L'inibitore della chinasi LRRK2 ringiovanisce la senescenza cellulare indotta da stress ossidativo nelle cellule neuronali, parte 1

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Sfondo.La chinasi ripetuta ricca di leucina 2(LRRK2) svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi del morbo di Parkinson (PD). L'invecchiamento è il fattore di rischio più critico per la progressione del PD. È stata stabilita la correlazione tra invecchiamento e senescenza cellulare. La senescenza cellulare è correlata alla disregolazione della via proteolitica e alla disfunzione mitocondriale, che sono anche associate all'aggregazione della -sinucleina ( -syn). Metodi. Le cellule simili a neuroni dopaminergici umani (cellule SH-SY5Y differenziate) sono state trattate con rotenone in presenza o assenza dell'inibitore della chinasi LRRK2 GSK2578215A(GSK-KI) per 48 h. I marcatori della senescenza cellulare, inclusi p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galattosidasi(-gal), fosforilazione di Rb, attività -gal associata alla senescenza (SA) elisosomialeattività, sono stati esaminati. Le cellule dash e i neuroni corticali primari del ratto sono stati trattati con fibrille -syn 30 minuti prima del trattamento con rotenone in presenza o assenza di GSK-KI per 48 ore. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con rotenone e MLi-2 (inibitore della chinasi LRRK2) una volta ogni due giorni per due settimane. Risultati. Il rotenone ha sovraregolato la fosforilazione di LRRK2 e i livelli di -gal attraverso l'attivazione dell'asse di segnalazione p53-p21 e la fosforilazione di Rb sottoregolata. Inoltre, il rotenone ha sovraregolato l'attività SA-gal, i livelli di specie reattive dell'ossigeno e LRRK2fosforilazionee inibito l'attività del lisosoma. La sovraregolazione di LRRK2 indotta da rotenone ha alterato la clearance delle fibrille a-syn. Il trattamento con l'inibitore di LRRK2 ha attenuato la senescenza cellulare indotta da rotenone e l'accumulo di -syn. Conclusioni. L'upregulation indotta da rotenone dell'attività della chinasi LRRK2 ha promosso la senescenza cellulare, che ha migliorato l'accumulo di -syn. Tuttavia, la somministrazione di un inibitore della chinasi LRRK2 ha ringiovanito la senescenza cellulare indotta dal rotenone.

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1. Introduzione

La malattia di Parkinson (PD), che è la malattia neurodegenerativa più comune, è caratterizzata da un alterato controllo motorio[1]. Diversi fattori genetici e ambientali contribuiscono alla patogenesi del PD[2-5].LRRK2, un importante fattore di rischio genetico per il PD, mostra attività sia GTPasi che chinasi [6]. Il mutante LRRK2 G2019S, che mostra una maggiore attività della chinasi, promuove la progressione del PD [7]. Il rischio di sviluppare PD nei pazienti che ospitano il mutante G2019S aumenta con l'età [8] poiché l'invecchiamento è associato alla progressione delle malattie neurodegenerative [9]. In precedenza, avevamo riportato che l'attività della chinasi LRRK2 promuoveva la senescenza cellulare e inibiva la degradazione degli aggregati di alfa-sinucleina (-syn) [10]. -Syn è un componente importante dei corpi di Lewy (LB) o dei neuriti di Lewy, che sono i marcatori post mortem del PD. La degradazione alterata di -syn provoca la sua aggregazione [11].

La senescenza cellulare compromette il meccanismo di degradazione delle proteine[12-14]. L'esposizione a basse dosi di rotenone, che è segnalato per indurre PD, promuove la senescenza cellulare nella linea cellulare trabecolare umana [15]. Inoltre, il rotenone sovraregola l'attività della chinasi LRRK2 nei neuroni [16]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il rotenone promuova la senescenza cellulare attraverso l'attivazione della chinasi LRRK2 e di conseguenza migliora l'aggregazione -syn.

