La deplezione dei macrofagi riduce la patologia patologica nella glomerulonefrite mediata dal complesso immunitario dipendente dal fattore H Ⅱ

3. Risultati

Abbiamo indotto CSS nei topi mediante immunizzazione ripetuta con apoferritina di milza di cavallo. Gli animali generano un sistema immunitario umorale IgG antiapoferritina attivorisposta e depositano IgG nei glomeruli. I nostri studi precedenti hanno rivelato che vi è un aumento di Mϕinfiltrazione nei reniin questa impostazione.

3.1. L'espressione genica dei macrofagi è aumentata nei reni ICGN FH-dipendenti. Per valutare la presenza di Mϕ nei reni ICGN FH-dipendenti, è stata eseguita qRT-PCR con marcatori dei macrofagi M2, CD204 (recettore scavenger Mϕ 1) e CD206 (recettore del mannosio Mϕ 1) [21–24]. L'espressione di entrambi i geni nel rene era significativamente sovraregolata in seguito al trattamento con apoferritina nei topi FHKO (Figura 1) indicando unaumento della presenza di macrofagi nel rene.

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3.2. Cambiamenti nel decorso temporale mediante trattamento con clodronato nell'infiltrazione di macrofagi renali in topi FHKO trattati con apoferritina. Per determinare il metodo efficace per ridurre i Mϕ negli ICGN FH-dipendenti, abbiamo impoverito i Mϕ nei topi fh-/-

Figura 3: dati supplementari. Sono forniti i profili di citometria a flusso dei monociti F4/80+ dei topi di controllo e trattati con clodronato. Le cellule F4/80+ vengono significativamente ridotte raggiungendo meno del 10% mediante il trattamento con clodronato. Ogni punto temporale n=6.

3.4. L'esaurimento dei macrofagi riduce il glomerulo

Patologia nell'ICGN mediato da FH. Alla fine dell'esperimento sono stati valutati i depositi di immunocomplessi nel rene e le caratteristiche istopatologiche dell'ICGN. La colorazione con immunofluorescenza per C3 e IgG ha rivelato che la deplezione di Mϕ non modulava gli immunocomplessi in questo contesto. La colorazione e l'istopatologia rappresentative dell'immunofluorescenza sono mostrate nella Figura 5. La caratteristica istopatologica primaria era l'ipercellularità diffusa dei ciuffi glomerulari nei topi fh-/- con CSS che era significativamente ridotta con l'esaurimento di Mϕs.

3.5. I macrofagi modulano le citochine nell'ICGN FH-dipendente.

Una volta Mϕsinfiltrarsi nel renee sono esposti a stimoli infiammatori, liberano citochine. Abbiamo valutato, mediante ELISA, i livelli plasmatici circolanti di TNF e IL-6 e l'mCSF renale in topi FHKO trattati con soluzione salina, apoferritina o apoferritina e clodronato. I livelli circolanti di IL-6 erano molto bassi nei topi wild-type, aumentavano nei topi FHKO ed erano ridotti nei topi FHKO trattati con clodronato (Figura 6). Le tre citochine, TNF, IL-6 e mCSF erano significativamente aumentate nei topi trattati con apoferritina rispetto ai controlli trattati con soluzione salina. La deplezione di Mϕ da parte del clodronato ha limitato significativamente l’aumento delle citochine in questo contesto

3.6. I macrofagi modulano Profibrotic

Molecole e laminina nell'ICGN FH-dipendente. Una volta chei reni sviluppano una malattia, tendono a diventare fibrotici. I Mϕ partecipano al processo fibrotico producendo in eccesso molecole profibrotiche. La PCR in tempo reale ha rivelato un aumento del 75% nell'espressione dell'mRNA del fattore di crescita trasformante beta1 (TGFbeta1), un aumento del 100% nell'espressione della metalloproteinasi-9 (MMP9) e un aumento del 230% nell'mRNA della laminina. In linea con l'espressione dell'mRNA, l'espressione della proteina laminina è significativamente aumentata nei topi fh-/- con CSS che era ridotta in assenza di Mϕs (Figura 7).

4. Discussione

I nostri studi recenti hanno dimostrato che in assenza di FH, i topi sviluppano una malattia diffusaglomerulonefrite proliferativa(GN) con F4/80+ Mϕ attorno ai siti dei circuiti integrati [10]. Inoltre, i nostri studi dimostrano che i topi Cd11b−/− fh−/− hanno caratteristiche esacerbate della glomerulonefrite [26]. Dato che la presenza di un aumento dei macrofagi infiammatori M1 e la loro attivazione prolungata potrebbero causare patologie tissutali, e la loro ripolarizzazione nel fenotipo antinfiammatorio aiuterebbe nella risoluzione della patologia patologica, l'attuale studio è stato intrapreso per comprendere ulteriormente il ruolo di Mϕs in fh -/- topi con ICGN. L'aumentata presenza di Mϕ nel rene e la risoluzione della patologia della malattia mediante deplezione dei macrofagi durante l'ICGN mediato da FH dimostrano il ruolo critico dei Mϕ in questo contesto e, pertanto, potrebbero fungere da importanti bersagli terapeutici in questo contesto.

