Come previsto, l'interazione del dimero TRAF6- era ridotta in presenza di calpain2a (Fig. 6b). Allo stesso tempo, al fine di evitare la presenza della degradazione di TRAF6 da parte di calpain2a. Abbiamo trasfettato calpain2a-ΔCysPc contrassegnato con Flag e abbiamo scoperto che l'interazione del dimero TRAF6- veniva gradualmente ridotta in presenza di calpain2a-ΔCysPc (Fig. 6c). Come mostrato in Fig. 6d, e, abbiamo trovato l'ubiquitinazione WT e K63 potenziata da HA-TRAF6 di Myc-TRAF6. Mentre le cellule HEK293 venivano co-trasfettate con calpain2a e calpain2a- ΔCysPc, l'ubiquitinazione potenziata verrebbe soppressa. Questi risultati suggeriscono che sia la calpain2a wild-type che la calpain2a mutante priva di attività idrolasica inibiscono l'omooligomerizzazione e l'auto-ubiquitinazione di TRAF6.

calpain2a inibisce il rilascio dell'ubiquitinazione di TRAF6 a ECSIT e BECN1.

Come illustrato in Fig. 5d, abbiamo scoperto che calpain2a interferiva con il processo di ubiquitinazione da TRAF6 a TAK1. È stato riportato che ECSIT ha agito come proteina adattatrice di TAK1 e TRAF6 per promuovere la segnalazione di NF-κB mediante stimolazione LPS37. Per verificare se ECSIT avesse le funzioni menzionate nei pesci teleostei, abbiamo eseguito allineamenti multipli di sequenze di proteine ​​ECSIT nell'uomo, nel topo e nel croaker (Figura 1b supplementare). Abbiamo trasfettato cellule EPC con reporter luciferasi NF-κB, ECSIT ha migliorato significativamente l'attività del reporter NF-κB dopo la stimolazione LPS (Figura 1c supplementare). La sovraespressione di ECSIT nelle cellule MKC ha portato alla sovraregolazione del livello di mRNA di TNF- (Figura 1d supplementare). Dopo aver trasfettato ECSIT e TRAF6 di pesce nelle cellule HEK293, abbiamo scoperto che TRAF6 interagiva con ECIST (Fig. 7a). Allo stesso modo, ECSIT e TAK1 sono stati co-trasfettati e anche le due proteine ​​hanno mantenuto l'interazione (Fig. 7b). Successivamente, per verificare se calpain2a-ΔCysPc inibisce la formazione del complesso TRAF6-ECSIT, abbiamo trasfettato i tre plasmidi in cellule HEK293 e abbiamo scoperto che calpain2a-ΔCysPc previene il complesso TRAF6-ECSIT (Fig. 7c ). Verificare il processo di trasmissione della catena dell'ubiquitina nella segnalazione NF-κB. Come mostrato in Fig. 7d, TRAF6 potrebbe promuovere l'ubiquitinazione di ECSIT; come previsto, calpain2a-ΔCysPc ha inibito il processo mediante il quale TRAF6 ha trasmesso la catena dell'ubiquitina a ECSIT. BECN1 è una proteina importante nell'autofagia indotta da LPS. È stato confermato che l'ubiquitinazione di K63 potrebbe modificare e attivare BECN1. L'enzima deubiquitinante A20 rimuove l'ubiquitinazione di BECN1 e inibisce l'autofagia causata da LPS e TRAF6 è la ligasi E3 responsabile dell'ubiquitinazione di BECN1 in questo segnale47. Come mostrato in Fig. 7e, TRAF6 ha interagito con BECN1 e ha promosso l'ubiquitinazione di BECN1. Quindi abbiamo trasfettato BECN1, TRAF6, calpain2a e calpain2a-ΔCysPc in cellule HEK293, TRAF6 ha promosso l'ubiquitinazione di BECN1. calpain2a-ΔCysPc ha inibito il processo mediante il quale TRAF6 ha trasmesso la catena dell'ubiquitina a BECN1 (Fig. 7f). Questi risultati suggeriscono che la calpain2a wild-type e la calpain2a mutante priva di attività idrolasica inibiscono la capacità di ubiquitinazione di TRAF6 nell'autofagia indotta da LPS e nella segnalazione di NF-κB.

Regolazione negativa della risposta antivirale da parte di calpain2a.

