Profilo dei metaboliti e attività antietà del riso Koji fermentato con Aspergillus Oryzae e Aspergillus Cristatus: uno studio comparativo

Astratto:Risokoji, utilizzato come starter per massimizzare i benefici della fermentazione, produce prodotti finali versatili a seconda dei microbi dell'inoculo utilizzati. Qui, abbiamo eseguito la profilazione del metabolita aconfronta il risokojifermentato con due importanti funghi filamentosi,Aspergillus oryzaeEA. cristato, per 8 giorni. Le analisi multivariate hanno mostrato modelli distinti di metaboliti primari e secondari nei duekoji. Il riso koji fermentato conA. oryze(RAO) ha mostratoè aumentato -attività glucosidasica e maggior contenuto di derivati ​​zuccherini rispetto a quello con cui fermentaA. cristato (RAC). RAC ha mostratomigliorato -attività glucosidasica e aumento del contenuto di flavonoidi elisofosfolipidi, rispetto a RAO. Complessivamente, nella fase finale della fermentazione (8 giorni), ilantiossidanteattività ed effetti anti-invecchiamentoerano più alti in RAC che in RAO, corrispondenti a the aumentatometabolitiad esempioflavonoidie derivati ​​dell'auroglaucina nel RAC. Questa metabolomica comparativaapproccio può essere applicato inottimizzazione della produzionee analisi di controllo qualità dikojiprodotti.

Parole chiave: koji di riso; microbo; fermentazione allo stato solido;effetto antietà; attività antiossidante

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1. Introduzione

La fermentazione, che ha una storia millenaria, viene sempre più riconosciuta come un metodo per migliorare la nutrizione e la bioattività dei prodotti alimentari, oltre che per lavorarli e conservarli [1]. Il koji di riso è prodotto mediante fermentazione allo stato solido utilizzando chicchi di riso al vapore inoculati con microrganismi per secernere enzimi e produrre metaboliti benefici. Negli ultimi anni, vari tentativi di creare condizioni di fermentazione delicate hanno portato a un'efficacia fermentativa avanzata e a una migliore appetibilità del cibo [2,3]. Grazie ai suoi vantaggi, il koji di riso trova applicazioni in settori industriali come cibi e bevande fermentati e cosmetici [4–6].

Specie reattive dell'ossigeno(ROS) sono generati in condizioni of stress ossidativoe sono sottoprodotti del metabolismo aerobico. Questii radicali liberipuò indurre la degradazione delle biomolecole, con conseguenti danni ossidativi, come l'infiammazione e l'accelerazione del processo di invecchiamento cutaneo [7]. Per sviluppare un equilibrio tra produzione ed eliminazione di ROS, gli scavenger di ROS, noti come antiossidanti, svolgono un ruolo importante nell'alleviare lo stress ossidativo e sono principalmente ottenuti da fonti naturali [8]. Questi radicali liberi sono coinvolti nel processo di invecchiamento e eliminarli attraverso l'assunzione di antiossidanti da fonti naturali è fondamentale per ritardare l'invecchiamento [9]. Negli ultimi anni, molti studi hanno riportato che il koji di riso può potenziare le potenziali attività antiossidanti delle materie prime migliorando il substrato di fermentazione [10,11].

La matrice extracellulare della pelle (ECM) è costituita da fibre di collagene ed elastina, che promuovono l'elasticità della pelle per ripristinare e mantenere la sua forma e il suo stato originali [12]. La distruzione dell'ECM dermico è un indicatore dell'invecchiamento. Si verifica a causa della sovraregolazione della metalloproteinasi della matrice che degrada il collagene-1 (MMP-1), nota anche come collagenasi. Pertanto, sono in aumento gli studi su varie sostanze fitochimiche che possono rallentare il processo di invecchiamento della pelle stimolando la sintesi di collagene ed elastina e inibendo l'MMP-1 [13-16]. Seo et al. hanno dimostrato che la crusca di riso fermentata influisce sul collagene dei fibroblasti cutanei, sul fattore infiammatorio (IL-a) e sull'MMP-1 [17]. Quindi, vari composti presenti nel riso, come i flavonoidi e gli acidi fenolici, hanno attività antiossidante e il koji di riso fermentato ha il potenziale per migliorare il fotoinvecchiamento cutaneo mediante radiazioni UV [18]. Aspergillus, un fungo fifilamentoso, è un tipico microbo inoculo per la produzione di molti metaboliti benefici come zuccheri semplici, acidi grassi e amminoacidi dal koji in Asia. In particolare, l'Aspergillus oryzae è il microrganismo più comunemente utilizzato nella produzione di koji a causa della sua sicurezza garantita e di vari enzimi, come amilasi, proteasi e peptidasi [19].

