La lipidomica rivela le alterazioni dei lipidi renali indotte dal cisplatino durante la lesione renale acuta e la loro attenuazione da parte della cilastatina
Feb 21, 2022
Astratto: La nefrotossicità è una delle principali complicanze della chemioterapia a base di cisplatino, che porta ad acutidanno renalein ca. 30 per cento dei pazienti, senza alcun intervento preventivo o trattamento disponibile per uso clinico. La cilastatina ha dimostrato di esercitare un effetto nefroprotettivo per le terapie con cisplatino in modelli in vitro e in vivo, essendo entrata di recente in studi clinici. Una comprensione più approfondita a livello molecolare del cisplatino indottodanno renalee l'effetto di potenziali agenti protettivi potrebbe essere la chiave per sviluppare terapie nefroprotettive di successo e per stabilire nuovi biomarcatori didanno renaleenefroprotezione. Un approccio lipidomico mirato, utilizzando LC-MS/MS, è stato impiegato per la quantificazione di 108 specie lipidiche (comprendenti fosfolipidi, sfingolipidi e colesterolo libero ed esterificato) inreneestratti di corteccia e midollo di ratti trattati con cisplatino e/o cilastatina. Dopo il trattamento con cisplatino, è stato riscontrato che fino a 56 e 63 specie lipidiche erano alterate rispettivamente nella corteccia e nel midollo. Il co-trattamento con cilastatina ha attenuato molti di questi cambiamenti lipidici, totalmente o parzialmente rispetto ai livelli di controllo. L'analisi multivariata ha rivelato che le specie lipidiche possono essere utilizzate per discriminaredanno renaleenefroprotezione, con gli esteri del colesterolo che sono le specie più discriminanti, insieme a solfatidi e fosfolipidi. Potenziali biomarcatori diagnostici indotti da cisplatino danno renalee cilastatinanefroprotezionesono stati trovati anche.
Parole chiave:lipidomica; cisplatino; danno renale acuto; cilastatina; nefroprotezione; biomarcatori; esteri del colesterolo; sfingolipidi; fosfolipidi; chemioterapia
introduzione La nefrotossicità è un grave effetto collaterale della chemioterapia con cisplatino [1], con acutodanno renale(AKI) in fase di sviluppo in ca. 30 per cento dei pazienti trattati [2]. Questo è anche il principale fattore dose-limitante e un importante inconveniente delle terapie a base di cisplatino, uno dei trattamenti più rilevanti per i tumori solidi [2]. Il cisplatino si accumula e provoca lesionirenalecellule epiteliali del tubulo prossimale (RPTEC) e il danno si localizza in particolare nel segmento S3 del tubulo prossimale, discendente dalrenalecorteccia verso la giunzione corticomidollare e il midollo esterno [3]. Tuttavia, è stato anche suggerito un danno diretto all'ansa di Henle midollare [4,5]. Una serie di eventi cellulari si verificano in relazione arenaledanno dei tubuli, a seguito dell'assorbimento di cisplatino, inclusi stress ossidativo, stress nitrosativo, danno vascolare, infiammazione, danno mitocondriale o inibizione di Na plus, K plus -ATPasi nella membrana cellulare e stress del reticolo endoplasmatico, seguito da morte delle cellule del tubulo prossimale principalmente da apoptosi (che coinvolgono entrambe vie intrinseche ed estrinseche) o necrosi, che porta alla perdita difunzione renale[2,6,7]. Ciò si manifesta nella diminuzione della velocità di fifiltrazione glomerulare (GFR) e dei livelli sierici di magnesio e potassio, con aumento dell'azoto ureico (BUN) e della creatinina sierica [2].
Sono stati studiati vari approccinefroprotezionedurante le terapie con cisplatino sia in vitro che in vivo, sulla base di una serie di bersagli molecolari [7–9]. Tuttavia, il possibile disturbo dell'effetto citotossico del cisplatino sulle cellule tumorali e un effetto protettivo spesso incompleto hanno limitato lo sviluppo dei renoprotettori [9]. Di conseguenza, non esiste alcun intervento per uso clinico che prevenga o tratti con successo l'AKI indotto da cisplatino [7]. Una comprensione più approfondita dei percorsi molecolari correlati all'AKI indotto da cisplatino e potenziali bersagli pernefroprotezionesembra fondamentale in questo senso.
La cilastatina ha dimostrato di proteggere efficacementerenedal danno causato da diversi agenti, tra cui cisplatino [10,11], gentamicina [12], vancomicina [13], ciclosporina A e tacrolimus [14], sia in modelli in vitro che in vivo. La cilastatina esercita il suo effetto protettivo inibendo selettivamenterenaledeidropeptidasi I (DHP-I) situata nelle zattere lipidiche sul bordo della spazzola delle RPTEC [11]. Di conseguenza, i processi che coinvolgono l'esternalizzazione della membrana come l'apoptosi estrinseca mediata da Fas sono alterati dalla cilastatina e dalla progressione delladanno renaledopo che un insulto tossico è stato arrestato [11]. A parte la compromissione estrinseca dell'apoptosi da cilastatina, lo stress ossidativo, l'infiammazione e l'accumulo di composti nefrotossici sono stati tutti ridotti [10–13,15,16]. Così,funzione renalerimane conservato in co-trattamento con cisplatino e cilastatina [11]. Recentemente, la cilastatina ha completato con successo gli studi clinici di fase I per il suo uso come nefroprotettore e sta per entrare negli studi di fase II. Uno studio recente promettente ha anche rivelato che la cilastatina (somministrata come imipenem più cilastatina) può ottenere un effetto renoprotettivo nei pazienti con carcinomatosi peritoneale durante il trattamento ipertermico intraperitoneale con cisplatino [17].
Negli ultimi anni, le tecnologie omiche, in particolare la proteomica [18,19] e la metabolomica [20-23], si sono rivelate utili per la scoperta di nuovi biomarcatori diagnostici precoci di AKI, oltre al BUN o alla creatinina nel siero [18,20]. Inoltre, l'analisi metabolomica può fornire preziose informazioni per la comprensione dei meccanismi di nefrotossicità del cisplatino [5,24] e dell'effetto terapeutico di potenziali nefroprotettori [25-27].
In particolare, la lipidomica può anche fornire informazioni rilevanti in meritomalattie renali[28], considerando che i lipidi presentano ruoli chiave strutturali, di segnalazione cellulare e metabolismo e possono essere alterati in cellule, tessuti e biofluidi sottorenalecondizioni patologiche [29,30]. A questo proposito, sono stati riscontrati livelli aumentati di trigliceridi e acidi grassi non esterificati nelrenedurante il trattamento con cisplatino [31], oltre ai lipidi tal neutri [32]. Nelrenalecorteccia durante AKI indotto da cisplatino [33]. D'altra parte, le specie di fosfolipidi, comprese le specie di fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e lisofosfatidilcolina (LPC), sono risultate alterate intessuto renaleo cellule durante il trattamento con cisplatino [26]. Anche i livelli di diverse specie di LPC sono risultati alterati nel siero di ratto dopo la somministrazione di cisplatino [23]. Inoltre, un approccio semiquantitativo non mirato di imaging di spettrometria di massa ha consentito di confrontare la distribuzione dei lipidi nel rattorenesezioni e ha suggerito che il cis platino porta ad alterazioni su diversi fosfolipidi (PC, PE, fosfatidilgliceroli (PG), fosfatidilinositoli (PI), fosfatidilserina (PS), acidi fosfatidici (PA)), solfatidi (Sulf) o cardiolipine) [34] (che mostra un comportamento diverso nella corteccia e nel midollo), mentre il co-trattamento con cilastatina tendeva ad attenuare alcuni di questi cambiamenti [4].