Nella via RLR, TRAF6 agisce come una ligasi E3 reclutata da MAVS per attivare NF-κB, la produzione di IFN e citochine. Successivamente abbiamo esaminato se calpain2a avesse un ruolo nel prevenire TRAF6 nel processo antivirale mediato dall'IFN. Nelle cellule EPC sono stati espressi i reporter della luciferasi guidati dal promotore IFN-1, ISRE e IRF3. Abbiamo scoperto che calpain2a riduceva sostanzialmente queste attività della luciferasi guidate dal promotore in modo dose-dipendente dopo la stimolazione di Ploy (I: C) e Siniperca inganna l'infezione da rabdovirus (SCRV) (Fig. 8a, b). L'abbattimento di calpain2a ha migliorato significativamente l'espressione genica innescata da Ploy (I: C) e SCRV, inclusi Viperin, Mx1 e ISG15 (Fig. 8c, d). L'abbattimento di calpain2a ha comportato una maggiore espressione della vitalità cellulare in seguito all'infezione da SCRV nelle cellule MKC (Fig. 8e). Come mostrato in Fig. 8f, i test di proliferazione cellulare hanno rivelato che l'abbattimento di calpain2a ha migliorato la proliferazione cellulare in seguito all'infezione da SCRV. La sovraespressione di calpain2a ha fortemente promosso la propagazione del virus, come riflesso dalla replicazione virale dopo l'infezione da SCRV (Fig. 8g). calpain2a e calpain2a-ΔCysPc hanno sostanzialmente ridotto i reporter della luciferasi guidati dal promotore IFN -1, ISRE e IRF3 dopo la stimolazione di Ploy (I: C) e l'infezione da SCRV (Figura 2a, b supplementare). Questi risultati suggeriscono che calpain2a può regolare negativamente la via di segnalazione RLR attraverso l'inibizione di TRAF6, inibendo così l'attivazione dell'IFN.

Fig. 5 calpain2a inibisce l'attività dell'ubiquitina-ligasi TRAF6. a Ubiquitinazione di TRAF6 endogeno in cellule MKC trasdotte con calpain2a-Flag e calpain2a-ΔCysPc-Flag e non contestata (-) o sfidata con LPS (+), valutata mediante analisi immunoblot con anti-ubiquitina dopo immunoprecipitazione con anti-TRAF6 e analisi immunoblot di input con indicato Abs. b, c Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con TRAF6-HA e WT-ubiquitina-His o K63O ubiquitina-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. d, e Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con TRAF{{30}}HA e WT-ubiquitin-His o K63O-ubiquitin-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag ({{45 }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. f Ubiquitinazione di TRAF6 sovraespresso in cellule MKC trasdotte con calpain2a-ΔCysPc-Flag, valutata mediante analisi immunoblot con anti-ubiquitina dopo immunoprecipitazione con anti-Myc e analisi immunoblot di input con Abs indicati. Le cellule g, h HEK293 sono state cotrasfettate con TAK1-Myc, TRAF6-HA e WT-ubiquitin-His o K63O-ubiquitin-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. Tutti gli immunoprecipitati e l'analisi immunoblot degli input con anticorpi anti-Myc, anti-Flag, anti-HA e anti-tubulina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti.

calpain2a sopprime l'ubiquitinazione di IRF3 e IRF7 da TRAF6.

È stato riferito che nel segnale antivirale innescato dal complesso MAVS-TRAF3/6, l'attività di TRAF6 è necessaria per l'attivazione di IRF3 e NF-κB48. Come mostrato in Fig. 9a, b, TRAF6 promuove l'ubiquitinazione di IRF3 legata a WT e K63- e questo miglioramento è inibito dall'espressione di calpain2a- ΔCysPc. Nel frattempo, quando il virus attiva un segnale di segnalazione TLR-dipendente, TRAF6 è strettamente correlato a IRF7 e promuove l'ubiquitinazione di IRF7 insieme ai fattori antivirali attivati22,49,50. TRAF6 promuove l'ubiquitinazione di IRF7 legata a WT e K63- e questo miglioramento è inibito dall'espressione di calpain2a-ΔCysPc (Fig. 9c, d). Questi dati suggeriscono che la calpain2a selvatica e la calpain2a mutante priva di attività idrolasica inibiscono l'ubiquitinazione mediata da TRAF6- di IRF3 e IRF7.

