Come le proteine ​​di riparazione della membrana cellulare regolano la trasduzione del segnale del fattore di trascrizione per controllare la fibrosi renale

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Haichang Li

Renela fibrosi è associata alla progressione dell'acutorenedanno da malattia renale cronica. MG53, una proteina di riparazione della membrana cellulare, ha dimostrato di proteggere dalle lesioni alle cellule epiteliali renali e dal danno renale acuto. Qui, abbiamo valutato il ruolo di MG53 nella modulazione direnefibrosi nei topi anziani e nei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) un modello noto di fibrosi renale progressiva. I topi con ablazione di MG53 hanno sviluppato più fibrosi interstiziale con l'età rispetto ai topi intatti MG53-della stessa età. Allo stesso modo, in assenza di MG53,renela fibrosi era esagerata rispetto ai topi con MG53 intatto nel rene ostruito rispetto al rene controlaterale non ostruito o ai reni di topi simulati. L'ureterale ostruitorenida topi carenti di MG53 hanno mostrato anche un'infiammazione significativamente maggiore rispetto ai reni ostruiti ureterali da topi intatti MG53. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che MG53 potrebbe entrare nei nuclei delle cellule epiteliali tubulari prossimali e interagire direttamente con il componente p65 del fattore di trascrizione NF-kB, fornendo una possibile spiegazione dell'aumento dell'infiammazione in assenza di MG53. Per testare questo, ai topi soggetti a UUO è stata somministrata una maggiore espressione di MG53 attraverso cellule ingegnerizzate o somministrazione diretta di proteine ​​ricombinanti. Questa ridotta attivazione e infiammazione di NF-kB e attenuata la fibrosi renale. Pertanto, MG53 può avere un ruolo terapeutico nel trattamento dell'infiammazione renale cronica e quindi fornire protezione controfibrosiche porta al fenotipo della malattia renale cronica.

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Dichiarazione traslazionale L'infiammazione cronica porta a un rimodellamento fibrotico che può anche essere alla base del passaggio da danno renale acuto a malattia renale cronica. L'attivazione del fattore di trascrizione proteico-infiammatorio fattore nucleare-kB (NF-kB) è coinvolta nella patogenesi dell'infiammazione renale. Qui, forniamo prove che MG53, una proteina di riparazione della membrana cellulare precedentemente identificata, interagisce direttamente con NF-kB e riduce la sua attività trascrizionale. Contemporaneamente, MG53 somministrato per via esogena può ridurre il rimodellamento fibrotico del rene infiammato. Questi risultati indicano un'interazione protettiva tra MG53 e NF-kB per attenuare lo sviluppo della fibrosi renale mediata dall'infiammazione. La somministrazione farmacologica di MG53 potrebbe essere un approccio promettente per il trattamento della fibrosi renale progressiva.

La disfunzione renale, che può essere classificata come danno renale acuto (AKI) o malattia renale cronica (CKD), è diventata un'epidemia nelle popolazioni più anziane. Nel 2017, la prevalenza di CKD ha raggiunto il 14,5% delle persone di età pari o superiore a 65 anni, con una spesa Medicare di oltre 84 miliardi di dollari per il trattamento.^1,2AKI e CKD sono più comuni negli individui più anziani, principalmente a causa della maggiore suscettibilità alle lesioni più una ridotta capacità di riparare il rene che invecchia. Studi clinici hanno dimostrato che la CKD è un importante fattore di rischio per AKI e, al contrario, episodi di AKI possono accelerare la progressione della CKD verso la malattia renale allo stadio terminale. Attualmente, il trattamento dell'AKI è principalmente di supporto e il trattamento dell'insufficienza renale cronica conclamata si concentra sul rallentamento della progressione attraverso l'inibizione del sistema renina-angiotensina-aldosterone e ora possibilmente attraverso l'inibizione del cotrasportatore sodio-glucosio-2.^3,4

A seconda della gravità della lesione, le cellule tubulari prossimali, il principale bersaglio della lesione acuta, possono subire cambiamenti nella progressione del ciclo cellulare,5,6 metabolismo,7 secrezione di citochine proteiche-infiammatorie e profibrotiche, o parziale transizione epiteliale-mesenchimale,8 che determinerà se il rimodellamento/riparazione avrà successo o sarà disadattivo e si tradurrà in fibrosi renale, un segno distintivo dell'insufficienza renale cronica.9,10 Questo rimodellamento si verifica generalmente su uno sfondo di infiammazione renale,

ridotto apporto vascolare e produzione di proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) e comprende la perdita di cellule epiteliali e l'accumulo di collagene, actina muscolare liscia e fibronectina; ha anche un'alta correlazione con il deterioramento della funzione renale.