L'Aspergillus cristatus viene utilizzato nella fermentazione del tè, come il tè al mattone Fuzhuan, che contiene probiotici e protegge dal fotoinvecchiamento indotto dai raggi UVB [20,21]. È stato anche riportato che migliora l'attività antiossidante di varie altre materie prime [22,23]. Attualmente, gli sforzi sono sempre più dedicati al miglioramento della qualità degli starter di fermentazione [4,24]. Precedenti studi hanno mostrato uno studio metabolico comparativo di Aspergillus e Bacillus, ampiamente utilizzato nel riso koji [25]. Tuttavia, vi è una scarsità di informazioni sulle differenze metabolomiche tra gli stessi generi ma diverse specie di funghi. Per selezionare microbi ottimali che possono essere introdotti nel mercato della salute con applicazioni nutraceutiche e cosmeceutiche, è necessaria una comprensione completa del metabolismo dei diversi microbi dell'inoculo confrontando la loro bioattività e metaboliti.

In questo studio, abbiamo profilato i metaboliti del riso koji fermentato con diversi Aspergillus spp. (A. cristatus e A. oryzae) in termini di metabolomica per confrontare il metabolismo dei due funghi fifilamentosi. Abbiamo anche misurato l'attività enzimatica, l'attività antiossidante e l'espressione dell'RNA dei fattori antietà della pelle (collagene, elastina e MMP-1) per confrontare i due koji. Inoltre, abbiamo condotto un'analisi di correlazione per suggerire potenziali metaboliti candidati che contribuiscono all'attività antiossidante e agli effetti anti-invecchiamento della pelle. Un'analisi completa della profilazione dei metaboliti basata sulla SM per confrontare i due inoculi di koji ha stabilito una relazione tra attività enzimatiche, metabolomi e bioattività. Qui presentiamo un modello dello stato metabolico complessivo, correlato alle bioattività dei due diversi inoculi di koji.

2. Risultati

2.1. Profilo metabolico per il riso Koji fermentato con diversi Aspergillus spp.

Diversi metabolomi di campioni di koji di riso inoculati con A. cristatus o A. oryzae sono stati confrontati utilizzando l'analisi multivariata secondo i set di dati GC-MS e LC-MS. Il grafico del punteggio dell'analisi delle componenti principali (PCA) ottenuto da UHPLC–LTQ–Orbitrap MS/MS e GC–TOF–MS ha rivelato una varianza totale del 40,9 percento (PC1, 22,01 percento; PC2, 18,89 percento) e 52,88 percento (PC1, 34,70 percento; PC2, 18,18 percento), rispettivamente (Figura 1A,B). Entrambi i risultati del PCA hanno indicato che il punto di partenza della fermentazione era assemblato, ma di conseguenza distinto da diversi funghi di inoculazione in base a diversi tempi di fermentazione. L'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) ha chiarito modelli statistici uguali alla distribuzione dei metaboliti in PCA (Figura supplementare S1A, B).

Come mostrato nel PCA ottenuto dalle analisi UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS (Figura 1A), vi sono differenze significative nell'ottavo giorno ed entrambi i campioni di otto giorni sono stati sottoposti a un'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS -DA), che ha mostrato una netta separazione dal componente OPLS 1, rappresentando 86.11 percento della varianza nei dati (Figura supplementare S1C). I 31 metaboliti sono stati selezionati dai dati UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS, che è considerato un importante contributo alla discrepanza nei koji di riso dell'ottavo giorno fermentati con due diversi microbi dell'inoculo in base alla loro importanza variabile nei valori di proiezione (VIP > 1 .{{10}}) e valori p (p <0,05) dall'analisi OPLS-DA (tabella supplementare S1). Questi metaboliti includevano 2 acidi carbossilici, 5 acidi fenolici, 7 flavonoidi, 2 acidi grassi a catena lunga, 11 lisofosfolipidi e anc4 idrochinoni. I metaboliti sono stati provvisoriamente identificati confrontando la letteratura pubblicata (peso molecolare, formula molecolare, tempo di ritenzione, modelli di frammenti di massa e assorbanze UV) e i dati di una libreria interna.

