L'iperoside attenua l'infiammazione nelle cellule HT22 attraverso la sovraregolazione di SIRT1 alle attività Wnt/ -Catenin e Sonic Hedgehog Pathways Parte 1
Mar 30, 2022
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La neuroinfiammazione gioca un ruolo importante nella patogenesi e nella progressione del neurosviluppo alterato, della perdita dell'udito neurosensoriale e di alcune malattie neurodegenerative. L'iperoside (quercetina-3-O- -D-galattoside) è un composto attivo isolato dalle piante di Hypericum. In questo studio, indaghiamo l'effetto protettivo del perossido sulla neuroinfiammazione e il suo possibile meccanismo molecolare. Il lipopolisaccaride (LPS) e l'iperoside sono stati usati per trattare le cellule HT22. La vitalità cellulare è stata misurata mediante saggio MTT. Il tasso di apoptosi cellulare è stato misurato mediante test di citometria a flusso. I livelli di espressione dell'mRNA di interleuchina-1 (IL-1 ), interleuchina-6(IL-6), interleuchina-8(IL-8), e il fattore di necrosi tumorale- (TNF-a) sono stati determinati mediante reazione a catena quantitativa della trascrizione inversa-polimerasi. I livelli di indici di stress ossidativo superossido dismutasi (SOD), specie reattive dell'ossigeno (ROS), catalasi (CAT), glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA) sono stati misurati dai kit. L'espressione del fattore neurotrofico e la relazione tra l'hyperoside, l'omologo della regolazione 2 dell'informazione sul tipo di accoppiamento silenzioso-1(SIRT1) e Wnt/ -catenina e il riccio sonico sono stati esaminati mediante western blotting. Nelle cellule HT22 indotte da LPS, l'iperoside promuove la sopravvivenza cellulare; allevia il livello di IL-1 , IL-6, IL-8, TNF- , ROS, MDA, Bax e caspase-3; e aumenta l'espressione di CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB e NGF. Inoltre, hvperoside ha sovraregolato l'espressione di SIRT1. Ulteriori indagini meccanicistiche hanno mostrato che l'iperoside ha alleviato l'infiammazione indotta da LPS, lo stress ossidativo e l'apoptosi sovraregolando SIRTl per attivare Wnt/ -catenina e le vie del riccio sonico. Presi insieme, i nostri dati hanno suggerito che l'iperoside agisce come un protettore nella neuroinfiammazione.
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1. Introduzione
La neuroinfiammazione è un'infiammazione cronica del tessuto cerebrale, che svolge un ruolo importante nella patogenesi e nella progressione del neurosviluppo alterato, della perdita dell'udito neurosensoriale e di alcune malattie neurodegenerative[1-5]. Nelle prime fasi del percorso uditivo centrale, la perdita dell'udito indotta dal rumore e la perdita dell'udito conduttiva sono correlate alla neuroinfiammazione [6]. Inoltre, la neuroinfiammazione contribuisce alla morte neuronale e al deterioramento neurologico aumentando la produzione di fattori proinfiammatori e di stress ossidativo[7]. Numerosi studi hanno dimostrato che i neuroni dell'ippocampo sono suscettibili a neuroinfiammatori e causano complicazioni neurologiche [8]. Tuttavia, non esistono ancora agenti o metodi efficaci per ripristinare e prevenire il danno neuronale causato dalla neuroinfiammazione. Pertanto, l'identificazione di agenti candidati protettivi infiammatori efficaci è cruciale.
L'iperoside (quercetina3-O- -D-galattoside) è un composto attivo isolato dalle piante di Hypericum. Ha attività antiossidante e antinfiammatoria, diminuendo il sovraccarico di calcio e inibendo l'apoptosi [9, 10]. Precedenti studi hanno confermato che l'iperoside previene efficacemente le complicanze neurologiche causate dalla neuroinfiammazione. Nel modello di diabete acuto da stress ossidativo e infiammazione indotta da iperglicemia, la somministrazione di iperoside ha prevenuto la disfunzione cognitiva, la neuroinfiammazione e lo stress ossidativo causati dal DM attraverso la via di segnalazione TNF-/NF-Bx/caspasi{9}} [11]. In malattie come il morbo di Parkinson, l'iperoside agisce come agente protettivo attenuando l'attivazione della microglia indotta da LPS [12]. Finora, ci sono pochi studi sull'effetto protettivo dell'iperoside sulla neuroinfiammazione e il meccanismo non è stato completamente chiarito.
Il lipopolisaccaride (LPS) è ampiamente utilizzato per attivare il sistema immunitario innato. Precedenti studi hanno dimostrato che l'LPS viene solitamente utilizzato per preparare modelli di neuroinfiammazione indotti da risposte infiammatorie [13,14]. In questo studio, abbiamo esposto le cellule HT22 a LPS per imitare un modello cellulare di neuroinfiammazione. Contemporaneamente, attraverso questo modello è stato studiato l'effetto protettivo dell'iperoside sulla neuroinfiammazione e il suo possibile meccanismo molecolare. Abbiamo scoperto che l'iperoside protegge le cellule HT22 dall'infiammazione indotta da LPS; lo stress ossidativo e l'apoptosi sono strettamente correlati ai livelli di SIRT1. Ulteriori analisi hanno mostrato che l'iperoside ha alleviato l'infiammazione indotta da LPS, lo stress ossidativo e l'apoptosi sovraregolando SIRT1 per attivare le vie Wnt/-catenina e sonic hedgehog.