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2. Metodi e materiali

2.1. Coltura cellulare e trattamento.

La linea cellulare di neuroblastoma umano (cellule SH-SY5Y) è stata coltivata in un mezzo di crescita (mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) integrato con 1{{ 48}} percento di siero bovino fetale (FBS, 35-010- CV, Corning cellgro), 1 percento di penicillina/streptomicina (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) e 1 percento di reagente per la rimozione del micoplasma (KOMA)) a 37 gradi in un'incubatrice al 5% di CO (Thermo Fisher Scientific). Le cellule differenziate SH-SY5Y (cellule dSH) sono state ottenute dopo il trattamento con 10μM di acido all-trans retinoico (R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) preparato in un mezzo di crescita una volta ogni due giorni per sette giorni. Il giorno 7 dopo il trattamento con acido retinoide, le cellule sono state trattate con rotenone (1 uM) e GSK2572815A（GSK-KI; Inibitore della chinasi LRRK2; 1μM) preparato in un mezzo di crescita per 48 h. Il dimetilsolfossido (DMSO) è stato utilizzato come veicolo per rotenone e GSK-KI. Le fibrille -syn sono state purificate come descritto in precedenza [10]. Le cellule trattate con rotenone e GSK-KI sono state trattate con fibrille a-syn (70 nM). I neuroni corticali primari del ratto sono stati trattati con rotenone （1μM）, GSK-KI（l μM） e fibrilla a-syn (70nM) per 48 ore. Le condizioni di trattamento per i neuroni corticali primari del ratto erano identiche a quelle impiegate per il dSH. Le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata e lisate in tampone campione 1x (Tris-HCl 50 mM (pH6.8), 2% di dodecil solfato di sodio, 10% di glicerolo, 1% di mercaptoetanolo e 0,02 percentuale di blu di bromofenolo).

2.2. Isolamento e coltura di neuroni corticali primari da embrioni di ratto E16.

I ratti in gravidanza sono stati soppressi con CO, gas. L'utero è stato sezionato e i feti dei sacchi embrionali sono stati collocati in HBSS-/- ghiacciato (14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Il cranio è stato sbucciato usando una pinza e le cortecce sono state sezionate dall'intero cervello. Dopo la rimozione delle meningi, le cortecce sono state incubate con 0,25% di tripsina-EDTA(25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) a 37°C per 20min in un bagnomaria. Successivamente, le cortecce sono state incubate con 40 ug/mL di DNasi I (DN25, Sigma-Aldrich), agitate delicatamente su vortice e incubate per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi. La maggior parte del supernatante è stata rimossa mediante aspirazione e i campioni sono stati incubati con un MEM contenente un inibitore del siero (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5 percento di DMEM, 5 percento di FBS, 2,5 mg/mL di albumina di siero bovino (BSA; A7906, Sigma-Aldrich) e 2,5 mg/mL di inibitore della tripsina (T9253, Sigma-Aldrich). L'inibitore del siero è stato rimosso e il pellet cellulare è stato risospeso a 10 volte il suo volume con il mezzo di crescita. La composizione del mezzo di crescita era la seguente: mezzo neurobasale(21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific),2% B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) e 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Le cellule dei neuroni corticali primari di ratto isolate (3 × 10 gradi/pozzetto) sono state seminate in una 12- piastra a pozzetti (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Corea del Sud) e coltivate nel mezzo di crescita a 37 gradi in un 5 percentuale di CO, incubatrice per 24 ore. Il mezzo di coltura è stato sostituito con un mezzo di coltura integrato con 0,2 mg/mL di 5-fluoro-2'-deossiuridina (F0503, Sigma-Aldrich) e 96 ug/mL di uridina (U3750, Sigma-Aldrich) per inibire la mitosi. Il giorno 6, le cellule sono state trattate con rotenone 1uM, GSK-KI 1uM e fibrille sincroniche 70 nM per 48 ore e raccolte con tampone campione lx.

2.3. macchia occidentale.