In questo lavoro, abbiamo fatto un ulteriore passo avanti e abbiamo dato un'occhiata più da vicino a importanti lipidi strutturali nelrene, come fosfolipidi (PC, LPC e PE), sfingolipidi (Sulf, sfingomieline (SM), diidrosfingomieline (dhSM), Cer, diidroceramidi (dhCer), HexCer, diidroesosilceramidi (dhHexCer)) e colesterolo libero (FC) e suoi esterificati forme (esteri del colesterolo (CE)), che coprono nuove classi e specie lipidiche e utilizzano un approccio quantitativo mirato più affidabile basato sulla cromatografia liquida accoppiata all'analisi della spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Su entrambi sono state quantificate 108 specie lipidicherenaleestratti di corteccia e midollo da ratti trattati, al fine di comprendere meglio l'effetto nefrotossico del cisplatino e l'effetto nefroprotettivo della cilastatina. Nuove informazioni sull'impatto del cisplatino associato all'AKIrenalesono state ottenute specie lipidiche e sono state acquisite ulteriori informazioni sull'effetto protettivo della cilastatina, che ha portato ad un'attenuazione di alcune delle specifiche alterazioni lipidiche causate dal cisplatino sia nelrenalecorteccia o midollo. Diversi potenziali biomarcatori di cisplatino indottidanno renaleenefroprotezionecon cilastatina sono stati trovati anche.
Risultati
Effetto protettivo della cilastatina contro i danni renali indotti dal cisplatino
Valutazionefunzione renalenei ratti trattati con cisplatino e/o cilastatina è stata effettuata per la prima volta impiegando diversi indicatori biochimici nel siero e nelle urine. Come mostrato nella Tabella 1, la creatinina sierica, il BUN, le proteine urinarie, il volume urinario e l'escrezione frazionata di sodio e potassio erano significativamente aumentati a causa del trattamento con cisplatino rispetto al gruppo di controllo, mentre il co-trattamento con cilastatina e cisplatino ha portato alla loro diminuzione rispetto con livelli di controllo. D'altra parte, la GFR è stata ridotta nei ratti trattati con cisplatino rispetto ai campioni di controllo, mentre la co-somministrazione di cilastatina ha diminuito questo effetto. Questi risultati confermanodanno renaleindotto dal cisplatino e protezione dalla cilastatina. La cilastatina da sola non ha mostrato alcun effetto sufunzione renaleparametri.
L'analisi istopatologica è stata eseguita anche in sezioni colorate con ematossilina/eosina per studiare le alterazioni morfologiche legate adanno renale. La Figura 1 mostra segni di danno indotti dal cisplatino nella zona prossimalerenaletubuli, tra cui gonfiore dei tubuli, distacco di detriti cellulari o perdita della membrana del bordo della spazzola (Figura 1C, G, I). L'accumulo di calchi proteici è stato osservato anche nei tubuli corticali e midollari (rispettivamente Figura 1C, G). Ciò è in contrasto con la normale morfologia osservata nei gruppi di controllo o cilastatina nella corteccia (Figura 1A,B, rispettivamente) e nel midollo (Figura 1E,F, rispettivamente). Il co-trattamento di cilastatina con cisplatino ha comportato la chiara riduzione di tutte queste alterazioni indotte da cisplatino nella corteccia e nel midollo (Figura 1D, H, J).
Alterazione del cisplatino delle classi globali dei lipidi renali nella corteccia e nel midollo. Effetto protettivo della cilastatina
Nelrenalecorteccia e midollo, al fine di valutare l'effetto globale del cisplatino sui lipidi durante l'AKI. I risultati completi dell'analisi lipidica sono riportati nella tabella S1. Come si può vedere nella Figura 2A, B, sono state osservate tendenze abbastanza simili nella corteccia e nel midollo per tutti i gruppi. CE e Cer erano significativamente aumentati, mentre SM, dhSM e PE erano diminuiti, sia nella corteccia che nel midollo durante il trattamento con cisplatino, rispetto ai gruppi di controllo. Tra questi, Cer e CE subiscono i più importanti cambiamenti indotti dal cisplatino osservati. Inoltre, dhCer e HexCer erano significativamente aumentati nel midollo, mentre nella corteccia, dhHexCer era aumentato e LPC e Sulf erano diminuiti durante il trattamento con cisplatino.
Figura 1. Analisi istopatologica della colorazione con ematossilina/eosinarenalesezioni mostra la protezione della cilastatina contro i danni indotti dal cisplatino. Le immagini sono mostrate con ingrandimento 20× per la corteccia di controllo (A); (B) corteccia di cilastatina; (C) corteccia di cisplatino; (D) cisplatino più cilastatina corteccia; (E) midollo di controllo; (F) cilastatina midollare; (G) midollo allungato in cisplatino; e (H) cisplatino più cilastatina midollare. La barra della scala da A a H rappresenta 100 µm. Immagini dettagliate direnalei tubuli con ingrandimento 60 × vengono visualizzati per (I) cisplatino e (J) cisplatino più cilastatina. La barra della scala per I e J rappresenta 25 µm.RenaleGli indicatori di danno sono rappresentati: →: accumulo di calchi proteici nelrenaletubuli. & regione: rigonfiamento dei tubuli. *: perdita della membrana del bordo della spazzola. #: distacco dei detriti cellulari.
La somministrazione concomitante di cilastatina e cisplatino tendeva ad attenuare alcuni di questi cambiamenti lipidici indotti dal cisplatino, risultando in nessuna differenza rispetto ai gruppi di controllo nel caso dei livelli di Cer e dhHexCer nella corteccia, o dhCer, HexCer, SM, dhSM e PE livelli nel midollo. Inoltre, nel caso di aumento della CE indotto da cisplatino nella corteccia, la cilastatina co-somministrata con il cisplatino ha portato a livelli significativamente ridotti rispetto al gruppo cisplatino, sebbene il recupero fosse parziale rispetto ai gruppi coiatrol. Il resto delle classi lipidiche alterate dal cisplatino sono rimaste non recuperate durante il co-trattamento con cilastatisi. D'altra parte, la stessa cilastatina non ha avuto alcun effetto sulla corteccia e sul midollo osseo, ad eccezione di LPC e dhCer nella corteccia, che sembravano essere rispettivamente diminuiti e aumentati rispetto al gruppo di controllo. I livelli totali di FC, PC e dhHexCer non hanno mostrato cambiamenti significativi nella corteccia e nel midollo dopo il trattamento con cisplatino.
La figura 2C, D mostra le mappe termiche di correlazione per le classi lipidiche nella corteccia e nel midollo, rispettivamente, offrendo tendenze simili.
Altrazione di singole specie di lipidi renali mediante trattamento con cisplatino. Cilastatina Attenuante Egect
Esteri di ColestesoloAnalisi di cinque singole specie CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) effettuate nelrenalecorteccia e midollo hanno rivelato che il cisplatino ha aumentato significativamente ciascuno di essi rispetto ai livelli di controllo (Figura 3). D'altra parte, la co-somministrazione di cilastatina e cisplatino ha portato a una diminuzione generale dei livelli delle singole specie di CE rispetto al trattamento con cisplatino, che era statisticamente significativa per tutte le specie di CE nella corteccia e CE 18:2 nel midollo, come può essere visto nella Figura 3. Questo recupero nelle specie CE della corteccia dovuto al co-tseatment della cilastatina è stato parziale rispetto ai livelli del gruppo di controllo, mentre non è stato osservato alcun recupero statisticamente significativo nella maggior parte delle specie CE di medella (ad eccezione di CE 18:2) per la co-somministrazione di cilastatina rispetto al cisplatino. I risultati dell'analisi statistica completa sulle specie lipidiche della corteccia e del midollo sono mostrati rispettivamente nelle tabelle S2 e S3.