L'infiammazione cronica porta a un rimodellamento fibrotico che può anche essere alla base della transizione da AKI a CKD.11-13 Ricerche cumulative suggeriscono il coinvolgimento del fattore di trascrizione del fattore nucleare-kB (NF-kB) nella patogenesi dell'infiammazione renale causata da infezione, lesione, o trapianto.11,12,14 L'attivazione della via canonica NF-kB inizia con l'attivazione dell'inibitore della chinasi NF-kB (IkB), che porta alla fosforilazione e alla degradazione di IkBa e alla traslocazione nucleare degli eterodimeri NF-kB.15 L'attivazione della segnalazione di NF-kB nelle cellule epiteliali renali e nelle cellule immunitarie infiltranti può essere provocata da fattori scatenanti fisiopatologici come l'esposizione ai lipopolisaccaridi (LPS) o il danno da ischemia-riperfusione.16 Studi di profilazione molecolare rivelano che nfkb1 è uno dei principali fattori di fibrosi renale.¹⁷Oltre alle cellule tubulari renali, anche le cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche contribuiscono al danno renale, all'infiammazione e al rimodellamento fibrotico.^13,18–20

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Prove crescenti suggeriscono che i fattori secretori di origine muscolare (cioè le miochine) modulano la fisiologia sistemica attraverso la diafonia tissutale per influenzare la progressione delle malattie renali.²¹MG53 (denominato anche TRIM72) è una proteina del motivo tripartito arricchito di muscoli (TRIM) con una funzione critica nella riparazione della membrana cellulare.22,23 Le proteine ​​della famiglia TRIM hanno diverse funzioni che vanno dalla regolazione della segnalazione immunitaria alla riparazione dei tessuti.²⁴La riparazione della membrana mediata da MG53-è coinvolta nell'attenuazione del danno acuto al muscolo scheletrico,²⁵reni,²⁶cuore,²⁷ polmoni, 28 cervelli,^29,30e pelle.³¹I nostri studi precedenti hanno identificato un basso livello di espressione di MG53 nel rene, che è un componente chiave nella protezione dell'AKI, e i topi carenti di MG53 (mg53 / ) erano più suscettibili all'AKI indotto dallo stress.²⁶Abbiamo anche recentemente dimostrato che l'aumento prolungato di MG53 nella circolazione migliora la riparazione e la rigenerazione del danno tissutale.32 I ruoli relativi dell'MG53 circolante specifico del rene ed estrinseco nella modulazione della fibrosi renale durante la CKD progressiva sono ancora sconosciuti.

Recentemente, si è evoluto un ruolo emergente di MG53 nella modulazione della protezione dei tessuti attraverso l'inibizione dell'infiammazione, in particolare attraverso la modulazione della segnalazione di NF-kB. Ad esempio, MG53 attenua la neurotossicità e la neuroinfiammazione indotte da LPS inibendo la via TLR4/NF-kB,33 e l'MG53 cardiaco regola l'espressione di KChIP2 per controllare il rimodellamento elettrofisiologico durante l'ipertrofia cardio.34 Inoltre, abbiamo dimostrato una doppia funzione di MG53 in prevenire una risposta iperinfiammatoria disadattiva durante un'infezione da virus influenzale subletale A, caratterizzata da un'eccessiva produzione di interferone-b, tramite la soppressione dell'attivazione di IRF3/NF-kB e l'inibizione della segnalazione intracellulare aberrante del Ca2þ nei macrofagi.35 Inoltre, a una dose letale di influenza A virus, è stato dimostrato che l'MG53 previene la mortalità e il danno polmonare, non influenzando direttamente i titoli virali di per sé, ma mitigando la tempesta di citochine (interferone-b, interleuchina-6 e interleuchina-1b) attraverso una regolazione negativa dell'inflammasoma NLRP3 e prevenzione della piroptosi del polmone.36 Inoltre, il trattamento cronico ad alte dosi di MG53 esogeno era collegato alla soppressione di NF-kB – infiammazione mediata nel cuore invecchiato.37 Questi studi suggeriscono che MG53 può modulare la segnalazione aberrante di NF-kB durante l'infiammazione, ma non è stato studiato se ciò si verifica nel contesto dell'infiammazione renale.

Abbiamo postulato che MG53 regola l'infiammazione renale modulando l'attività trascrizionale di NF-kB e così facendo può attenuare la fibrosi renale che si verifica come conseguenza dell'infiammazione cronica. Questo studio è stato intrapreso per affrontare questa ipotesi.

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METODI

Studi sugli animali

Tutti gli esperimenti con animali hanno aderito alla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e hanno seguito i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Ohio State University. Tipo selvaggio corrispondente all'età (WT) o mg53^-/-sono stati utilizzati non cucciolata del ceppo 129S1/SvImJ22 per stabilire il ruolo di MG53 nella modulazione della fibrosi renale indotta dall'ostruzione ureterale unilaterale e dipendente dall'età (UUO). I topi C57B6/J (9-10 settimane) sono stati acquistati da Jackson Labs.