Il western blotting è stato eseguito come descritto in precedenza [17]. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per il western blotting: coniglio anti-LRRK2 fosfo-S935 monoclonale (ab133450, Abcam, Cambridge, Regno Unito), coniglio anti-LRRK2 fosfo-S1292 monoclonale (ab203181, Abcam), topo anti-LRRK2 monoclonale ( N241A/34, Neu-roMab,UC Davis, CA, USA), monoclonale anti-p53 murino (per p53 umano:sc-126; per topo p53:sc-393031;Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mouse anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoclonale (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), mouse anti-Rb monoclonale (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA , USA), anti-fosfoRb(Ser807/811)(#9308S, CST), anti{36}}galattosidasi monoclonale di topo (sc-377257, Santa Cruz Biotech-nology), anti-p62 monoclonale di topo(ab56416 ,Abcam), topo anti{42}}actina monoclonale(sc-47778; Santa Cruz Bio-technology), coniglio anti-LC3B policlonale (#2775S; CST), topo anti{48}}syn (clone 42)monoclonale(610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, USA),antifosfotreonina-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology),anti-LaminB(SC{7}},Santa Cruz Biotech-nology), AffiniPure coniugato con perossidasi di capra anti-mouse IgG(H più L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) e capraconiugato con perossidasiAnticorpi AffiniPure anti-coniglio IgG(H più L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.). I segnali immunoreattivi nella membrana di nitrocellulosa sono stati sviluppati con Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA) e le immagini sono state acquisite con una fotocamera MicroChemi4.2 (Shimadzu, Kyoto, Giappone).

2.4. Saggio di legatura di prossimità (PLA) e immunofluorescenza (IF).

Il PLA è stato eseguito utilizzando Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antibody (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) e l'anticorpo Anti-Rabbit Plus (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule SH-SY5Y seminate in 96-piastre nere (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Austria) sono state differenziate e le cellule differenziate sono state trattate con rotenone e GSK-KI il giorno 7. Le cellule sono stati risciacquati due volte con PBS(DPBS) di Dulbecco ghiacciato, fissati con paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) e risciacquati tre volte con DPBS ghiacciato. Successivamente, le cellule sono state permeabilizzate utilizzando lo 0,1% di Triton X-100 preparato in DPBS. Dopo aver lavato tre volte con DPBS freddo, le cellule sono state incubate con una goccia di soluzione bloccante a 37°C per 1 ora. La soluzione bloccante è stata rimossa e le cellule sono state incubate con anticorpi (50μL) a 37 gradi per 3 ore. La miscela anticorpale era composta da un diluente anticorpale del kit (anticorpi usati per PLA: anticorpo monoclonale anti-LRRK2 di topo (1:20) e anticorpo monoclonale anti-LRRK2 fosfo-S1292 di coniglio (1:20); anticorpo utilizzato per il test IF: anticorpo policlonale anti{41}}gal di pollo (1:400, ab9361, Abcam)). Nel test IF, l'anticorpo è stato aggiunto durante l'intero processo fino alla fase di applicazione del PLA. I campioni sono stati quindi lavati due volte con tampone di lavaggio 1x A per 5 minuti. Per preparare la soluzione della sonda, la sonda Duolink⑧In Situ PLA· Anti-Mouse Minus e Anti-Rabbit Plus sono stati miscelati con il diluente anticorpale (1:5). Per il test IF, alla miscela è stato aggiunto anche l'anticorpo anti{51}}gal (1:400). Le cellule sono state incubate con 50μL della soluzione della sonda a 37°C per 1 ora. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con tampone di lavaggio lx A per 5 minuti. Per il test IF, ligasi(40:1) e anticorpi anti{60}}gal (400:1) sono stati miscelati nel tampone di legatura. Le cellule sono state incubate con la soluzione di legatura (50μL) a 37 gradi per 30 minuti e lavate due volte con tampone di lavaggio lx A per 5 minuti. Per il test IF,polimerasi(1:40) è stato incubato con un anticorpo secondario di capra anti-pollo IgY H più L(Alexa Fluor② 594; ab150172)(1:500) per 100 minuti a 37°C. Le cellule sono state lavate due volte con tampone di lavaggio 1x B per 10 minuti, seguito da un lavaggio con tampone di lavaggio B 0,01x per 1 minuto. Per colorare il nucleo, le cellule sono state incubate con Hoechst 33342 (1:1000; 62249, Thermo Fisher Scientific) preparato in DPBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Le immagini delle cellule nelle 96-piastre nere sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Germania).