Sfingolipidi: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM e SulfUn totale di 43 specie di sfingolipidi sono state quantificate nelrenalecorteccia e midollo per valutare l'impatto del trattamento con cisplatino e cilastatina sui loro livelli, come mostrato nella Figura 4. Per quanto riguarda le specie Cer (Figura 4A), dhCer (Figura 4B), HexCer (Figura 4C) e dhHexCer (Figura 4D), come può essere visto, il trattamento con cisplatino ha comportato un aumento significativo di 19 specie da tee quattro classi nelrenalecorteccia e midollo. Anche in questo caso, il co-trattamento con cisplatino e cilastatina mostra una tendenza ad attenuare l'effetto del cisplatino, con una diminuzione generale dei livelli lipidici alterati dal cisplatino nella corteccia e nel midollo. Infatti, per le specie dhCer (Figura 4B) e dhHexCer (Figura 4D), non è stata osservata alcuna differenza tra i gruppi trattati con cisplatino più cilastatina e i gruppi di controllo per quelle specie alterate con cisplatino, indicando un completo recupero. Nel caso di Cer (Figura 4A) e HexCer (Figura 4C), questo recupero è stato anche il caso di alcune specie alterate, come HexCer 34:1 (corteccia e midollo) e HexCer 38:1 e HexCer 42:1 (midollo ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 e Cer 42:2 nella corteccia; e Cer 34:1 e Cer 42:2 nel midollo, essendo totalmente o parzialmente guarito. Al contrario, il trattamento con cisplatino più cilastatina mostrava ancora differenze significative rispetto ai gruppi di controllo per Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 e HexCer 36:1 nel midollo, senza recupero, puntando a un effetto di recupero molto migliore esercitato dalla cilastatina nella corteccia rispetto al midollo per Cer e HexCer.
Nel caso delle specie SM (Figura 4E) e dhSMt (Figura 4F), il cisplatino ha portato a una diminuzione della corteccia e del midollo per le specie a catena più corta e più lunga, che era statisticamente significativa per SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 e dhSM 42:1. Al contrario, l'effetto osservato per il trattamento con cisplatino sulle specie SM a catena intermedia e dhSM nella corteccia e nel midollo è stato un aumento statisticamente significativo per dhSM 36:0 (sia nella corteccia che nel midollo) e dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 e SM 40:1 nel midollo. La co-somministrazione di cisplatino e cilastatina tendeva a normalizzare i livelli di specie SM e dhSM in molti casi, con SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 e dhSM 42:1 non mostrano alcuna differenza rispetto ai gruppi di controllo nel midollo. Infine, anche alcune specie Sulf sono state alterate dal trattamento con cisplatino nelrenalecorteccia e midollo, come mostrato nella Figura 4G. Mentre Sulf 40:1 è risultato significativamente aumentato sia nella corteccia che nel midollo dopo il trattamento con cisplatino, altre specie come Sulf-OH 40:1 o Sulf-OH 42:2 a catena lunga, Sulf-OH 42:2 erano diminuiti nella corteccia, con Sulf 42:0 e Sulf-OH 42:1 anche diminuiti sia nella corteccia che nel midollo. La cilastatina co-somministrata con il cisplatino ha portato di nuovo a un lieve effetto di recupero, in particolare per Sulf 40:1 (corteccia e midollo) e Sulf 40:2 e Sulf-OH 42:1 (midollo), non mostrando differenze rispetto ai gruppi di controllo.
Fosfolipidi: PC, PE e LPCLa quantificazione di 60 specie di fosfolipidi (28 PC, 20 PE e 12 LPC) è stata effettuata nelrenalecorteccia e midollo per la valutazione delle potenziali alterazioni indotte dal cisplatino e dell'effetto renoprotettivo della cilastatina. I risultati per le specie PC sono mostrati rispettivamente nella Figura 5A,B. Come si può vedere, il cisplatino ha alterato in modo significativo fino a 19 specie di PC nella corteccia o nel midollo. La maggior parte di queste specie di PC è stata ridotta dal cisplatino, ad eccezione di PC 40:2, PC 40:4 e PC 34:2, che erano aumentate nella corteccia. La frazione di specie PC altamente insaturate è stata significativamente ridotta sia nel midollo che nella corteccia, mentre la frazione di specie contenenti due doppi legami è stata significativamente aumentata, come si può vedere nella Figura 5C, D. Il trattamento con cisplatino e cilastina ha mostrato effetti simili a quelli osservati in precedenza, con qualche effetto attenuante osservato, che in alcuni casi ha portato a un completo recupero dei livelli di PC, senza differenze significative con il gruppo di controllo, oa un recupero parziale. Questo recupero è stato osservato principalmente in I risultati per la determinazione delle specie di PE nella corteccia e nel midollo sono mostrati rispettivamente nella Figura 6A,B. Un totale di 16 specie di PE sono state significativamente alterate dal cisplatino nella corteccia o nel midollo, con il maggior numero di specie modificate trovate nel midollo. Nella maggior parte dei casi, le specie di EP sono state ridotte dal trattamento con cisplatino, ad eccezione di PE 38:2, PE 40:6 e PE 40:4, che erano aumentate nella corteccia, nel midollo o sia nella corteccia che nel midollo, rispettivamente. Di conseguenza, considerando la lunghezza totale delle catene di acidi grassi nelle specie PE nel midollo, la quantità totale di PE con 34, 36 e 38 C è stata significativamente ridotta con cisplatino, mentre le specie di 40 C sono state aumentate, come illustrato nella Figura 6C . Il co-trattamento con cilastatina e cisplatino ha attenuato la maggior parte dei cambiamenti indotti dal cisplatino nelle singole specie di EP presenti nel midollo, offrendo livelli senza differenze significative rispetto ai gruppi di controllo in 11 delle 15 specie alterate con cisplatino nel midollo, con 2 specie di EP in più parzialmente recuperato. Tuttavia, nella corteccia, solo 2 su 11 specie alterate con cisplatino sono state recuperate con cilastatina per controllare i livelli, con 2 specie di PE aggiuntive parzialmente recuperate. Simile alle osservazioni per le specie di PC, la frazione di specie di PE altamente insature è stata significativamente ridotta nel midollo, mentre la frazione di specie contenenti 1-3 doppi legami è stata significativamente aumentata, come mostrato nella Figura 6D.
Per quanto riguarda l'analisi delle specie LPC, la maggior parte dei cambiamenti indotti dal cisplatino osservati sono stati trovati nelrenalecorteccia, dove LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:{7}}, LPC 20:3, LPC 22:6 e LPC 22:5 sono stati significativamente ridotti con rispetto ai campioni di controllo, come si può vedere nella Figura 7A. D'altra parte, è stato riscontrato che LPC 17:1 e LPC 18:2 sono aumentati nel midollo durante il trattamento con cisplatino (Figura 7B). Il co-trattamento con cisplatino e cilastatina non ha avuto alcun effetto di recupero sulle specie LPC della corteccia. Al contrario, LPC 17:1 e LPC 18:2 sono stati recuperati nel midollo, senza differenze significative rispetto ai campioni di controllo.