Per gli studi sulle lesioni renali, i topi (9-12 settimane) sono stati sottoposti a UUO per indurre fibrosi renale. I topi sono stati anestetizzati tramite isoflurano (1,5 percento -2, {5}} percento) per garantire un piano profondo di anestesia. La procedura UUO è stata eseguita legando l'uretere sinistro con 5-0 seta chirurgica due volte secondo i protocolli pubblicati.38 ​​I topi Sham avevano solo un'incisione cutanea addominale. Per valutare l'effetto di rhMG53 sul danno renale ostruttivo, 1 gruppo di topi UUO ha ricevuto rhMG53 (2 mg/kg) tramite iniezione nella vena della coda iniziando immediatamente dopo l'intervento chirurgico UUO (giorno 0) e poi ogni giorno per 7 giorni, con 2 dosi aggiuntive nei giorni 9 e 11. Un gruppo di controllo di topi UUO ha ricevuto iniezioni di soluzione salina secondo lo stesso programma. I topi sono stati uccisi il giorno 12 dopo l'intervento chirurgico UUO, i reni sono stati perfusi in situ con soluzione salina tamponata con fosfato e sono stati raccolti campioni di tessuto dal rene UUO e dal rene controlaterale per l'istologia e l'analisi Western blot.

In studi separati, WT e mg53^-/-i topi sono stati sottoposti a chirurgia UUO o sham e sono stati uccisi il giorno 7 dopo l'operazione. MG53 è stato somministrato ai topi utilizzando un approccio terapeutico basato sulle cellule.39 I macrofagi RAW 264.7 sono stati infettati con particelle virali Ad tPA-MG{8}}di ciliegio dipendenti dalla doxiciclina (DOX) per 24 ore. Le cellule infette (a una concentrazione di {{10}}/100 ml di soluzione salina per topo) sono state iniettate nella vena della coda nei topi subito dopo l'intervento chirurgico (iniezione del giorno 0). I topi hanno ricevuto 4 iniezioni di cellule RAW trasdotte Ad-tPA-MG53 nei giorni 0, 1, 3 e 6. Immediatamente dopo l'iniezione di cellule del giorno 0, i topi sono stati randomizzati in un gruppo che ha ricevuto e un gruppo che non ha ricevuto DOX (2 mg/ml in una soluzione di saccarosio al 5%) nell'acqua da bere per 7 giorni e poi uccisi. Sono stati raccolti campioni di tessuto dal rene UUO e dal rene controlaterale per l'analisi istologica, dell'RNA e delle proteine.

Analisi statistiche I dati sono espressi come medie -SD. È stato eseguito un confronto all'interno dei gruppi utilizzando il test t di Student confrontando 2 ricerche sperimentali di base H Li et al.: MG53 modula NF-kB nella fibrosi renale 2 Kidney International (2021) -, -–-gruppi e 1-analisi della varianza per più di 2 gruppi (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) seguita dal test di confronto multiplo Bonferroni o Holm-Sidak ad hoc. Un valore di P < 0,05="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="">

Metodi supplementari Metodi completi tra cui valutazione istologica, misurazioni della creatinina sierica, costrutti plasmidici, coltura cellulare e isolamento delle cellule epiteliali tubulari primarie, preparazione di adenovirus e infezione cellulare, test di traslocazione nucleare NF kB p65, immunoistochimica e immagini confocali, test reporter della luciferasi NF-kB, citochina test di immunoassorbimento enzimatico, frazionamento dei tessuti, immunoblotting, coimmunoprecipitazione, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (Tabella Supplementare S1) e produzione di rhMG53 sono nei metodi supplementari.

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RISULTATI

I topi con ablazione di MG53 sviluppano fibrosi renale età-dipendente

Abbiamo confrontato l'effetto dell'invecchiamento sulla funzione renale e sulla fibrosi in mg53^-/-e topi WT. Abbiamo confermato la nostra precedente osservazione che, sebbene i livelli di creatinina sierica di topi giovani (2 mesi) con e senza MG53 non fossero significativamente diversi, i livelli di creatinina sierica di topi giovani (2 mesi) con e senza MG53 non erano significativamente diversi, più vecchi (16-20 mesi) mg53-/-i topi hanno mostrato una creatinina sierica significativamente più alta rispetto ai controlli WT corrispondenti all'età (Figura 1a). Sulla base della colorazione tricromica, abbiamo riscontrato che mg53-/-i topi avevano più fibrosi renale rispetto ai topi WT, a partire dall'età di 5 mesi e continuando fino all'età di 20 mesi (Figura 1b e c). La colorazione immunoistochimica è stata utilizzata per valutare l'impatto dell'ablazione di MG53 sull'infiltrazione di leucociti, monociti e macrofagi in reni di topo di 2-mese e 5-mese (Figure 1d ed e). I reni di topi giovani WT e mg53-/- avevano livelli simili di leucociti intrarenali, ma nei topi mg53/reni sono state trovate molte più cellule infiammatorie rispetto ai reni WT in 5-mesi di topi.