2.5.Immunoprecipitazione.

I lisati cellulari delle cellule dSH trattate con rotenone (1 μM) e GSK-KI (1 μM) sono stati preparati utilizzando una soluzione di lisi (PBS, 1% Triton X-100, 1x cocktail di inibitore della proteasi e lx fosfatasi cocktail di inibitori). I lisati sono stati centrifugati a 4,{9}} ge 4 gradi per 5 minuti e il supernatante è stato incubato con l'anticorpo anti-p53 (554293, BD Biosciences) e PierceProtein G Aga-rose (20398, Thermo Fisher Scientific) risospeso nella soluzione di lisi per 12 ore. Le perline sono state lavate due volte con la soluzione di lisi e il complesso perline-proteina è stato denaturato con tampone campione lx.

2.6. Frazionamento nucleare.

La frazione nucleare è stata isolata utilizzando i reagenti di estrazione nucleare e citoplasmatica NE-PERr (78833, Thermo Fisher Scientific), seguendo le istruzioni del produttore.

2.7. Preparazione dell'mRNA e reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR).

L'mRNA è stato isolato da cellule dSH trattate con rotenone/GSK-KI utilizzando il kit RNeasy Plus Mini (74134, QIAGEN, Hilden, Germania). Successivamente, l'mRNA è stato trascritto inversamente in DNA complementare (cDNA) utilizzando il TOPscript cDNA Synthesis Kit (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Repubblica di Corea). Il cDNA è stato sottoposto a qRT-PCR utilizzando TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green con basso ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics). Per la qRT-PCR sono stati utilizzati i seguenti primer: p21,5'-ATG umano AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(avanti)) e 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(indietro); umano p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(avanti) e 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(reverse).qRT-PCR è stata eseguita con il ciclatore qPCR Mic(MIC-4,BioMolecular Systems,Upper Coomera, Australia).

2.8. Misurazione dell'attività della galattosidasi (-Gal) associata alla senescenza (SA), delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dell'attività del lisosoma.

A 30 minuti dal post-trattamento, le cellule dSH vive sono state colorate con 2μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Giappone),5uM 2',7'-diclorofluoresceina diacetato (DCFDA;287810, Calbio-chem, San Diego, CA, USA）,2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e 1μM Hoechst 33342 per l'esame dell'attività di SA-gal, ROS, lisosomi attivi e nucleo, rispettivamente.Le cellule colorate erano montato con ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) e ripreso utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Le immagini a contrasto di interferenza differenziale sono state ottenute utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. 2.9.SA -Gal Activity Assay. L'attività SA -gal è stata esaminata utilizzando un { {21}}kit per il test della senescenza cellulare (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), seguendo le istruzioni del produttore.

2.10.Maneggio del mouse e somministrazione di farmaci.

I topi sono stati manipolati come descritto in precedenza [18] secondo le linee guida del Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026). I topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 16 settimane sono stati iniettati per via intraperitoneale con rotenone (0 0,75 mg/kg di peso corporeo) e MLi-2 (un inibitore della chinasi LRRK2; 1 mg/kg di peso corporeo) una volta ogni due giorni per due settimane.

2.11.Test Rotaod e preparazione del tessuto cerebrale.