Lipidi renali come variabili di classificazione perDanno ai renie Protezione
L'analisi multivariata è stata eseguita utilizzando tutte le variabili lipidiche misurate nella corteccia e nel midollo per valutare se queste specie potrebbero servire per la classificazione di gruppo e discernere indotte dal cisplatinodanno renaleenefroprotezionedalla cilastatina. L'analisi delle componenti principali (PCA) e le proiezioni ortogonali all'analisi della discriminazione delle strutture latenti (OPLS-DA) sono state eseguite utilizzando separatamente i lipidi della corteccia o del midollo, come mostrato nella Figura 8. Analisi PCA della corteccia (Figura 8A) e del midollo (Figura 8B) i lipidi hanno offerto ai modelli la capacità di mostrare una chiara separazione del gruppo cisplatino rispetto ai gruppi di controllo e cilastatina, gli ultimi due raggruppati strettamente. D'altra parte, il gruppo trattato con cisplatino più cilastatina tendeva a separarsi dal gruppo cisplatino e si trovava tra il gruppo di controllo e il gruppo cisplatino, suggerendo differenze tra i gruppi. Tutti i modelli PCA presentavano valori di R2 superiori a 0.7 e valori di Q2 superiori a 0.5.
L'analisi OPLS-DA multigruppo ha anche mostrato un raggruppamento chiaramente separato dei diversi gruppi utilizzando variabili lipidiche della corteccia (Figura 8C) o del midollo (Figura 8D). I modelli OPLS-DA presentavano valori Q2 accettabili e valori R2 superiori a 0.7 e si sono dimostrati validi durante il test di permutazione per 100 iterazioni, come mostrato nella Figura 8E,F. Caratteristiche con importanza variabile nei punteggi di proiezione (VIP) superiori a 1 si trovano nella Figura 8G,H, che indica rispettivamente i lipidi della corteccia o del midollo, che hanno un impatto maggiore sulla separazione dei gruppi. Questi comprendevano diverse specie lipidiche delle classi CE, sfingolipidi e fosfolipidi. Per determinare le differenze lipidiche specifiche tra i singoli gruppi relativi al trattamento con cisplatino enefroprotezione, un'ulteriore analisi OPLS-DA è stata eseguita separatamente con i lipidi della corteccia e del midollo, come si può vedere rispettivamente nelle Figure 9 e 10. I modelli OPLS-DA sono stati costruiti per cisplatino rispetto al gruppo di controllo, cisplatino più cilastatina rispetto al cisplatino, nonché cisplatino più cilastatina rispetto al gruppo di controllo. I modelli OPLS-DA più discriminanti erano quelli tra il controllo e i gruppi trattati con cisplatino o cisplatino più cilastatina, considerando i loro valori R2 e Q2 più alti, con un'adeguata convalida basata sui risultati del test di permutazione con 100 cicli (Figura 9A, B, D, E e Figura 10A,B,D,E).
D'altra parte, i modelli OPLS-DA per i gruppi cisplatino più cilastatina e cisplatino, entrambi utilizzando lipidi della corteccia (Figura 9C) o del midollo (Figura 10C), consentivano anche la discriminazione di gruppo, con valori R2 e Q2 ragionevoli e risultati di convalida appropriati da 100-test di permutazione del ciclo (Figure 9F e 10F), con i lipidi midollari quelli che presentano una migliore prevedibilità. I grafici a S per i diversi modelli OPLS-DA sono inclusi nella Figura 9G,H,I e nella Figura 10G,H,I, per le caratteristiche lipidiche della corteccia o del midollo. Specie con |p(corr)| superiori a 0,5 e punteggi VIP superiori a 1 sono stati contrassegnati nelle trame S come le caratteristiche più rilevanti per la discriminazione dei gruppi. I dati completi, inclusi i valori p (corr) e VIP dei modelli OPLS-DA, insieme alle statistiche univariate per ciascuna specie lipidica, possono essere trovati nelle tabelle supplementari S2 (lipidi della corteccia) e S3 (lipidi midollari). Sembra chiaro cherenalei lipidi della corteccia e del midollo possono servire come criteri discriminanti per il cisplatino indottodanno renalee per la cilastatinanefroprotezionedurante il trattamento con cisplatino.
I lipidi renali come potenziali biomarcatori del danno renale indotto dal cisplatino Al fine di selezionare potenziali biomarcatori lipidici del danno renale
causata dal cisplatino, è stata impiegata una combinazione di criteri multipli di valori p statisticamente significativi dall'analisi univariata del cisplatino rispetto ai gruppi di controllo, nonché valori p(corr) e VIP trovati nel corrispondente modello OPLS-DA. Lipidi selezionati con p-value < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corri)|=""> 0,5 e VIP > 1 possono essere trovati nella Tabella 2 (lipidi della corteccia) e nella Tabella 3 (lipidi midollari), dove sono inclusi anche il cambiamento di piega (FC) e le aree sotto la curva (AUC) per le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC).
Come si può vedere, fino a 40 lipidi dal midollo e 27 lipidi dalla corteccia, comprendenti specie CE, sfingolipidi e fosfolipidi, sono selezionati rispettivamente nelle Tabelle 2 e 3. I valori di AUC per le curve ROC ottenute per ciascun lipide erano superiori a 0.85 e, nella maggior parte dei casi, vicini a 1, indicando buone capacità di discriminazione della specie tra cisplatino e gruppi di controllo. Sorprendentemente, le specie CE con aumento di cisplatino (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) sembrano essere le più discriminanti presenta sia nel midollo che nella corteccia, mostrando i valori FC, VIP, p(corr) e AUC più alti. dhHexCer 34:0 è un altro lipide aumentato nella corteccia con un FC elevato e punteggi rilevanti. D'altra parte, anche i solfatidi come Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 o Sulf-OH 42:1 sono abbastanza rilevanti nella corteccia, mentre PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 Anche PC 36:5 o PC 36:6 sono molto importanti nel midollo, essendo tutti ridotti durante il trattamento con cisplatino.
Lipidi renali come potenziali biomarcatori della nefroprotezione della cilastatina
Per selezionare potenziali biomarcatori lipidici della protezione della cilastatina contro la nefrotossicità da cisplatino, è stato applicato lo stesso approccio a criteri multipli della Sezione 2.5 utilizzando l'analisi univariata di cisplatino più cilastatina rispetto ai gruppi di cisplatino e valori p(corr) e VIP trovati nel corrispondente OPLS- Modello DA. Lipidi selezionati con p-value < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corri)|=""> 0,5 e VIP > 1 possono essere trovati nella Tabella 4 (lipidi della corteccia) e nella Tabella 5 (lipidi midollari), dove sono state calcolate anche FC e AUC per le curve ROC.