Inoltre, l'immunoistochimica per l'actina del muscolo liscio e la fibronectina, 2 proteine ​​della matrice extracellulare che si trovano comunemente nelle aree di fibrosi renale, ha mostrato una colorazione aumentata (da 3- a 8- volte) nei glomeruli e nel tubulointerstizio dei reni da { {4}}topi mg53-/- di un mese rispetto a 10-topi WT di un mese (Figura supplementare S1).

L'UUO induce un'infiammazione renale e una fibrosi aggravate in mg{0}}/- topi I livelli di MG53 del rene rilevati mediante immunoblotting sono aumentati significativamente 7 giorni dopo l'UUO (Figura 2a). I reni mg53- /- UUO mostravano una fibrosi esagerata, con un'area macchiata con tricromi del 30% in più, rispetto ai reni WT UUO (Figura 2b).

MG53 modula l'attivazione di NF-kB e la localizzazione nucleare di p65

L'attività di NF-kB (p65) è stata valutata nel modello UUO. Il numero di p65 totale (t-p65) era significativamente aumentato nei reni UUO da WT e mg53/topi, ma l'attivazione di NF-kB, valutata come fosforilazione di p65, era maggiore (16- volte) nel mg53/UUO rene rispetto al rene WT UUO (2- volte) rispetto agli animali operati con la simulazione (Figura 3a). Abbiamo analizzato i livelli di RNA relativi del fattore di crescita trasformante b1 (TGF-b1), dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1) e del collagene di tipo I alfa 1 (Col1a1) nel rene ostruito.40 Abbiamo rilevato bassi livelli di espressione genica negli animali fittizi e induzione simile (TGF-b1, w10 volte; PAI-1, w40 volte; Col1a1, w40 volte) nel rene UUO da WT e mg53 / (Figura 3b). Per esaminare la distribuzione spaziale di MG53 nella corteccia renale in condizioni normali, sono state analizzate le frazioni di tessuto renale. Abbiamo ottenuto regolarmente 10- volte più proteine ​​​​del citosol totale rispetto alla proteina nucleare totale estratta. I livelli di t-p65 erano comparabili nella frazione citosolica tra WT e mg53-/- topi, ma erano maggiori nella frazione nucleare di mg{38}}/- topi (Figura 3c). MG53 è stato rilevato nella frazione del citosol (con la tubulina come marcatore del citosol). Inaspettatamente, è stata rilevata una quantità significativa di MG53 nella frazione nucleare (con l'istone H3 come marcatore della frazione nucleare).

Per confermare questa scoperta, abbiamo anche esaminato la localizzazione di MG53 nelle frazioni muscolari scheletriche (Figura supplementare S2). Abbiamo riprodotto i nostri studi precedenti in cui MG53 si localizzava nel citosol e nella membrana sarcolemmale (adenosina trifosfatasi sodio-potassio come marcatore della frazione di membrana)22,23,25 ma rilevava anche MG53 nucleare arricchito dal muscolo scheletrico.

MG53 interagisce con p65 per controllare l'attività trascrizionale indotta dal fattore di necrosi tumorale-a– Per confermare i nostri risultati di frazionamento dei tessuti, abbiamo condotto i seguenti studi immunoistochimici. Nelle cellule epiteliali tubulari prossimali WT in coltura, p65 è stato trovato principalmente nel citosol ma localizzato nei nuclei in assenza di MG53 (Figura 4a). Quando queste cellule sono state trattate con LPS (5 mg) per 8 ore, la secrezione di citochine pro-infiammatorie era significativamente maggiore in mg53 / cellule rispetto alle cellule WT (Figura 4b).

