Astratto
Scopo: Questo studio è stato condotto per confermare l'applicabilità di un estratto di erbe miste (MHE) come ancosmetico antietàingrediente studiando il suopelle antietàattività in vitro e in vivo. Metodi: In questo studio, abbiamo preparato MHE utilizzando un'estrazione ad ultrasuoni contenente Forsythiae fructus, Tribuli fructus, sigillo di Salomone, ginseng siberiano, Ponciri Fructus e Ginseng. Abbiamo indagato ileffetto antietà dell'MHE per la pelle nei fibroblasti dermici. ILattività antietàè stato determinato dai livelli di sintesi del collagene di tipo I. I livelli di mRNA della metalloproteinasi della matrice -1 (MMP1) e dell'inibitore tissutale delle metalloproteinasi 1 (TIMP1) sono stati misurati mediante qRT-PCR. I livelli di proteina MMP1 sono stati valutati mediante analisi di blotting. Sono stati eseguiti test clinici sull'umidità, l'elasticità, la consistenza e le rughe della pelle utilizzando cosmetici contenenti l'1% di MHE. Risultati: L'MHE ha indotto la sovraregolazione della sintesi del pro-collagene di tipo I e dell'espressione dell'mRNA di TIMP1. L'MHE ha portato alla sottoregolazione dei livelli di mRNA di MMP1 e dei livelli di proteine. Inoltre, dopo l'applicazione cutanea di cosmetici contenenti l'1% di MHE, l'idratazione, l'elasticità, la consistenza e le zampe di gallina della pelle sono migliorate 4 settimane dopo il trattamento. Conclusione: MHE ha un effetto anti-invecchiamento promuovendo la sintesi del collagene e sopprimendo l'espressione del gene MMP1 in vitro, e ha un effetto di miglioramento della pelle in vivo. Pertanto, l'MHE ha dimostrato di avere valore come ingrediente cosmetico funzionale.
Parole chiave:Cura della pelle, Anti età, Anti rughe, Cosmesi naturale, Erboristeria
Gli integratori a base di erbe Cistanche per ANTI-INVECCHIAMENTO
introduzione
La pelle è un organo che entra in contatto con l'ambiente esterno ed è vitale per la nostra sopravvivenza, fungendo da barriera primariacontro gli attacchi esternicome agenti infettivi e lesioni fisiche; inoltre, svolge diversi importanti ruoli fisiologici (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). Mentre invecchiamo,funzione della pellesi deteriora gradualmente con cambiamenti atrofici dovuti ai raggi ultravioletti (UV), all'inquinamento e allo stress e all'invecchiamento della pelle che si verifica quando il numero di cellule della pelle e lo spessore della pelle diminuiscono (Farage et al., 2013).
Invecchiamento della pellepuò essere suddiviso in invecchiamento endogeno e invecchiamento esogeno. L'invecchiamento endogeno della pelle si verifica naturalmente nel tempo, indipendentemente dalle influenze esterne. Dermo-epidermicola coesione della giunzione (DEJ) si indebolisce e con la differenziazionedei cheratinociti, la formazione dei lipidi diminuisce (Makrantonakiet al., 2007). D'altra parte, l'invecchiamento esogeno è causato dall'esternofattori come raggi UV, raggi infrarossi (IR), fumo, benepolvere e stile di vita. Tra questi, il fotoinvecchiamento è causato dai raggi UVraggi che penetrano nella pelle e danneggiano il collagene e l'elastinanel derma. In questo processo, le fibre elastiche e il collagenele fibre della pelle sono deformate, con conseguente diminuzione dell'elasticitàe cedimento. Il collagene è un componente importante dell'extracellularematrice e ha un ruolo importante nel determinare la funzione dei tessuti.
Tra i vari tipi di collagene, il collagene di tipo 1 rappresenta circa il 75-80 percento del collagene totale (Landau, 2007; Lovell et al., 1987; Mays et al., 1988). Quando la pelle è esposta aRaggi UV per lungo tempo, vengono prodotti radicali liberi. Questi gratuitii radicali stimolano l'espressione della metalloproteinasi di matrice-1(MMP1) che promuove la degradazione del collagene e inibisce il collagenesintesi che riduce l'elasticità della pelle e si traduce in rughe.Pertanto, per prevenire e migliorare le rughe della pelle causate dainvecchiamento, è necessario sviluppare un ingrediente che promuovaproduzione di collagene e inibisce l'espressione e l'attività diMMP1 (Wlascheket al., 2001).
Invecchiamento della pelleè strettamente correlato alla qualità della vita. Poiché la pelle è l'organo più visibile, ci rende consapevoli del processo di invecchiamento (Binic et al., 2013). Sono in corso vari sforzi nei campi della medicina, dei prodotti farmaceutici e dei cosmeticiprevenire e migliorare l'invecchiamento cutaneo. ILsviluppo di ingredienti anti-invecchiamentoè una delle strategie antietà più importanti.