Come si può vedere nella Tabella 4, tutte le specie CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 e CE 22:6) la corteccia potrebbe essere considerata come il più potente indicatore della protezione esercitata dalla cilastatina, riducendo significativamente, nel contempo, le alterazioni indotte dal cisplatino. PE 36:5 e dhHexCer 34:0 nella corteccia sono anche importanti potenziali biomarcatori di protezione della cilastatina, in particolare quest'ultima, che subisce un recupero totale a causa della cilastatina verso i livelli di controllo. Per quanto riguarda i lipidi midollari, come mostrato nella Tabella 5, è stata trovata una quantità maggiore di potenziali biomarcatori di protezione della cilastatina rispetto alla corteccia. In particolare, Sulf 40:2 sembra essere la specie più discriminante nel midollo, considerando i suoi punteggi FC e VIP più alti. Sono state trovate anche diverse specie di PC e PE, tra cui PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 e PC 36:6, solo per citarne alcuni, oltre a Cer 42:2, dhHexCer 36:0 e HexCer 34:1, come biomarcatori significativi della protezione della cilastatina nel midollo. In tutti i casi, questi lipidi erano associati a un recupero parziale o totale dei livelli di controllo indotto dalla cilastatina rispetto ai loro livelli alterati dal cisplatino. Per tutte le specie, i valori di AUC per le curve ROC ottenute sono stati superiori a 0,85, a dimostrazione delle loro buone capacità di discriminazione
DiscussioneIn questo lavoro, abbiamo quantificato un totale di 108 specie lipidiche comprendenti importanti lipidi strutturali come fosfolipidi, sfingolipidi e colesterolo insieme alle sue forme esterificate, sulrenecorteccia e midollo di ratti trattati con cisplatino e/o cilastatina. Ciò è stato eseguito al fine di comprendere meglio l'effetto nefrotossico del cisplatino e l'effetto protettivo della cilastatina. Fino a 63 specie lipidiche sono risultate significativamente alterate nel midollo dal trattamento con cisplatino, mentre 56 specie lipidiche sono state colpite nella corteccia, riflettendodanno renalein entrambe le regioni. Sebbene, tradizionalmente, la maggior parte degli studi AKI indotti da cisplatino si concentrino sulle cellule dei tubuli prossimali erenaledanno alla corteccia, dove l'accumulo di farmaci è principalmente focalizzato, studi recenti indicano che la lesione nel midollo può anche essere grave come nella corteccia, sulla base dei test di apoptosi TUNEL [5]. Ciò potrebbe essere correlato all'accumulo di cisplatino nel segmento S3 dei tubuli prossimali [3,5], discendente verso il midollo esterno, a parte il potenziale danno diretto e secondario dell'ansa di Henle [4]. Inoltre, il midollo allungato è stato indicato come il più sensibilerenalearea per osservare i cambiamenti globali dei metaboliti correlati al cisplatino rispetto alla corteccia [5]. I nostri risultati precedenti hanno anche indicato un danno diretto delle cellule midollari (a parte il danno secondario) da parte del cisplatino, riflesso in diverse alterazioni fosfolipidiche e cardiolipiniche [4]. Questi nuovi risultati espandono quelle osservazioni con ulteriori specie e classi lipidiche alterate dal cisplatino e rafforzano la rilevanza del danno midollare nell'AKI indotto dal cisplatino.
Anche se FC inrenenon è stato significativamente alterato dal trattamento con cisplatino, sia l'EC totale che tutte le singole specie di EC misurate erano notevolmente aumentate sia nella corteccia (aumento di otto volte per l'EC totale) che nel midollo (aumento di quattro volte per l'EC totale) in associazione con il cisplatino indottodanno renale.Il colesterolo è un componente chiave delle membrane plasmatiche, interlocando tra i fosfolipidi e influenzando la fluidità, la carica superficiale e le interazioni dei gruppi di teste polari [35,36]. La sua presenza è fondamentale anche nelle zattere lipidiche, poiché stabilisce interazioni idrofobiche con SM, ed è essenziale per la segregazione delle molecole e per controllare la loro interazione con altri componenti della membrana [37]. Le cellule mantengono un equilibrio di colesterolo tra la sintesi de novo nel reticolo endoplasmatico (ER) e l'assorbimento mediato da LDL. La maggior parte del colesterolo si trova nella membrana plasmatica, ma può anche tornare al pronto soccorso dove la FC può essere convertita (attraverso l'esterificazione mediata da ACAT) in CE, che è considerata una forma di deposito citosolico del colesterolo [36]. CE può anche essere idrolizzato di nuovo in FC, costituendo il ciclo degli esteri del colesterolo [36]. Il fatto che la FC fosse inalterata durante il trattamento con cisplatino, ma la CE fosse aumentata sia nella corteccia che nel midollo, suggerisce un'alteratarenalemetabolismo del colesterolo associato ad AKI indotto da cisplatino. Studi precedenti hanno mostrato osservazioni abbastanza simili sia nelle cellule del tubulo prossimale umano HK-2 che nella corteccia renale dei topi, durante l'ischemia acutadanno renale, con FC inalterata e livelli di CE aumentati [36]. In quel caso, la lesione della membrana plasmatica, che ha innescato un aumento del traffico di FC dalla membrana al pronto soccorso, sembrava essere la spiegazione più plausibile, con conseguente aumento della generazione di CE. A questo proposito, il danno alle zattere lipidiche ricche di colesterolo piuttosto che alla membrana plasmatica sembrava essere più efficace nell'aumento del traffico di colesterolo verso ER [36]. In tali studi precedenti è stato anche implicato un ruolo citoprotettivo della CE. Nel ratto è stato riportato anche un aumento dei livelli di CErenalecorteccia durante la nefropatia diabetica in fase iniziale [29]. I risultati sono anche in accordo con un aumento globale dei lipidi neutri inrenaletubuli prossimali riportati durante il trattamento con cisplatino [32]. I nostri risultati indicano per la prima volta un aumento globale dell'EC totale oltre alle singole specie dell'EC, sia nelrenalecorteccia e midollo, durante AKI indotto da cisplatino. La cilastatina stessa, d'altra parte, sembrava aumentare leggermente CE 18:0 e CE 22:6 solo nella corteccia, sebbene i livelli totali di FC o CE fossero inalterati. Questo leggero effetto potrebbe essere dovuto al fatto che il suo bersaglio, DHP-I, si trova nelle zattere lipidiche nel tubulo prossimale (principalmente nella corteccia) e durante la sua interazione potrebbe essere implicato qualche piccolo disturbo della membrana. La co-somministrazione di cisplatino e cilastatina, d'altra parte, ha portato a una riduzione di tutte le specie di CE aumentate con cisplatino nella corteccia, mentre nel midollo non è stato osservato quasi nessun effetto di recupero, con solo un recupero parziale di CE18:2 . Ciò indica l'azione specifica della cilastatina nelle cellule dei tubuli prossimali, che esercita una protezione significativa dell'espansione della morte cellulare correlata al danno diretto del cisplatino sulla membrana plasmatica e alle zattere lipidiche nella corteccia, mentre il danno cellulare correlato allo squilibrio del colesterolo nell'intero midollo sembra rimanere in gran parte non protetti.
Gli sfingolipidi sono lipidi attivi che si trovano principalmente nelle membrane cellulari e sono piuttosto ricchi di zattere lipidiche [37]. Le ceramidi sono i metaboliti centrali del metabolismo degli sfingolipidi, coinvolgendo diverse molecole ed enzimi con ruoli importanti nei processi cellulari, tra cui la crescita cellulare, l'apoptosi, la differenziazione, la resistenza ai farmaci e la senescenza [38,39]. Inoltre, gli sfingolipidi partecipano ai percorsi correlati alla morte delle cellule tumorali del cisplatino e all'AKI [33]. Le ceramidi possono essere generate da diversi percorsi, inclusa la sintesi de novo, l'idrolisi della sfingomielina o il riciclo di sfingolipidi complessi [38]. La sintesi de novo è la via principale, e avviene nel RE, da palmitoil-CoA e serina, attraverso una serie di vie enzimatiche per produrre sfinganina, che porta alle diidroceramidi attraverso la diidroceramide sintasi (CerS). Infine, la desaturazione di dhCer genera Cer [40]. SM può anche essere idrolizzato dalle sfingomielinasi, producendo Cer. Il Cer può essere trasformato in sfingolipidi più complessi nell'apparato di Golgi: fosforilato per generare Cer-1-P, una molecola di segnalazione; convertito in SM dall'azione di SM sintasi; o glicosilati per produrre esossilceramidi (glucosil- o galattosilceramidi), precursori dei solfatidi [38]. Il Cer può anche essere degradato a sfingosina, un precursore della sfingosina{11}}fosfato (S1P), con ruoli importanti nella sopravvivenza e proliferazione cellulare, nell'infiammazione e nella resistenza ai farmaci [39]. Infine, la degradazione di S1P in etanolammina ed esadecenale è la via di uscita di questa via [38].