Poiché questi dati suggerivano che MG53 potesse interagire con p65 per regolare l'espressione di citochine infiammatorie, è stata valutata un'interazione diretta tra p65 e MG53 mediante saggi di coimmunoprecipitazione utilizzando cellule HEK293 cotrasfettate con Flag-p65 e HA-MG53. Abbiamo dimostrato un'interazione debole (Figura 4c). La cotrasfezione dei plasmidi GFP-p65 e RFP-MG53 e l'analisi confocale hanno confermato la colocalizzazione di p65 e MG53 (Figura 4d). Abbiamo quindi quantificato se MG53 influenza l'attività trascrizionale di NF-kB (p65) dopo la stimolazione del TNF misurando l'attività della luciferasi da una linea cellulare reporter trascrizionale stabile NF-kB/293- GFP-Luc che è stata transfettata transitoriamente con uno dei vettori pHM6 o HA-MG53. Le cellule reporter contengono un reporter di luciferasi di lucciola con espressione di lentivirus trasdotto guidato da un promotore di citomegalovirus minimo in combinazione con 4 copie di elementi di risposta trascrizionale NF-kB di consenso (sito kB) a monte. In assenza di TNF-a, è stata rilevata un'attività intrinseca della luciferasi molto bassa nelle cellule reporter che esprimono le proteine ​​​​MG53. MG53 ha soppresso l'attività trascrizionale di NF-kB (p65) provocata da TNF-a di circa il 40 percento (Figura 4e).

La sovraespressione di MG53 ha impedito la traslocazione nucleare di NF-kB p65 in seguito al trattamento con TNF-a NF-kB p65 si è traslocato nel nucleo in seguito al trattamento con TNF-a nell'epitelio del tubulo prossimale del rene.41 Per esplorare se il trattamento con MG53 potrebbe attenuare la traslocazione nucleare di NF-kB p65 dopo la stimolazione del TNF-a, abbiamo sovraespresso MG53 nelle cellule HKC-8 tramite la trasduzione virale Ad-tPA-MG53 dipendente da DOX o attraverso il trattamento con MG53 umano ricombinante (rhMG53). Utilizzando un anticorpo monoclonale MG53-specifico, dopo l'induzione DOX-dipendente MG53 è stato rilevato mediante immunoblotting. MG53 era presente a un livello molto alto nelle cellule HKC-8 trasdotte da Ad-tPA-MG53,

equivalente a 1 ng rhMG53/mg lisato cellulare. Al contrario, HKC-8 ha raccolto ed espresso una quantità molto inferiore di rhMG53 (Figura 5a). L'assorbimento di rhMG53 FL con etichetta fluorescente da parte di HKC-8 è stato confermato dalla microscopia confocale (Figura supplementare S3). Dopo il trattamento con TNF-a, il tempo per raggiungere il picco di attivazione di p65 era compreso tra 15 e 30 minuti (Figura 5b). In condizioni basali, NF-kB p65 risiedeva principalmente nel citosol e la sovraespressione di MG53 non lo cambiava (Figure 5c e d). Tuttavia, dopo la stimolazione del TNF-a, p65 si è traslocato nei nuclei delle cellule HKC-8 senza sovraesprimere MG53. In confronto, la traslocazione nucleare di p65 è diminuita dal 33 percento (cellule a cui è stato somministrato rhMG53) al 50 percento (cellule trasdotte a cui è stato somministrato DOX) nelle cellule che sovraesprimono MG53 (Figura 5c e d).

Il trasferimento adottivo di cellule RAW ingegnerizzate nel modello UUOmouse è stato eseguito con 1 - 106 cellule somministrate tramite iniezione nella vena della coda subito dopo l'intervento chirurgico UUO. I topi sono stati divisi casualmente in un gruppo che ha ricevuto acqua potabile normale (-DOX) e un gruppo che ha ricevuto DOX (2 mg/ml) nell'acqua potabile. I topi UUO hanno ricevuto RAWeogni altro giorno per un totale di 4 iniezioni. I reni sono stati raccolti 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.

I topi infusi con RAW ingegnerizzato seguito da induzione DOX hanno mostrato una fibrosi renale significativamente ridotta (del 30%) rispetto a quelli che non hanno ricevuto cellule o quelli infusi con cellule RAW ingegnerizzate ma senza induzione di Dox (66% di area fibrotica; Figura 6a e b).

Solo una piccola popolazione RAW/Ad-tPA-MG53 è sopravvissuta alla sorveglianza del sistema reticoloendoteliale entro la fine degli esperimenti. La colorazione immunoistochimica ha confermato che l'espressione di MG53 mediata da RAW indotta dal trattamento DOX nel rene (Figura 6c). È interessante notare che i reni UUO di topi infusi con RAW e MG53 indotto da DOX hanno mostrato un rapporto p{10}}/t-p65 inferiore (di circa il 40 percento) rispetto a quelli che non hanno ricevuto RAW o a quelli che hanno ricevuto RAW senza DOX (Figura 6d ed e). Il livello ridotto di p-p65 è stato confermato con la colorazione immunoistochimica p-p65 (S536) dei reni UUO (Figura 6f). Riteniamo che l'MG53 circolante fornito da Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX e l'assorbimento da parte delle cellule del tubulo prossimale del rene potrebbero partecipare alla riduzione di p-p65 (S536) e diminuire l'infiammazione renale UUO. Rispetto ai reni solo UUO, l'espressione di TGF-b1, PAI- 1 e Col1a1 è aumentata significativamente nei reni UUO da topi infusi con RAW senza DOX (nessuna induzione MG53). L'aumento di questi geni profibrotici potrebbe essere attribuito all'induzione di una forte reazione di allotrapianto da cellule infuse in topi immunocompetenti. Tuttavia, i reni UUO di topi infusi con RAW e trattati con DOX (induzione MG53) hanno espresso livelli significativamente più bassi (60% -72% di riduzione) PAI-1 e livelli relativamente più bassi di TGF-b1 e Col1a1 rispetto ai topi senza trattamento DOX (Figura 6g).