2. Materiali e metodi
2.1.Reagenti e farmaci. LPS, iperoside e 3-(4,5- bromuro dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il mezzo Eagle modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) è stato acquistato da Gibco (Carls-bad, USA). 100 U/ml di penicillina e 100 mg/ml di streptomicina sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). LiCl e sonic hedgehog agonist SAg sono stati acquistati da Merck (San Diego, CA, USA). Gli anticorpi primari contro Bcl-2, Bax, caspase-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wnt1, -catenina, Shh, Patch e GAPDH e gli anticorpi secondari sono stati tutti acquistati da Cell Signaling (Boston, MA, STATI UNITI D'AMERICA). 2.2. Colture cellulari e trattamenti. La linea cellulare neuronale murina HT22 è stata acquistata dalla Kunming Cell Bank dell'Accademia cinese delle scienze (Kunming, Cina). Le cellule HT22 sono state seminate a 2 × 104 cellule/pozzetto in una 6- piastra a pozzetti e coltivate nel DMEM con il 10% di siero bovino fetale, 100U/ml di penicillina e 100ug/ml di streptomicina a 37°C in un 5% di CO, umidificato incubatrice. Quando l'HT22 ha raggiunto il 70% di confluenza dopo 24 ore, è stata eseguita la trasfezione cellulare pretrattata con diverse concentrazioni di iperoside e LPS (1 ug/ml).
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2.3.Viabilità cellulare. La vitalità cellulare è stata determinata mediante saggio MTT.
In breve, le cellule HT22 sono state seminate in 24-piastre a pozzetti a una densità di 2 × 104 cellule/ml per 24 ore. Le cellule sono state lasciate morire di fame durante la notte e quindi pretrattate con diverse concentrazioni di iperoside per 24 ore, seguite da incubazione con LPS (1 ug/ml) per altre 24 ore. Il mezzo è stato rinfrescato e incubato con 50ul di MTT (5 mg/ml preparato in soluzione salina tamponata con fosfato) per 4 ore a 37°C. Successivamente, la soluzione è stata rimossa e aggiunto DMSO alle piastre. L'assorbanza a 570 nm è stata misurata utilizzando un lettore di piastre.
2.4.Bloccaggio occidentale.
Il tampone RIPA è stato aggiunto alle cellule HT22 (Invitrogen; USA) per raccogliere la proteina totale; quindi le concentrazioni proteiche sono state determinate valutate utilizzando il metodo BCA (Invitrogen, USA).
I campioni proteici sono stati miscelati con un tampone di caricamento 5x e denaturati all'ebollizione. Le proteine sono state separate dal 15% di SDS-PAGE e trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene. Successivamente, le membrane sono state incubate con anticorpi primari (Bcl-2, Bax, caspase-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -catenin, Shh, Patch e GAPDH) a 4Covernight. Quindi, il giorno successivo, le membrane sono state lavate con PBS e incubate con anticorpi secondari per 1 ora. Infine, le bande proteiche sono state misurate utilizzando il software ImageJ. I dati sono stati raccolti da almeno tre esperimenti indipendenti.
2.5.qRT-PCR. L'RNA totale delle cellule HT22 è stato isolato utilizzando il TRIzol RNA Extraction Kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) e l'RNA totale isolato è stato trascritto inversamente in cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa (Takara, Kyoto, Giappone). Successivamente, SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kyoto, Giappone) è stato utilizzato per eseguire l'amplificazione qRT-PCR. I primer di amplificazione IL-1, I-6 e TNF erano i seguenti:IL-1 ,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3'e 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'e 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{{26} }'e 5'-CGGCGATGCGTGCAGC-3'; e TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'e5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'.L'espressione relativa dell'mRNA è stata analizzata utilizzando il metodo 2-Act.
2.6.Saggio SOD, GSH e MDA. Abbiamo misurato l'attività dei livelli di specie di ossigeno (ROS), catalasi (CAT), superossido dismutasi (SOD), glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA) utilizzando i kit di analisi corrispondenti (Nanjing Jian-cheng Bio Company, Cina).
2.7.Citometria a flusso.
Il test di citometria a flusso è stato utilizzato per misurare il tasso di apoptosi cellulare secondo un precedente rapporto [15]. Le cellule HT22 in ciascun gruppo sono state raccolte e risospese. Le cellule apoptotiche sono state etichettate doppiamente con annessina V-FITC e PI utilizzando un kit di rilevamento dell'apoptosi V-FITC/PI di annessina (Beyotime Biotechnology, Cina) per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, l'intensità di fluorescenza delle cellule è stata quantificata mediante citometria a flusso.
2.8. Analisi statistica.
In questo studio, la differenza tra due gruppi è stata confrontata utilizzando un t-test e quella tra i gruppi è stata analizzata mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Tutti i dati sono stati presentati come valori medi±
figura 1: L'iperoside ha alleviato l'apoptosi e l'infiammazione nelle cellule HT22 indotte da LPS. La vitalità cellulare HT22 è stata misurata mediante il test MTT. La vitalità cellulare è stata osservata al microscopio (100x)(a, b). L'espressione di Bcl-2, Bax e caspase-3 nelle cellule HT22 è stata misurata mediante western blotting(c). Il tasso di apoptosi delle cellule HT22 è stato misurato mediante saggio di citometria a flusso (d). I livelli di IL-1 ,IL{10}}. IL-8 e TNF-mRNA nelle cellule HT22 sono stati misurati mediante art-PCR(e);* è stato considerato significativo rispetto al controllo (*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>
Questo articolo è estratto da Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, ID articolo 8706400, 10 pagine https://doi.org/10.1155/2021/8706400