Abbiamo preparato estratti di erbe utilizzando l'estrazione ad ultrasuoni per sviluppare nuovi ingredienti antietà contenenti Forsythiae fructus, Tribuli fructus, sigillo di Salomone, ginseng siberiano, Ponciri fructus e Ginseng.
Sei erbe medicinali sono state selezionate da piante con vari effetti medici e sulla pelle. Forsythiae fructus, il frutto essiccato di Forsythia suspense (famiglia Oleaceae), noto come Lian Qiaoin Cina, è stato registrato per la prima volta in Shennong Bencao Jing, aprestigiosa monografia sulla medicina tradizionale cinese (MTC)(Donet al., 2017). È stato usato come un calore di compensazione eMTC disintossicante per il trattamento di malattie infettive, comenefrite acuta, erisipela e ulcere (Wanget al., 2018). Èampiamente utilizzato nelle cliniche come singolo farmaco o ricetta composta.La moderna farmacologia ha dimostrato di avere una varietà dibioattività, tra cui antinfiammatorie, antibatteriche, antivirale, antiossidante, antitumorale, antidiabetico, antiiperlipidemico,alopecia antiandrogenica, anti-vomito, anti-invecchiamento e anti-attività di obesità e neuroprotettive, epato-protettive eeffetti vasorilassanti (Donget al., 2017). Inoltre, è statoriferito cheFrutto di Forsythiaeha sbiancamento della pelle, anti-dermatite atopica ed effetti anti-invecchiamento. Secondo Taiwandatabase di prescrizioni a livello nazionale,Forsizia fruttoè statoinclusa nella top 10 delle erbe più comunemente usate per trattare l'atopiadermatite (15,9 percento), orticaria (11,49-13,4 percento) e acne (22,3 percento)(Donet al., 2017). Frutto di Forsythiaecontiene saponine,flavonoidi,e alcaloidi e acido oleanolico che ha un utileazione farmacologica. Inoltre, contiene arctigenina ematairesinol. Come ingredienti della pelle fisiologicamente attivi, essisono inibitori della tirosinasi che agiscono sul metabolismo della melaninapercorso indotto da -ormone stimolante i melanociti ( -MSH)e stanno attirando l'attenzione come materiali cosmetici sbiancanti(Yang & Choe, 2011).Tribuli frutti, che è il frutto essiccato diTribulus terrestrisL, è stato segnalato per avere effetti farmacologiciattività di miglioramento della funzione sessuale, prevenzione e curamalattie cardiovascolari e migliorare la neuroprotezione ememoria. Ha anche proprietà antidiabetiche, antinfiammatorie eeffetti antiossidanti (Chhatreet al., 2014). Tribuli fruttil'estratto contiene grandi quantità di diosgenina, tigogeina, variesaponine, ecc. Queste saponine sono i bioattivi più importanticomponenti responsabili di vari effetti biologici comel'effetto afrodisiaco, effetto antiipertensivo e protettivoeffetto contro il danno da ischemia-riperfusione e l'antitumorale,attività antibatteriche e antimicotiche (Chhatreet al., 2014).
Altri ingredienti includono furostanolo e spirostanolo saponine, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, alcaloidi e ammidi. Inoltre, è efficace contro la dermatite atopica nei ratti e ha effetti antinfiammatori (Chhatre et al., 2014). È stato riportato che l'effetto antietà dell'estratto di Tribuli fructus aumenta la produzione di pro-collagene di tipo I ed elastina nelle cellule HS68, promuove l'accumulo di lipidi degli adipociti e, in ultima analisi, migliora le rughe e l'elasticità della pelle (Kim et al., 2016 ). Il ginseng siberiano (Acanthopanax senticosus) è un arbusto deciduo appartenente alla famiglia Oga insieme al ginseng e al ginseng selvatico. Il ginseng siberiano ha molte somiglianze con il ginseng ed è usato come medicinale a base di erbe per ictus, ipertensione e diabete. L'estratto di ginseng siberiano è stato a lungo utilizzato nella medicina orientale, e fino a poco tempo fa sono stati riportati risultati farmacologici e fisiologici in vari studi. I componenti del ginseng siberiano che sono stati finora identificati includono i lati eleuterococco A, B, C, D, E, I, K, L e M, e sesamina, chiisanoside, acido caffeico, acido clorogenico, campesterolo, vitamine e minerali (Park et al., 2010).