La somministrazione sistemica di rhMG53 mitiga l'attivazione di NF-kB e lo sviluppo di fibrosi nei topi sottoposti a UUO

Abbiamo testato se rhMG53 ha mostrato un effetto antifibrotico simile alla terapia cellulare RAW ingegnerizzata descritta in precedenza. I nostri precedenti dati di farmacocinetica indicavano la breve emivita circolante (circa 90 minuti nei roditori) di rhMG53.42 I topi tolleravano la somministrazione cronica di 2-6 mg/kg

rhMG5326,37 bene, quindi è stata utilizzata la strategia di amministrazione mostrata nella Figura 7a. Ai topi UUO è stato somministrato casualmente un veicolo (soluzione salina) o rhMG53 (2 mg/kg) al giorno per i primi 7 giorni dopo l'intervento chirurgico e poi a giorni alterni fino a quando non sono stati uccisi il giorno 12. I reni fittizi e controlaterali hanno mostrato un t-p65 più o meno equivalente e livelli di espressione della fibronectina, con i livelli di p-p65 leggermente aumentati nei reni controlaterali rispetto ai reni fittizi. Dopo UUO, il rene t-p65 è aumentato. Rispetto agli animali trattati con soluzione salina, il rapporto p-65/t-p65 nei reni UUO degli animali trattati con rhMG53-è stato ridotto di circa il 37%, mentre IkBa è aumentato di circa il 27% (Figura 7b e c). Inoltre, la fibronectina è diminuita di circa il 33% (Figura 7b e c). L'immunoistochimica ha confermato che rhMG53 era presente nei reni UUO dopo il trattamento (Figura 7d). La fibrosi totale è stata ridotta nei reni UUO trattati con rhMG53- (Figura 7e). Tuttavia, l'espressione dell'RNA di TGF-b1, PAI-1 e Col1a1 era simile nei topi trattati con soluzione salina o rhMG53 (Figura 7f).

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DISCUSSIONE

MG53 è una proteina TRIM arricchita con muscoli inizialmente identificata come un componente importante del macchinario di riparazione della membrana plasmatica.22,26,42,43 Tuttavia, le azioni di MG53 non sono limitate al muscolo scheletrico e MG53 può essere rilasciato nella circolazione come un miochina.32 In precedenza abbiamo dimostrato che l'MG53 può controllare l'infiammazione durante il danno tissutale in organi remoti.27,29,33,35–37 La presente indagine estende l'ambito della protezione degli organi mediata da MG53-al rene. Concludiamo che MG53 può attenuare l'infiammazione intrarenale e la fibrosi renale bloccando l'attivazione indotta da citochine del fattore di trascrizione proinfiammatorio e profibrotico NF-kB. Questa conclusione si basa sulle seguenti osservazioni: (i) delezione genetica di MG53 nei topi normali.

ha provocato un declino della funzione renale con l'invecchiamento dei topi, accompagnato da un aumento della fibrosi renale e dall'infiltrazione del rene da parte di leucociti e macrofagi; (ii) in un modello murino di danno renale UUO, i reni ostruiti di topi con deficit di MG53- hanno mostrato più fibrosi e infiammazione rispetto a topi con MG53-repleto; (iii) la produzione di TNF-a e interleuchina-6 da parte delle cellule epiteliali tubulari prossimali trattate con LPS è stata attenuata in presenza di MG53; (iv) il trattamento con o la sovraespressione di MG53 in una linea cellulare epiteliale tubulare prossimale ha diminuito l'attivazione di NF-kB indotta da TNFa bloccando la traslocazione nucleare del componente p65 di-kB (è stato riscontrato che MG53 si lega direttamente a p65, anche se debolmente); e (v) la fosforilazione di p65, un passaggio necessario nell'attivazione di NF-kB, è stata ridotta nei reni ostruiti di topi UUO trattati con MG53 ricombinante indotto a sovraesprimere MG53 nei macrofagi. Inoltre, l'inibitore dell'attivazione di NF-kB, IkBa, è stato aumentato nei reni ostruiti di topi UUO iniettati con ricombinanteMG53.