Figura 5: La deplezione di Mϕs riduce la patologia glomerulare nell'ICGN dipendente da FH. Vengono fornite immagini rappresentative dei glomeruli di topi carenti di FH trattati con soluzione salina (a), trattati con apoferritina (b) e trattati con apoferritina + clodronato. In (A), le sezioni sono colorate con C3 (verde) e IgG (rosso), mentre (B) mostra sezioni colorate con PAS. I depositi di IgG aumentati con il trattamento con apoferritina sono rimasti invariati, mentre i glomeruli sembravano più vicini alla normalità con la deplezione dei macrofagi.

L'assenza di FH porta ad un aumento della produzione di C5a. C5a si lega a C5aR1 segnalando Mos al rene dove si aggiungono all'ambiente infiammatorio. Inoltre, i nostri studi hanno anche dimostrato che in questo contesto di eccessiva generazione di C5a, l’inattivazione di C5a sembra limitare la malattia [10]. L'attivazione di Mos li fa polarizzare, ma rimangono in uno stato di continuum [27]. I nostri risultati in questo studio mostrano che la malattia glomerulare nei CSS era ridotta nei topi fh−/− in cui i Mϕ erano depleti rispetto ai topi fh-/- senza deplezione dei macrofagi. Pertanto, l’eliminazione dell’ICGN alleviato da Mϕs nei topi fh−/− riduce la patologia della malattia. Tuttavia, i Mϕ sono anche necessari per il processo di riparazione e poiché i Mϕ cambiano stato da pro a stati antinfiammatori e viceversa, sarà il nostro impegno futuro capire se alterare il panorama dei Mϕ senza impoverirli potrebbe alterare la patologia della malattia.

I Mϕ svolgono un ruolo importante nell'inizio e nel mantenimento della fibrosi e sono anche coinvolti nella soppressione, risoluzione e inversione della fibrosi [28]. I nostri risultati mostrano una maggiore espressione dei marcatori CD204+ e CD206+ Mϕ suggerendo la loro maggiore presenza in questo contesto. Poiché questi Mϕ sono un'importante fonte di molecole profibrotiche, i nostri risultati che mostrano un aumento di TGF -1 e di MMP9 suggeriscono che questi Mϕ potrebbero contribuire sia direttamente che indirettamente ai processi fibrotici nell'ICGN mediato da FH attraverso diversi meccanismi ( 1,3,8,44). Il TGF -1 può alterare la fibrosi mediante la regolazione delle citochine. Inoltre, il TGF -1 modula la biosintesi e l'espressione di C3 e del fattore B nei monociti [29], e l'alterazione del complemento nelle cellule immunitarie e nelle cellule renali può facilitare la fibrosi tissutale [30]. Tuttavia, è necessario decifrare le esatte interazioni tra macrofagi e complemento, i meccanismi coinvolti, i loro ruoli e la compartimentazione dei tessuti [31]. I nostri studi hanno mostrato una ridotta espressione di laminina nei topi impoveriti di Mϕs rispetto ai topi con quantità sufficiente di Mϕs. Per comprendere meglio come l'FH regola il processo fibrotico, dobbiamo identificare i sottoinsiemi specifici Mϕ presenti nell'ICGN mediato da FH e chiarire i contributi di ciascuna popolazione di sottoinsiemi. Questi studi sono importanti poiché le terapie complementari sono diventate una realtà clinica. Gli inibitori sono stati e continuano a essere sviluppati contro diversi bersagli nella cascata del complemento che bloccheranno i passaggi a valle del/dei percorso/i di attivazione. Attualmente, uno degli inibitori del complemento in uso clinico è l’anticorpo anti-C5, Eculizumab [32]. Pertanto, identificare i componenti patogeni del complemento nella malattia e integrarli con la regolazione della popolazione Mϕs non è un punto banale.

Figura 7: Deposizione di laminina inReni carenti di FHcon ICGN è ridotto dall’esaurimento di Mϕs. (a) qRT-PCR per TGFB, MMP9 e laminina damRNA del reneisolato da topi dopo 5 settimane di soluzione salina e apoferritina e 3 settimane di clodronato. L'espressione è normalizzata in GAPDH (n=6/gruppo). (b) Microfotografie IF rappresentative per la colorazione della laminina nei reni degli stessi gruppi di topi. ∗P < 0:01.

In sintesi, qui abbiamo studiato il ruolo dei Mϕ nel modello ICGN dipendente da FH. I risultati possono essere applicati anche in contesti di attivazione non regolata del complemento con complessi immunitari come quelli osservati in diverse malattie tra cui la nefrite da lupus, la nefropatia da IgA e la nefropatia membranosa. Mostriamo l'importanza sia della regolazione del complemento da parte di FH che dello stato di Mϕs nella malattia. Pertanto, il targeting farmacologico della cascata del complemento e dello stato Mϕs nella GN mediata da IC ha una potenziale rilevanza clinica.

Riferimenti

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