Il giorno 14 dopo il trattamento, i topi sono stati posti su un'asta girevole a forma di cilindro. Il tempo necessario per cadere a terra è stato registrato. I dettagli del test rotarod sono descritti altrove [18]. Successivamente, i topi sono stati sottoposti a eutanasia e perfusi per via transcardiaca con HBSS ghiacciato contenente Ca2 e Mg. Il mesencefalo è stato sezionato con micro forbici e pinzette. I tessuti sono stati lisati in PBS contenente l'1% di Triton X-100, 1xXpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) e lx Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (P3200, GenDEPOT). I campioni sono stati omogeneizzati utilizzando un motore cordless Pestle Pellet (Sigma-Aldrich). Il supernatante è stato sottoposto a western blotting, saggio di attività SA-gal e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

2.12.ELISA per Oligomerico -Sin.

In precedenza, avevamo stabilito un sandwich ELISA per l'analisi di oligomeri fibrillari -syn utilizzando un anticorpo che riconosce la conformazione filamentosa degli aggregati -syn [17]. I lisati grezzi del mesencefalo sono stati sottoposti a ELISA e gli aggregati -syn sono stati quantificati utilizzando gli standard di fibrilla -syn.

2.13. Analisi di immagini e dati.

Le intensità del PLA e della colorazione delle cellule vive sono state misurate utilizzando Zen 2012 (Carl Zeiss). La densitometria delle proteine ​​target è stata eseguita utilizzando

FIGURA 1: L'attivazione della chinasi LRRK2 indotta da rotenone promuove la senescenza cellulare nella linea cellulare differenziata del neuroblastoma umano. Analisi Western blotting di cellule dSH trattate con 1 uM di rotenone o 1 uM GSK2578215A(GSK-K), un inibitore della chinasi LRRK2, per 48 ore utilizzando anticorpi contro le proteine ​​bersaglio (a). Le densità delle proteine ​​sono state normalizzate a quelle di -actina (bg).n =3.(h) le cellule dSH trattate con 1 uM di rotenone o 1 uM di GSK-KI per 48 ore sono state sottoposte a saggio di legatura di prossimità (PLA) di phospho-S1292 LRRK2 e IRRK2 totale (PIA-pS1292) e analisi di immunofluorescenza (TF) di -galattosidasi, Nuclei sono stati colorati con Hoechst 33342. I controlli utilizzati nella colorazione PLA e IF hanno rivelato la validità dei risultati (due pannelli a destra). Le intensità di PLA-pS1292(i) e -galattosidasi (j) sono state normalizzate a quelle di 4',{28}}diamidino-2-phenylindole.n{30}}; numero di celle= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokyo, Giappone). Tutti i set di dati sono stati analizzati e rappresentati graficamente utilizzando Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). I ​​dati degli esperimenti eseguiti utilizzando cellule dSH e neuroni corticali primari di ratto sono stati analizzati utilizzando l'analisi a due vie di varianza (ANOVA), seguito dal test post hoc di Bonferroni(n=3). Nel frattempo,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Tutti i dati sono rappresentati come media ± errore standard della media. *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

FIGURA 2: L'inibitore della chinasi LRRK inibisce l'attivazione di p53 nella linea cellulare differenziata di neuroblastoma umano. (a) Sono stati raccolti lisati di cellule intere (20 percento), che sono stati utilizzati come input per l'immunoprecipitazione (IP) e la frazione nucleare. L'analisi ha rivelato che l'input del 20% ha mostrato risultati simili a quelli osservati nella Figura 1. (b, c) I campioni IP sono stati denaturati e sottoposti a western blotting. I livelli di fosforilazione del sito TXR in p53 sono stati normalizzati ai livelli totali di p53. n=3.(de)I livelli totali di p53 nel nucleo sono stati esaminati utilizzando il western blotting. LaminB è stato utilizzato per la normalizzazione dei livelli di p53 nucleare. n=3.(f) I livelli di mRNA di p21 e pl6 nel gruppo di trattamento sono stati normalizzati a quelli del gruppo trattato con veicolo-(dimetilsolfossido-),n =3.

Questo articolo è tratto da Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID articolo 9969842, 16 pagine https://doi.org/10.1155/2021/9969842