Discussione

TRAF6 è uno dei sette membri della famiglia dei fattori associati al recettore del fattore di necrosi tumorale (TNF), che è stato identificato come un adattatore del segnale ed esercita la trasduzione del segnale51,52. La famiglia TRAF contiene il dominio del dito anulare, che possiede l'attività della ligasi E3. Le ligasi E3 con il dominio HECT promuovono la poliubiquitinazione del substrato e le E3 con il dominio Ring richiedono che E2~ub trasmetta la poliubiquitinazione53,54. È stato confermato che l'enzima legante il dimero Ub Ubc13/Uev1A è coinvolto nell'aggregazione della poliubiquitinazione di TRAF616. Mentre K124 del topo TRAF6 viene eliminato, TRAF6 perderà l'attività di auto-ubiquitinazione di K63 e la mutazione in questo sito elimina l'ubiquitinazione di NEMO mediata da TRAF6- e l'attivazione di TAK1, IKK e NF-κB55 . È preciso perché PRDX1 si lega al dominio dell'anulare TRAF6 contenuto in K124 ed elimina l'ubiquitinazione di TRAF638. È stato riportato che l'ubiquitinazione di TRAF6 è strettamente correlata alla dimerizzazione del suo dominio N-terminale (dominio dell'anulare e delle dita ZF). Diversi siti di interazione N-terminale con Ubc13 erano mutati e Ubc13 non poteva trasmettere poly~ub a TRAF616. L'interazione tra calpain2a e mutanti TRAF6 ha mostrato che la maggior parte dei domini di TRAF6 interagiva con calpain2a, ad eccezione del dominio dell'anulare. A causa dell'interazione tra calpain2a e il dominio ZF Fingers di TRAF6, abbiamo ipotizzato che calpain2a potrebbe inibire l'auto-ubiquitinazione bloccando la dimerizzazione di TRAF6. Successivamente, abbiamo verificato l'interazione di diversi tag di TRAF6. Con l'aumento dell'espressione della calpain2a mutante priva di attività idrolasica, l'interazione di diversi tag di TRAF6 si è indebolita. TRAF6 marcato con HA promuove l'ubiquitinazione di TRAF6 marcato con Myc e la calpain2a mutante inibisce l'ubiquitinazione potenziata da TRAF6 marcato con HA. Come intermedio nel processo di trasmissione del segnale TRAF6-TAK1, ECSIT si lega al dominio C-terminale di TRAF6 (dominio CC e dominio TRAF-C) e si conferma coinvolto nella segnalazione di NF-κB37. L'espressione delle citochine proinfiammatorie è diminuita nelle cellule ECSITKD THP-1. Tuttavia, dopo la sovraespressione di ECSIT nelle cellule ECSITKD THP-1, geni come IRF7, IL-1 e CD44 sono aumentati in modo significativo37. PRDX1 si lega al dominio dell'anulare di TRAF6 e inibisce l'ubiquitinazione di ECSIT e BECN1 nei segnali NF-κB e autofagici inibendo la formazione della poliubiquitinazione di TRAF638. Nei pesci teleostei, abbiamo confermato la via di segnalazione NF-κB attivata da ECSIT, interagito rispettivamente con TRAF6 e TAK1 e trasmesso la catena di poliubiquitina prodotta da TRAF6. calpain2a si legava al dominio ZF, al dominio CC e al dominio TRAF-C di TRAF6, che inibiva l'interazione di TRAF6-ECSIT. Abbiamo confermato che la calpain2a mutante priva di attività idrolasica ha impedito la catena di poliubiquitina da TRAF6 a ECSIT e BECN1.

Fig. 6 calpain2a attenua l'autoubiquitinazione di TRAF6. a Le cellule HEK293 sono state trasfettate con TRAF6-Myc, TRAF6-HA o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e l'IP analizzato con l'anticorpo HA. b Le cellule HEK293 sono state trasfettate con TRAF6-Myc, TRAF6-HA, vettore vuoto o calpain2a-Flag. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e l'IP analizzato con l'anticorpo HA. c Le cellule HEK293 sono state trasfettate con TRAF6-Myc, TRAF6-HA, vettore vuoto o diverse concentrazioni di calpain2a-ΔCysPc-Flag. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e l'IP analizzato con l'anticorpo HA. d, e Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con TRAF6-Myc, TRAF6-HA e WT-ubiquitin-His o K63O-ubiquitin-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. Gli immunoprecipitati e l'analisi immunoblot di input con anticorpi anti-Myc, anti-Flag, anti-HA e anti-tubulina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti.