La delezione genetica di MG53 nei topi normali era favorevole agli effetti avversi dell'invecchiamento sui reni. Ciò suggerisce che la presenza di MG53 endogeno fornisce un livello di base di protezione durante l'invecchiamento. Allo stesso modo, la perdita di MG53 endogeno ha peggiorato l'AKI a causa dell'ostruzione. Il rene UUO ha accumulato MG53, probabilmente riflettendo l'attività remota della miochina dal muscolo scheletrico. Non è chiaro come il muscolo MG53 possa essere reclutato nel rene durante la lesione; tuttavia, un rene danneggiato spesso sviluppa ipossia e va incontro a stress ossidativo,^44,45segnali che potrebbero servire per reclutare MG53. In tal caso, questo asse "muscolo-rene-cellule immunitarie" potrebbe essere sfruttato per attenuare il danno renale.46 In alternativa, le cellule renali esprimono bassi livelli di MG53 al basale,²⁶e, durante lesioni acute o croniche, la produzione di MG53 potrebbe essere sovraregolata.

NF-kB è un importante fattore trascrizionale di infiammazione e fibrosi nel danno renale e nell'invecchiamento.^14,17,47,48Ci è stato chiesto di indagare se gli effetti di MG53 potessero essere mediati tramite NF-kB perché la presenza di MG53 nel compartimento nucleare degli omogenati renali suggeriva il potenziale di interferenza trascrizionale. La localizzazione nucleare di MG53 non è senza precedenti. In un modello transgenico che sovraesprime l'MG53 miocardico, l'MG53 nucleare regola l'espressione del recettore alfa attivato dal proliferatore del perossisoma a livello trascrizionale e colpisce il metabolismo lipidico cardiaco.49 Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato l'attivazione di NF-kB soppressa da rhMG53 per mitigare l'insufficienza cardiaca correlata all'età attraverso la riduzione delle citochine pro-infiammatorie, dell'apoptosi e dello stress ossidativo nei cardiomiociti invecchiati.³⁷

Il meccanismo molecolare di come MG53 modula la mobilitazione nucleare/citoplasmica di p65 rimane poco chiaro. MG53 non contiene alcun segnale di localizzazione nucleare, ma contiene 3 presunti segnali di esportazione nucleare ricchi di leucina N-terminale, un motivo riconosciuto dall'esportazione della proteina di esportazione nucleare.⁵⁰L'interazione diretta tra MG53 e p65 era piuttosto debole come unico o principale effetto dirompente di MG53 sull'attivazione di NF-kB. Sebbene MG53 sembri influenzare lo spostamento dinamico nucleocitoplasmatico dei componenti critici di NF-kB, i meccanismi esatti rimangono da determinare.

L'esito critico della renoprotezione mediata da MG53-sembra essere la diminuzione del rimodellamento fibrotico attraverso l'attenuazione dell'infiammazione mediata da NF-kB. La fibrosi renale è un processo complesso che coinvolge la deposizione patologica di varie proteine ​​ECM.51 MG53 sembrava avere chiari effetti sulla fibronectina proteica ECM. La fibronectina è aumentata nei reni UUO carenti di MG53 e diminuita nei topi UUO trattati con MG53. L'espressione di altre proteine ​​ECM in presenza e assenza di MG53 è più difficile da capire. Abbiamo precedentemente dimostrato che rhMG53 regola negativamente la segnalazione di TGF-b1/Smad e sopprime la sintesi delle proteine ​​ECM in uno studio in vitro.31 In vivo, le trascrizioni di TGF b1, PAI-1 e Col1a1 non sono aumentate nei reni UUO da mg53 / animali carenti. Queste trascrizioni sono diminuite negli animali UUO indotti a sovraesprimere MG53 attraverso la somministrazione di topi viralmente indotti

macrofagi, ma quando è stato somministrato MG53 ricombinante, non è stato osservato alcun effetto. Questo potrebbe semplicemente essere un caso di dosaggio sufficiente perché i livelli intrarenali di MG53 raggiunti erano molto maggiori negli animali dato il vettore dei macrofagi rispetto all'MG53 ricombinante. Inoltre, i livelli proteici non sono stati misurati e gli eventi post-trascrizionali potrebbero modificare l'ECM in UUO. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire il ruolo emergente di MG53 nella modulazione di specifiche proteine ​​ECM. In conclusione, questo studio ha dimostrato che una miochina può aiutare a regolare l'infiammazione di base in un organo remoto come il rene e, nel contesto di una lesione renale, può aiutare ad attenuare e controllare l'infiammazione. La Figura 8 presenta un modello di lavoro del ruolo di MG53 nella renoprotezione. Durante la stimolazione dei pattern molecolari associati al danno (DAMP, come TNF-a) e dei pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP, come LPS) e lo stress ischemico, il signalosoma NF-kB viene attivato nel rene. MG53 protegge il rene inibendo la fosforilazione e l'attivazione della segnalazione di NF-kB, stabilizzando IkBa e riducendo la mobilizzazione nucleare di p65, bloccando l'attivazione di programmi pro-infiammatori. Sebbene l'MG53 endogeno possa mediare questi effetti, suggeriamo che si possa offrire una protezione più solida utilizzando MG53 terapeuticamente, il che è fattibile in base alla capacità dell'MG53 esogeno di ridurre il danno nell'UUO. Sono necessarie ulteriori indagini per capire come questa miochina possa essere sfruttata clinicamente.