Figura 1. Grafico del punteggio dell'analisi dei componenti principali (PCA) dai set di dati (A) UHPLC-LTO-Orbitrap-MS/MS e (B) GC-TOF-MS di riso koi fermentato con Aspergillus cristatus o A. oryzne. (simboli pieni , A. cristatus; simboli vuoti, A. oryzne, O, 0 giorno; , , 2 giorno; V, V, 4 giorno; 6 giorno; , 8 giorno).

2.1.1. Metabolomi temporali per riso Koji con diversi Aspergillus spp. InoculoSecondo Tempo di Fermentazione

Le vie metaboliche del riso koji dipendenti da diversi microbi di inoculazione sono state rappresentate da una mappa termica per visualizzare i modelli di cambiamento del metabolita in accordo con i tempi di fermentazione (Figura 2). Il colore su un gradiente da blu a rosso rappresenta l'abbondanza relativa media normalizzata di ciascun metabolita in ciascuna condizione sperimentale. Le tendenze della maggior parte dei metaboliti nel riso koji fermentato con A. cristatus (RAC) e A. oryzaeRAO) hanno mostrato un andamento gradualmente crescente con il tempo di fermentazione. I metaboliti associati al metabolismo dei carboidrati rappresentavano per lo più un modello crescente ad eccezione di glucosio, xilosio, saccarosio e maltosio, che sono zuccheri. Inoltre, i flavonoidi dell'acido fenolico e il contenuto di idrochinone sono aumentati con il tempo di fermentazione, ad eccezione dell'acido ferulico. Tra gli acidi grassi, la maggior parte dei metaboliti ha mostrato un andamento crescente mentre l'acido pimelico ha mostrato una diminuzione. I lisofosfolipidi presentavano modelli disparati con diversi tempi di fermentazione e funghi di inoculazione.

Figura 2. Schema della via metabolica e relativi livelli di metaboliti nel riso koji fermentato con Aspergillus cristatus o A. oryzae. Il percorso è stato adattato dal database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e modificato. I quadrati colorati rappresentano i cambiamenti di piega (dal blu al rosso) normalizzati dalla media di tutti i valori per ciascun metabolita.

2.1.2. Disparità relativa nel livello di metaboliti discriminanti nel riso Koji fermentato da A. cristatus o A. oryzae

Come mostrato nella Figura 2, i contenuti dei metaboliti primari e secondari hanno mostrato modelli diversi in accordo con diversi funghi di inoculazione. Nel caso del glucosio, che è il centro del metabolismo dei carboidrati, i modelli di A. cristatus koji hanno mostrato una diminuzione, mentre A. one koji ha mostrato modelli decrescenti al punto di fermentazione iniziale, ma è gradualmente aumentato fino al punto di fermentazione finale. Inoltre, gli alcoli di zucchero erano più alti in RAO che in RAC. In particolare, i derivati ​​dell'auroglaucina sono stati migliorati in modo significativo solo in RAC perché sono un composto di pigmento unico prodotto da A. cristatus. Inoltre, la maggior parte dei flavonoidi è risultata significativamente aumentata nel RAC rispetto al RAO, ad eccezione della 3,8-dimetilerbacetina. Tra gli acidi fenolici, l'acido ferulico e l'acido benzoico erano aumentati in entrambi i campioni, ma l'acido diidrossibenzoico, l'acido caffeilchinico e l'acido vanillico erano aumentati solo nel RAC. I lisofosfolipidi sono aumentati nella RAC, ma è stata osservata una tendenza contrastante nella RAO. Gli acidi grassi hanno mostrato modelli maggiori di aumento della RAO rispetto all'AC