Fig. 7 calpain2a inibisce l'ubiquitinazione mediata da TRAF6- di ECSIT e BECN1. a Le cellule HEK293 sono state trasfettate con ECSIT-Myc, TRAF6-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e analizzate tramite IP con l'anticorpo Flag. b Le cellule HEK293 sono state trasfettate con TAK1-Flag, ECSIT-Myc o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e analizzate tramite IP con l'anticorpo Myc. c Le cellule HEK293 sono state trasfettate con TRAF6-Myc, ECSIT-HA, vettore vuoto o diverse concentrazioni di calpain2a-ΔCysPc-Flag. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e analizzate tramite IP con l'anticorpo Myc. d Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His insieme a calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. e Le cellule HEK293 sono state trasfettate con BECN1-Flag, TRAF6-Myc o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e analizzate tramite IP con l'anticorpo Myc. f Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His insieme a calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. Gli immunoprecipitati e gli input con anticorpi anti-Myc, anti-Flag, anti-HA e anti-tubulina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti.

Notiamo che calpain2a ha attività idrolasica come una delle proteasi calcio-dipendenti. La m-calpaina (calpaina-2) svolge un ruolo regolatore positivo nella via di segnalazione NF-κB delle cellule epatiche HepG2. Indipendentemente dall'approccio del proteasoma 26 s, calpain2a idrolizza IkB per rilasciare il fattore di trascrizione NF-κB. L'inibitore specifico della proteina calpaina previene la degradazione di IkB 56. Tuttavia, per la calpaina, esistono pochi studi sulla risposta immunitaria innata dei pesci. Nelle cellule MKC, la sovraespressione di calpain2a ha inibito le citochine proinfiammatorie a valle di NF-κB indotte da LPS. Questo fenomeno era contrario ai risultati ottenuti nelle cellule epatiche HepG2. Potrebbe essere che la specificità della specie della famiglia delle proteine ​​calpaine abbia causato effetti diversi. Allo stesso modo, abbiamo utilizzato l'inibitore specifico della proteina calpaina E-64 per impedire alla calpain2a di idrolizzare TRAF6. La calpain2a mutante priva di attività idrolasica inibisce l'attività dell'ubiquitina ligasi TRAF6 senza influenzarne i livelli proteici. Non abbiamo trovato siti enzimatici attivi per calpain2a. Secondo precedenti studi sui mammiferi, i tre siti: sono residui di cisteina (C105A), istidina (H262A) e asparagina (N286A). Tuttavia, i nostri esperimenti confermano che i tre siti attivi di miiuy croaker calpain2a non influenzano l'espressione dei livelli di proteina TRAF6, ma la calpain2a mutante priva del dominio idrolasi lo fa. Pertanto, abbiamo scelto di mutare l'intero dominio strutturale di attivazione dell'enzima. Sebbene la proteina calpain2a sia relativamente conservata nei mammiferi e nei vertebrati inferiori, i siti di attività enzimatica specifica meritano ulteriori indagini.

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

In sintesi, abbiamo identificato calpain2a come regolatore negativo della segnalazione NF-κB indotta da LPS e dell'attivazione dell'IFN indotta dal virus (Fig. 9e). Nella spettrometria di massa, calpain2a può interagire con TRAF6 e abbiamo dimostrato questo fenomeno mediante esperimenti di coimmunoprecipitazione endogena. Abbiamo scoperto che calpain2a è coinvolta nella regolazione della via di segnalazione NF-κB indotta da LPS. Inoltre, TRAF6 svolge anche un ruolo importante nelle vie di segnalazione antivirale. Abbiamo utilizzato SCRV e Ploy(I: C) per stimolare la via di segnalazione dell'IFN e abbiamo scoperto che calpain2a può anche inibire la segnalazione dell'IFN regolando il livello proteico e l'autoubiquitinazione di TRAF6. Poiché TLR3 è in grado di riconoscere la struttura dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) prodotta dalle infezioni virali. Siamo più interessati a chiarire la regolazione della calpain2a della via di segnalazione dell'IFN mediata da TRAF6-, ma non escludiamo una potenziale relazione tra calpain2a e la via di segnalazione TLR3. calpain2a ha promosso la degradazione di TRAF6 in modo idrolitico e ha interagito con TRAF6 per inibire la formazione di dimeri e l'auto-ubiquitinazione. Questa inibizione ha impedito l'interazione di TRAF6 e ECSIT e il processo di trasferimento dell'ubiquitinazione da TRAF6 a ECSIT, BECN1, IRF3 e IRF7. I nostri risultati attuali contribuiranno alla comprensione dei meccanismi di regolazione negativa prendendo di mira TRAF6 nelle risposte immunitarie innate. Inoltre, questa ricerca indica il ruolo chiave dell'omooligomerizzazione e dell'auto-ubiquitinazione di TRAF6 nel processo della risposta immunitaria innata dei pesci. Contemporaneamente, calpain2a viene proposta come proteina del meccanismo regolatore per inibire la risposta immunitaria di TRAF6 e prevenire le normali e ordinate vie del segnale. Gli approfondimenti sono utili per comprendere l’immunologia dei vertebrati e l’evoluzione del sistema immunitario dei vertebrati.