Durante la quantificazione delle specie di sfingolipidi, durante il trattamento con cisplatino è stato osservato un aumento globale dei livelli totali di Cer, dhCer, HexCer e dhHexCer, particolarmente rilevante per Cer. Differenze rispetto al controlloreneerano più evidenti quando venivano quantificate le singole sottospecie, con 19 specie su 22 aumentate nella corteccia (11 specie) e/o nel midollo (18 specie) con il trattamento con cisplatino. Ciò è in accordo con le osservazioni precedenti che indicano un aumento di Cer e HexCer nel toporenalecorteccia associata al trattamento con cisplatino [33], ma qui abbiamo scoperto che anche il midollo è influenzato da questo effetto.
Queste osservazioni possono riflettere una maggiore produzione metabolica di Cer/dhCer e HexCer/dhHexCer. Da un lato, ciò potrebbe avvenire attraverso una maggiore attività del CerS, alla luce di precedenti osservazioni nelrenalecorteccia, dove l'attività CerS a catena lunga è stata misurata durante il trattamento con cisplatino e l'inibizione di CerS ha portato a una riduzione dell'accumulo osservato Cer/HexCer [33]. Inoltre, una riduzione indotta dal cisplatino dei livelli di SM/dhSM riscontrati nella corteccia e nel midollo suggerisce un ulteriore aumento della produzione di Cer/dhCer mediante idrolisi di SM/dhSM attraverso la via della sfingomielinasi (SMase) [38], con un impatto speciale su Cer/dhCer a catena lunga, tutti dannosi nei modelli di AKI [40]. Ciò sarebbe anche in accordo con il fatto che le specie Cer a catena lunga sembrano essere rilevanti durante l'AKI [40] e con precedenti osservazioni di un aumento dell'attività SMasi nelrenalecorteccia durante il trattamento con cisplatino [33]. Il Cer è coinvolto nell'apoptosi indotta dal cisplatino attraverso la segnalazione sia nelle vie intrinseche che estrinseche [39]. Nella via mitocondriale intrinseca, il cisplatino provoca la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna. L'aumento di Cer, insieme ai suoi metaboliti a valle, può contribuire a questa permeabilizzazione e la formazione di canali da parte di Cer facilita l'apoptosi nella membrana mitocondriale, consentendo l'ingresso di Bax nella membrana mitocondriale esterna, nonché il deflusso di citocromo C [39]. Inoltre, l'apoptosi estrinseca mediata da Fas impiega il recettore Fas situato nelle zattere lipidiche, con il suo raggruppamento mediato dall'attivazione della SMasi causata dal cisplatino e dall'elevazione del Cer [39]. Pertanto, Cer determina l'apoptosi nell'AKI indotto da cisplatino, mentre il loro livellamento attraverso la loro trasformazione in HexCer sembra essere protettivo [33] ed è associato alla resistenza al cisplatino [39]. Il Cer generato in grandi quantità può anche influenzare le proprietà fisiche delle membrane e può spostare il colesterolo e guidarne l'esterificazione [35]. D'altra parte, SM è presente principalmente nelle membrane plasmatiche e ha un'associazione diretta con le molecole di colesterolo, particolarmente importanti nelle zattere lipidiche [41]. Una mancanza di rigenerazione SM potrebbe essere negativa per il corretto funzionamento della membrana [41].
Sulf sono abbondanti nelrene,specialmente nella membrana apicale dei tubuli distali [42]. Anche se non sono essenziali per la normalitàfunzione renale, è stato riscontrato che una carenza di Sulf è compensata da una maggiore generazione di glicolipidi solfati e colesterolo [42]. Sulfatide è un ligando chiave di L-selectina nelrene,con un ruolo fondamentale nell'infiltrazione di monociti nelreneinterstizio [42]. D'altra parte, la mielina associata alla zattera lipidica e la proteina linfocitaria (MAL) formano complessi con solfatidi e glicosfingolipidi inrenalemembrane, contribuendo alla stabilizzazione e allo smistamento dei microdomini arricchiti con glicosfingolipidi [42]. I nostri risultati sulle alterazioni del solfato nella corteccia e nel midollo confermano studi precedenti in cui si pensava che anche diverse specie di solfatidi fossero alterate dal cisplatino nel rene [34].
Tutte le specie Cer, dhCer, HexCer e dhHexCer alterate nella corteccia dal cisplatino sono state parzialmente o totalmente recuperate dalla co-somministrazione di cilastatina, mentre nel midollo una grande quantità di specie Cer non è stata recuperata, con un recupero quasi completo di dhCer , HexCer e dhHexCer. Considerando il coinvolgimento delle specie Cer nell'apoptosi estrinseca mediata da Fas e il suo blocco da parte della cilastatina che si lega al DHP-I nelle zattere lipidiche al tubulo prossimale, ciò potrebbe spiegare l'effetto protettivo e il recupero del Cer che si verificano principalmente nelle cellule della corteccia. Per quanto riguarda SM, dhSM e Sulf, il recupero della cilastatina sembrava essere più rilevante nel midollo che nella corteccia, suggerendo che il danno secondario è compromesso dall'azione della cilastatina nei tubuli prossimali che raggiungono il midollo esterno, dove la maggior partedanno renaleè concentrato [4].
I fosfolipidi sono le specie più abbondanti nelle membrane cellulari, dove predominano PC e, in misura minore, PE, con una maggiore presenza di PC nel lato luminale e PE più abbondante nel lembo citosolico [35,43]. I lisofosfolipidi sono, d'altra parte, specie di segnalazione che possono essere generate dall'idrolisi dei glicerofosfolipidi incluso LPC [35]. La maggior parte delle 60 specie PC, PE e LPC quantificate sono risultate alterate dal trattamento con cisplatino, nella corteccia o nel midollo, con PC e LPC che presentavano una maggiore quantità di cambiamenti nella corteccia, mentre i cambiamenti associati a PE erano più numerosi e prominente nel midollo. Alterazioni direnaleLe specie PC, PE o LPC come risultato del trattamento con cisplatino sono conformi alle precedenti osservazioni riportate inrenedurante l'AKI [4,5,26,34,44]. I nostri risultati indicano che la maggior parte delle specie alterate di PE, PC e LPC sono state ridotte dal cisplatino sia nella corteccia che nel midollo. Per quanto riguarda l'effetto nefroprotettivo della cilastatina, sorprendentemente, è stato osservato un grado più elevato di effetto di recupero parziale o totale nel midollo per i lipidi alterati dal cisplatino rispetto alla corteccia. Un altro fatto interessante è che tutte le specie PC, PE e LPC aumentate con cisplatino nella corteccia e nel midollo sono state recuperate dalla cilastatina, mentre la maggior parte delle specie ridotte con cisplatino nella corteccia erano ancora alterate durante il trattamento con la cilastatina. Ciò potrebbe indicare un grado più elevato di danno diretto causato dall'accumulo di cisplatino nella corteccia, rimanendo non protetto dalla cilastatina e portando alla morte cellulare e al rilascio di PC, PE (i principali componenti della membrana cellulare) e LPC associati nei corpi apoptotici e, quindi, la riduzione dei loro livelli. Al contrario, il danno secondario associato all'apoptosi estrinseca e il conseguente accumulo di cast proteico nei tubuli prossimali possono essere protetti dalla cilastatina. Ciò implicherebbe che le specie PC, PE e LPC sono diminuite nel midollo e sono più correlate al danno cellulare secondario causato dal cisplatino. D'altra parte, l'aumento delle specie di PC, PE e LPC potrebbe essere associato alla rigenerazione della membrana cellulare o ai processi di segnalazione, che, secondo questi risultati, potrebbero essere più correlati all'apoptosi estrinseca secondaria causata dal cisplatino, protetto dalla cilastatina.