2.2. Confronto tra produzione enzimatica e bioattività nel riso Koji fermentato con diversi microrganismi

Per confrontare i fenotipi di RAC e RAO, abbiamo valutato l'attività enzimatica e gli effetti anti-invecchiamento sulle cellule della pelle, l'attività antiossidante, il contenuto totale di flavonoidi (TFC) e il contenuto totale di fenoli (IPC) (Figura 3). La produzione di enzimi di entrambi i koji è aumentata con il tempo di fermentazione, ad eccezione dell'a-amilasi in RAO. È interessante notare che il contenuto di a-glucosidasi era due volte superiore in RAO che in RAC con 10,12 e 3,52 unità rispettivamente; al contrario, il contenuto di B-glucosidasi era quarto più alto in RAC che in RAO con 19.{{20}}5 unità e 5,49 unità rispettivamente in base ai tempi di fermentazione. Il fenotipo funzionale di entrambi i koji (attività antiossidante e fattore anti-invecchiamento della pelle) indicava che il koji di riso con A. cristatus aveva attività antiossidanti più elevate in ABTS, DPPH e FRAP al tempo di fermentazione finale (8 giorni) con 1.{ {24}}5, 0.40, 0.66 TEAC (capacità antiossidante equivalente Trolox) rispettivamente. Inoltre, il contenuto di flavonoidi era più alto in RAC rispetto a RAO con 0,07 NE (equivalente di naringina) e 0,01 NE rispettivamente. Considerando che il contenuto di fenolo totale era più alto in RAO rispetto a RAC con 0,32 EGA (acido gallico equivalente) e 0,28 EGA rispettivamente. I risultati dei fattori antietà cutanei (elastina, collagene e MMP-1) indicavano cappello al termine della fermentazione. Livello di espressione di ACRNA con 7,77 e 13,76 e livello di espressione di RNA MMP -1 relativo inferiore con 2,35 rispetto a B-actina. Nel frattempo, RAO ha mostrato un graduale aumento dell'espressione dell'RNA di elastina e collagene dopo la fermentazione.

Figura 3. Confronto tra produzione enzimatica (A), fattore anti-invecchiamento cutaneo (B) e attività antiossidante, contenuto totale di flavonoidi e contenuto totale di fenoli (IPC) (C) nel koji di riso fermentato con diversi Aspergillus spp. (colore nero, A. cristatus colore bianco, A. oryzne). Le attività enzimatiche sono l'attività dell'a-amilasi, l'attività della B-glucosidasi e l'attività dell'a-glucosidasi (A). Il livello di espressione relativo dell'mRNA viene misurato per quanto segue: collagene (COL1A1), elastina (ELN) e metalloproteinasi di matrice -1 (MMP-1) ​​(B). Le attività antiossidanti rappresentate sono ABTS, DPPH radical scavenging, FRAP, contenuto totale di mavonoidi e contenuto fenolico totale (C). Differenze significative tra i diversi microbi di inoculazione sono state identificate dal t-test (* p < {{10}}.05, ** p <0,01).

Per determinare i metaboliti che potenzialmente hanno contribuito alla bioattività, è stata condotta un'analisi di correlazione tra i metaboliti koji fermentati e le bioattività (Supplement.tary Figura S2). Nel complesso, la mappa del coefficiente di correlazione di Pearson ha mostrato una maggiore correlazione tra RAC e bioattività rispetto a RAO. Nel RAC, acidi organici, flavonoidi, lisofosfolipidi, acidi grassi, idrochinone, derivati ​​dello zucchero hanno mostrato un'elevata correlazione positiva con le bioattività. Per RAO, acidi organici, flavonoidi e acidi grassi e derivati ​​dello zucchero hanno indicato una correlazione positiva con le bioattività. I metaboliti che avevano un valore del coefficiente di correlazione di Pearson superiore a 0.5 sono rappresentati in una mappa di rete (Figura 4)In entrambi i prodotti koji, acidi organici, acidi grassi, flavonoidi e derivati ​​dello zucchero erano potenziali contributori di bioattività . L'espressione dell'RNA dell'elastina era associata ai metaboliti del RAC, mentre l'espressione dell'RNA del collagene era associata ai metaboliti del RAO. Inoltre, TFC ha mostrato una correlazione con RAC. Inoltre, i lisofosfolipidi e l'idrochinone hanno contribuito fortemente all'attività antiossidante del RAC

Figura 4, I metaboliti che hanno un valore del coefficiente di correlazione di Pearson superiore a 0.5 sono rappresentati da una mappa di rete nel riso koji fermentato con (A) Aspergillus cristatus o (B) A. oryzne. I simboli del riquadro rappresentano le bioattività (colore grigio, attività antiossidante TPC e TFC; colore nero, effetto antietà cutaneo sulle cellule) e i simboli colorati indicano i metaboliti (le stesse serie sono state distinte per colore e forma diversa: o, idrochinone: , organico acidi: , acidi grassi, flavonoidi;, lisofosfolipidi; o, zucchero e derivati ​​dello zucchero; sconosciuto).

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