Fig. 8 calpain2a inibisce l'attivazione dell'IFN indotta da SCRV o Poli(I: C). ab Le cellule EPC sono state trasfettate con diverse concentrazioni di calpain2a-Flag o vettore vuoto insieme ai reporter IFN-1, ISRE e IRF3-pro luciferasi. A 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state infettate in modo simulato o infettate con SCRV o Poly(I: C) per 12 ore (n=3 per gruppo). L'analisi Western blot è stata utilizzata per misurare l'espressione di calpain2a-Flag transitoriamente trasfettato. L'espressione di tubulina è stata utilizzata come controllo del caricamento. c, d Viperin, Mx1, mRNA ISG15 in MKC trasdotto stabilmente con si-calpain2a #1 o si-ctrl (vettore di controllo) e trattato con soluzione salina (0) o trattato con SCRV o Poly(I: C) per 24 ore. Il livello relativo di mRNA è stato normalizzato rispetto all'espressione del gene che codifica per -actina in ciascun campione (n=3 per gruppo). e, f Le cellule MKC sono state trasfettate con si-ctrl o si-calpain2a #1. A 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state stimolate con SCRV per 24 ore, quindi sono stati misurati il ​​test di vitalità cellulare e il test di proliferazione cellulare (n=3 per gruppo). Barra della scala, 100 μm. g Le cellule MKC sono state trasfettate con calpain2a-Flag o pcDNA3.1, quindi infettate con SCRV per 24 ore (n=3 per gruppo). L'analisi qRT-PCR è stata condotta per l'espressione di RNA SCRV intracellulare e surnatante. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a una via (a, b), ANOVA a due vie (c, d, e, f) o test t di Student a due code (g). *p<0,05, **p<0,01.

Metodi

Coltura cellulare.

Le linee cellulari di rene embrionale umano (HEK) 293 e le linee cellulari di Epithelioma papulosum cyprini (EPC) sono state acquistate dall'American Type Culture Collection e conservate nel nostro laboratorio. Le linee cellulari renali di Miiuy croaker (M. miiuy) (MKC) e le linee cellulari dell'intestino di Miiuy croaker (MIC) sono state coltivate da tessuti renali e intestinali di miiuy croaker57,58. Le linee cellulari renali Miiuy croaker e le linee cellulari intestinali Miiuy croaker sono state coltivate a 26 gradi in un incubatore umidificato contenente 0,5% CO2 in L-15 mezzo (HyClone, USA) integrato con 15% FBS (Gibco , USA), 100 U/ml di penicillina (Gibco, USA), 100 ug/ml di streptomicina (Gibco, USA) e 20 U/ml di eparina (Solarbio, Cina). Le cellule dell'epitelioma papulosum cyprini sono state coltivate a 26 gradi in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO2 in terreno 199 (Hyclone) integrato con FBS al 10%, L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/ml e streptomicina 100 mg/ml. Rene embrionale umano 293 cellule sono state coltivate a 37 gradi in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO2 in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) integrato con FBS al 10%, L-glutammina 2 mM, penicillina 100 U/ml e 100 mg /ml streptomicina.

Fig. 9 calpain2a inibisce l'ubiquitinazione mediata da TRAF6- di IRF7 e IRF3. b Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con IRF3-Myc, TRAF6-HA e WTubiquitin-His o K63O-ubiquitin-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Bandiera o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. c, d Le cellule HEK293 sono state cotrasfettate con IRF7-Myc, TRAF6-HA e WT-ubiquitinHis o K63O-ubiquitin-His (in cui è conservata solo la lisina 63) insieme a calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag o vettore vuoto. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate e purificate con agarosio Ni-NTA. Tutti gli immunoprecipitati e input con anti-Myc, anti-Flag, anti-HA e anti tubulina Abs. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno tre esperimenti indipendenti. e Modello che descrive in dettaglio i ruoli di calpain2a nei percorsi di segnalazione mediati da TRAF6-. Su LPS e virus, TRAF6 potrebbe essere attivato, omo-oligomerizzazione e auto-ubiquitinazione. BECN1, ECSIT, IRF7 e IRF3 sono ubiquitinati da TRAF6 e innescano l'attivazione dei segnali a valle. calpain2a come regolatore negativo prende di mira TRAF6 per inibire le vie di segnalazione mediate da TRAF6-.

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