Inoltre, è stata osservata anche una diminuzione indotta dal cisplatino della percentuale di specie PC e PE con catene grasse altamente insature, che può essere correlata ai processi di perossidazione lipidica e sarebbe ridotta dalla cilastatina [4,10,11].
A livello globale, all'interno delle specie lipidiche qui quantificate, l'effetto di recupero della cilastatina è stato osservato in 26 su 56 lipidi alterati con cisplatino nella corteccia e in 50 su 63 lipidi alterati con cisplatino nel midollo. Forse, questo riflette un alto grado di cambiamenti lipidici associati al danno mitocondriale diretto non protetto esercitato dal cisplatino principalmente nella corteccia rispetto al midollo, con più cambiamenti lipidici associati alla protezione del danno secondario rilevata nell'intero midollo. Inoltre, l'analisi multivariata ha consentito l'identificazione di potenziali nuovi biomarcatori lipidici sia per l'AKI indotto da cisplatino che per la cilastatinanefroprotezione, comprese le specie CE, Sulf, PE, PC, Cer o HexCer, come descritto nelle Sezioni 2.5 e 2.6. Dai nostri risultati, CE 18:2 e PE 36:5 sono possibili biomarcatori candidati in grado di discernere contemporaneamente il danno di cisplatino e cilastatinanefroprotezionesia nella corteccia che nel midollo. Tuttavia, poiché il recupero di queste due specie con la cilastatina è parziale, specie più appropriate come biomarcatori sarebbero dhHexCer 34:0 nella corteccia e Sulf 42:0 nel midollo, essendo in grado di distinguere entrambidanno renalee protezione, con la cilastatina che ha recuperato completamente i livelli alterati dal cisplatino a quelli del gruppo di controllo. Questo potrebbe essere estrapolato a qualsiasi danno renale mediato da ligando Fas/Fas, ma dovrebbe essere confermato in studi futuri. Negli ultimi anni sono stati proposti diversi nuovi biomarcatori di AKI, principalmente proteine (ad es. KIM-1 [45] o NGAL [46]). Il fatto che abbiamo trovato potenziali nuovi biomarcatori dell'AKI indotta da cisplatino e della protezione associata della cilastatina, di natura lipidica inrenetessuto, amplia le conoscenze esistenti e fornisce opzioni complementari per una migliore diagnosi, prognosi e follow-up. In effetti, una combinazione di rilevamento di biomarcatori potrebbe anche essere potenzialmente utilizzata come indicazione di uno specifico AKI causato da un particolare nefrotossico (come il cisplatino) o da un'altra causa, e persino distinguere lo stato/la progressione della malattia. Un altro passo avanti sarebbe determinare se i nostri risultati fossero alteratirenalei modelli lipidici si riflettono anche nei lipidi circolanti nel sangue o nelle urine. Ciò renderebbe il rilevamento di biomarcatori per AKI indotto da cisplatino e cilastatinanefroprotezionepiù fattibile nei pazienti.
I cambiamenti nei livelli lipidici correlati all'AKI indotti dal cisplatino sono numerosi e diversi, comprendendo importanti lipidi strutturali a livello completorenalestruttura: corteccia e midollo. L'attenuazione di molti di questi cambiamenti da parte della cilastatina mostra il suo grande potenziale di miglioramentofunzione renalee riducendo i cambiamenti strutturali correlati ai lipidi, in correlazione con un normalizzatorenalemorfologia. Ancora una volta, la cilastatina si è rivelata utile per discernere il danno cellulare diretto non protetto causato dal cisplatino e le alterazioni secondarie legate al danno primario, che possono essere alterate nei tubuli prossimali dal blocco della cilastatina della via apoptotica mediata da Fas
Materiali e metodi
ReagentiSono stati impiegati cilastatina (gentilmente fornita da Merck Sharp e Dohme SA, Madrid, Spagna) e cisplatino (Pharmacia Nostrum (Madrid, Spagna). Una soluzione di NaCl del {{0}},9% (Braun Medical SA, Barcellona, Spagna) è stato utilizzato per la preparazione di soluzioni farmacologiche per la somministrazione. N-dodecanoil-D-eritro-sfingosilfosforilcolina [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glucosil- ß-1,10-N-dodecanoil-D-eritro-sfingosina [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodecanoil D -eritrosfinganilfosforilcolina [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimiristoleoil-sn glicero-3- fosfocolina [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-eptadecanoil-2-idrossi-sn-glicero-3- fosfocolina [LPC (17:0)] e 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glicero{55}}fosfoetanolammina [PE 32:2 (16:1/16:1)] sono stati acquistati da Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA). D-eritro-sfingosina [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoil D-eritro-diidrosfingosina [dhCer (36:0-d3)] e C16-30-sulfogalattosilceramide [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] sono state acquisite da Matreya LLC (State College, PA, USA). Il colesterolo-d7 (FC-d7) e il colesterolo-d7 palmitato [CE (16:{93}}d7)] provenivano da Sigma-Aldrich.
Sono stati utilizzati esclusivamente solventi e reagenti di grado HPLC o LC-MS, inclusi metanolo (MeOH), acetonitrile (ACN) e isopropanolo (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barcellona, Spagna), oltre a cloroformio, diclorometano e ammonio per mate (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Spagna). L'acqua ultrapura è stata ottenuta da un sistema di purificazione Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Spagna).
Modello animaleRatti wistar maschi adulti (WKY, Criffa, Barcellona, Spagna) sono stati allevati presso l'Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Spagna). Questi sono stati mantenuti in condizioni di temperatura, luce e umidità controllate con libero accesso a cibo e acqua. I trattamenti sono stati somministrati per via intraperitoneale come descritto in precedenza [4,11] a quattro gruppi di ratti (n {2}} animali per gruppo): Gruppo 1: controllo (CNT)—0, 9% di NaCl è stato iniettato al ratti allo stesso modo dei trattamenti per i gruppi 3 e 4; Gruppo 2: Cilastatina (CIL) - iniettata (150 mg kg 1 di peso corporeo (p.c.) al giorno); Gruppo 3: Cisplatino (CISPL) iniettato (una dose unica di 5 mg kg 1 peso corporeo al giorno 0); e Gruppo 4: Cisplatino più cilastatina (CISCIL) - iniettati 5 mg kg 1 pc al giorno 0 e iniettati cilastatina (150 mg kg 1 pc al giorno). Gli animali sono stati sacrificati cinque giorni dopo l'inizio del trattamento. Prima di questo, l'urina delle 24 ore è stata raccolta in gabbie metaboliche da ciascun ratto. Anche il siero del sangue è stato isolato mediante centrifugazione. I reni sono stati rimossi dopo la perfusione con una soluzione salina allo 0,9% a 4°C, seguita da decapsulazione. La corteccia e il midollo di sinistrarenee la metà trasversalmente di destrarenesono stati asportati, congelati a scatto in N2 liquido e infine conservati a t 80 ◦C. L'altra metà di destrareneè stato fissato in paraformaldeide al 4% e incluso in paraffifina per studi istologici.