beneficio della cistanche: protegge il fegato e l'antifibrosi

CHIARIMENTI

JM ha una partecipazione in TRIM-edicine, Inc., che sviluppa rhMG53 per il trattamento delle malattie umane. I brevetti sull'uso di MG53 sono detenuti dalla Rutgers University e dalla Ohio State University. Tutti gli altri autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

RINGRAZIAMENTI

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR e P-HL) e NIH R01-AG062896 (P-HL e BHR). Questo progetto è stato anche in parte sostenuto da un fondo intramuralLockwood della Ohio State University (P-HL) e da un premio del National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS; P-HL, numero premio UL1TR002733). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di NCATS o NIH.

CONTRIBUTI D'AUTOREHL,

PD, P-HL, JM e BHR hanno ideato e/o progettato gli studi; HL, PD, P-HL, ZL e XZ hanno condotto gli esperimenti, acquisito dati ed eseguito analisi dei dati; PD, P-HL e BHR hanno interpretato i risultati; e P-HL e BHR hanno redatto, rivisto e approvato il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale.

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File Supplementare (PDF) Metodi Supplementari.

Tabella S1.Sequenze di primer. Figura S1. mg53-/- i topi mostrano una maggiore deposizione di proteine ​​ECM. I tessuti renali di pari età (10 mesi) wild-type (WT) e mg53- /- sono stati colorati con 40 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; blu, pannelli di sinistra), a- actina muscolare liscia (SMA; verde, secondo pannello), fibronectina (rosso, terzo pannello) e fusa (pannello di destra). Barra ¼ 25 mm. Quantificazione dell'area di fibrosi renale (n ¼ 3 per gruppo). I dati sono presentati come mezzi -SD. T-test di studente. ***P <>

Figura S2.Distribuzione del muscolo scheletrico MG53 tra nucleo e citoplasma. Muscolo scheletrico derivato da topi wild-type (WT) ormg53-/- sono stati frazionati e immunoblotting con un anticorpo anti-MG53 personalizzato (3 mg di lisati) e marcatori del compartimento cellulare (20 mg di lisati). Le adenosina trifosfatasi sodio-potassio sono utilizzate come marcatore della membrana cellulare, l'istone H3 come marcatore nucleare e la tubulina come marcatore del citosol.

Figura S3.Le cellule del tubulo prossimale del rene HKC-8 assorbono specificamente rhMG53 marcato con AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimedicine) e albumina di siero bovino (BSA; ThermoFisher Scientific) sono stati etichettati con kit di etichettatura degli anticorpi Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) secondo il protocollo del produttore. Le cellule HKC-8 sono state coltivate su un piatto con fondo in vetro Delta TPG (Bioptechs Inc.) nel mezzo di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale (FBS) in presenza di proteine ​​marcate, BSA-AF647 (a sinistra ) e rhMG53-AF647 (a destra), per 24 ore. Le immagini Z-stack sono state prese da un microscopio confocale LSM780 (Zeiss). Le immagini mostrano le celle sul fondo dei piatti. Barra ¼ 25 mm.

Figura S4.Ingegneria delle cellule RAW per mediare la secrezione inducibile di MG53. (A) Le cellule RAW sono state infettate con Ad-tPA-MG53 per 24 ore e trattate senza (doxiciclina [Dox]) o con Dox (þDox, 1 mg/ml) per altre 24 ore per indurre l'espressione di tPA-MG53. Le immagini confocali hanno mostrato l'induzione dell'espressione di MG53 (anticorpo anti-MG53 personalizzato, rosso, pannelli inferiori) da cellule RAW simili a macrofagi (colorazione F4/80, verde, pannelli superiori). Barre ¼ 25 mm. (B, C) Analisi Western blot dei lisati cellulari (nella quantità di 0.6, 3 e 6 mg) per l'espressione indotta di tPA-MG53 e MG53 da cellule RAW infette (B) e la coltura corrispondente concentrati di media (in volumi da 2, 5 e 10ml) (C). Come standard sono state caricate varie quantità di rhMG53 (nella quantità di 0,2, 1, 0,05 e 0,025 ng). Mw, marcatori di peso molecolare.