Studi istologiciLa colorazione con ematossilina/eosina (Sigma-Aldrich, Steinhem, Germania) è stata eseguita su ratto sagittale di 5 µmrenesezioni. Un microscopio IX70 invertito (Olympus, Amburgo, Germania) è stato utilizzato per scattare microfotografie con ingrandimento 20× e 60×, per l'esame istologico.
Indicatori di funzione renaleUn AutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basilea, Svizzera) è stato utilizzato per la determinazione di BUN, creatinina, sodio e potassio in campioni di siero. Il tasso di clearance della creatinina è stato utilizzato per il calcolo della GFR. La proteina totale è stata determinata nelle urine utilizzando il metodo dell'acido sulfosalicilico [47].
Omogeneizzazione dei tessuti Renei tessuti della corteccia e del midollo (circa 50 mg ciascuno) sono stati aggiunti a provette di plastica con tappo a vite da 1,5 ml contenenti 800 µl di soluzione di tampone di lisi: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 125 mM, NaF 5 mM, Na4O7P2 mM, Na3VO4 1 mM, e inibitore della proteasi (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) e perline di zirconio da 1,5 mm. I tessuti sono stati disaggregati su un omogeneizzatore BeadBug-6 (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientific, Sayreville, NY, USA) a 4500 giri/min, in tre cicli di 90 s. L'omogeneizzato è stato ulteriormente sonicato per 40 s al 10 percento di ampiezza e centrifugato a 600 × g per 1 minuto a 4 °C. Un'aliquota del surnatante risultante è stata diluita 1:10 per la determinazione delle proteine totali mediante il saggio proteico dell'acido bicinconinico (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Il resto dell'estratto proteico è stato conservato a t 80 ◦C fino all'analisi lipidomica.
Analisi lipidomica mediante LC-MS/MSI lipidi sono stati estratti dai tessuti (equivalenti a 250 µg di proteine totali) seguendo il metodo di Folch [48]. Dieci microlitri di una miscela di standard interno (IS) sono stati aggiunti prima dell'estrazione lipidica per ottenere la quantificazione molare relativa delle specie lipidiche, come descritto in precedenza [49]. La miscela IS era composta da: CE (16:{5}}d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) e Sulf (34 :1), nelle concentrazioni riportate in Tabella S4. Gli estratti lipidici sono stati essiccati sotto un flusso di azoto e ricostituiti in 250 µl di acetonitrile/isopropanolo (1:1, vol:vol), sonicati per 10 minuti e quindi trasferiti in una fiala di iniezione.
Cinque microlitri dell'estratto lipidico sono stati iniettati su un sistema LC Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA). Le specie sono state separate su una colonna Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, Regno Unito) operante a 55 ◦C. L'eluizione è stata applicata utilizzando una miscela binaria di solvente A (60% acetonitrile in acqua, 10 mM NH4COOH) e solvente B (90% alcol isopropilico in acetonitrile, 10 mM NH4COOH) e un gradiente lineare dal 60% A al 100% B in 12 min e dal 100 percento di B al 60 percento di A in 8 minuti, a una portata di 0,4 ml min₆ 1 . Per il rilevamento dei lipidi è stato utilizzato uno strumento QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA) con il software Analyst 1.6.2. L'azoto è stato impiegato sia come gas di essiccazione (T: 500 ◦C, pressione: 30 psi) che come gas di nebulizzazione (50 psi). La rilevazione è stata impostata in modalità elettrospray (ESI) positiva per tutte le classi lipidiche ad eccezione di Sulf, che è stata analizzata in modalità ESI negativa. CE e FC sono stati analizzati utilizzando la sorgente di ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) nella modalità di ioni positivi. È stato utilizzato un approccio mirato per il rilevamento dei lipidi impostando le transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) per ciascuna specie lipidica ai loro tempi di ritenzione (Tabella S5). I cromatogrammi di picco LC-MS/MS sono stati elaborati utilizzando il software Skyline versione 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, USA) [50]. Le specie lipidiche sono state quantificate mediante confronto diretto dell'area per ciascuna specie con l'area dell'IS per la loro classe lipidica, come descritto in precedenza [49]. I risultati sono stati espressi come proteine nmol/mg. I livelli di classe lipidica totale sono stati determinati come somma delle singole specie di classe lipidica quantificate. Le specie lipidiche sono state designate secondo la notazione raccomandata [51].
Analisi statisticaI valori sono stati espressi come media ± deviazione standard. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per le statistiche descrittive e per valutare le differenze statistiche nelle variabili tra i gruppi mediante l'analisi della varianza. Per il confronto tra due gruppi spaiati di variabili lipidiche, dopo il test di normalità (Shapiro–Wilk) sono stati eseguiti test parametrici (t di Student non appaiati a due code) o non parametrici (Mann–Whitney). Il metodo Benjamini-Hochberg è stato utilizzato per la correzione del tasso di falsa scoperta (FDR) dei valori p durante il confronto di più specie individuali di lipidi. Un valore p a due code < 0.05="" e="" fdr="">< 0,1="" sono="" stati="" considerati="" per="" l'identificazione="" di="" differenze="" statisticamente="" significative="" per="" evitare="" di="" perdere="" potenziali="" candidati="" biomarcatori.="" il="" cambiamento="" di="" piega="" del="" gruppo="" x="" rispetto="" al="" gruppo="" y="" è="" stato="" calcolato="" come="" rapporto="" tra="" i="" valori="" medi="" per="" le="" variabili="" dei="" rispettivi="" gruppi="">
L'analisi dei dati multivariati (MVDA) è stata eseguita utilizzando SIMCA versione 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Svezia) e MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (accesso il 30 2 settembre {{20}}21)) [52], inclusi PCA non supervisionato e OPLSDA supervisionato. I valori mancanti sono stati sostituiti utilizzando il metodo k-neiest neighbors. Le variabili sono state trasformate in log e ridimensionate in pareto prima di MVDA. I modelli sono stati valutati in base ai loro valori R2 e Q2. OPLS-DA è stato convalidato mediante test di permutazione (100 cicli). I punteggi VIP e gli S-plot dei modelli OPLS-DA sono stati utilizzati per identificare le variabili rilevanti nella discriminazione di gruppo CISPL rispetto a CNT, CISCIL rispetto a CNT e CISCIL rispetto a CISPL. Conformità simultanea a VIP > 1, carichi scalati come coefficiente di correlazione |p(corr)| > 0,5 e p-value <0,05 e="" fdr=""><0,1 per="" il="" confronto="" a="" due="" gruppi="" erano="" i="" criteri="" impiegati="" per="" la="" selezione="" del="" potenziale="" biomarcatore.="" i="" valori="" auc="" sono="" stati="" ottenuti="" dai="" grafici="" della="" curva="">
BrevettiI seguenti brevetti sono parzialmente correlati al lavoro presentato in questo manoscritto: "Use of cilastatina per ridurre la nefrotossicità di vari composti" (numeri di brevetto EP2.143.429 B1; US 9.216.185 B2; US 9.522.128 B2 e US 9.757.349 B2). Questi sono assegnati alla Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) e concessi in licenza da FIBHGM a Telara Pharma SL Telara Pharma SL ha attualmente stipulato un accordo di licenza con Arch Biopartners.