Contiene saponine triterpeniche, lignani, cumarine eflavonoidi, tra i quali i composti fenolici sono considerati i componenti più attivi (Huang et al., 2011). Ci sono molti rapporti sull'efficacia dell'estratto di ginseng siberiano sulla pelle.L'effetto antirughe,effetto antiossidante,sintesi del collagenee sono state segnalate attività inibitorie della collagenasi contro il fotoinvecchiamento (Park et al., 2010). È stato riportato che l'estratto di ginseng siberiano regola la sintesi del collagene di tipo IV, influenzando la capacità proliferativa delle cellule staminali epidermiche e ispessendo l'epidermide (Choi et al., 2016). Il sigillo di Salomone è un rizoma di Polygonatum odoratum (sinonimo: P.officinale) che ha un effetto tonico ed è usato nella medicina orientale per curare l'insufficienza cardiaca e il diabete. Il sigillo di Salomone è anticiclo e antitosse; allevia la tensione cardiaca, è diuretico, energizzante, ipoglicemizzante, sedativo e tonico; è usato per trattare le malattie polmonari, compresa la tubercolosi e i disturbi gastrointestinali (Haroon et al., 2012). Inoltre, è ampiamente utilizzato nel trattamento delle malattie del sangue; ha effetti benefici sui dotti renali e previene capelli grigi, problemi di vista, vertigini e tigna. È un tonico nervino ed è utilizzato nel trattamento del diabete (Haroon et al., 2012). Il sigillo di Salomone ha un alto contenuto di fenoli e attività antiossidante. Gli omoisoflavanoni del sigillo di Salomone inibiscono la formazione di prodotti finali della glicosilazione avanzata. Il sigillo di Salomone ha mostrato una forte attività di regolazione del sistema immunitario intestinale e la capacità di indurre la differenziazione degli osteoclasti e l'apoptosi indotta dalla lectina. Nel caso dell'estratto di foglie di P. odoratum, viene riportata come esempio la funzione cicatrizzante della ferita (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures è il frutto acerbo di Poncirus trifoliata Rafinesque, appartenente alla famiglia delle Rutaceae (Jung et al., 2016). Recentemente sono stati segnalati effetti antinfiammatori e anti-ipersensibilità ed è stato riportato che l'effetto dell'estratto di limo grasso induce l'apoptosi delle cellule tumorali (Lee et al., 2008). Ponciri fructus è noto per essere efficace nel trattamento della dermatite atopica. Attraverso l'applicazione cutanea dell'estratto di Ponciri fructus, sono stati segnalati i suoi effetti contro le dermatiti atopiche, come l'ipercheratosi epidermica, l'edema cutaneo e le citochine. In particolare, sono state riportate diminuzioni significative del prurito, del numero di mastociti, della produzione di IgE e dell'espressione del fattore di crescita nervoso. Gli estratti di Ponciri fructus hanno mostrato un efficace effetto antinfiammatorio contro la dermatite atopica e un'efficacia antipruriginosa regolando i meccanismi immunitari. Inoltre, la somministrazione orale dell'estratto di Ponciri fructus è nota per essere utile per il trattamento e la prevenzione delle malattie allergiche (Hwang et al., 1997). Il ginseng è una medicina erboristica tradizionale ampiamente utilizzata con attività multifunzionali. Il ginseng è stato utilizzato per le sue attività antinfiammatorie, antiossidanti, antitumorali e antietà (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Sono stati condotti molti studi sull'efficacia del ginseng sulla pelle (He et al., 2018). Tra questi, ci sono molti rapporti su saponine e ginsenosidi, che sono ingredienti rappresentativi del ginseng. Le saponine sono composti che si trovano ampiamente nella maggior parte delle piante ed esistono in varie forme. Le saponine possono accelerare varie attività biologiche come l'emolisi e le funzioni antibatteriche, antivirali e antiossidanti. Inoltre, le saponine hanno proprietà antinfiammatorie che possono ridurre il gonfiore e l'infiammazione della pelle. I ginsenosidi aumentano l'interleuchina (IL)-1 , una delle citochine infiammatorie note per promuovere l'angiogenesi e indurre il fattore di crescita e l'accumulo dell'endotelio vascolarenei siti di ustione della pelle nei topi. È stato riportato anche il loro effetto di rimuovere i macrofagi dalle ferite cutanee e promuovere la guarigione delle ferite (Kim et al., 2011).
L'obiettivo di questo studio era di chiarire l'effetto antietà della pelle di un estratto di erbe miste (MHE) in vitro e in vivo.
Metodi
1. Valutazione dell'efficacia in vitro
1) Preparazione del MHE
Frutta secca di Forsythia suspense, frutta secca di Tribulus Terrestris L., Ginseng siberiano (Radice di Acanthopanax senticosus (Eleuthero)), Sigillo di Salomone (Rizoma e radice di Polygonatum Officinale), Frutto del Poncirus Trifoliata Rafinesque, e Ginseng (Panax) sono stati acquistato da un mercato locale. Basato sulla teoria dello "Yin-Yang" e dei "Cinque elementi" della medicina tradizionale cinese (MTC), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. e Poncirus trifoliata Rafinesque corrispondenti a "Yang" e ginseng siberiano, ginseng e sigillo di Salomone corrispondente a "Yin" è stato selezionato. Le sei erbe medicinali sono state nuovamente suddivise nelle caratteristiche corrispondenti ai cinque elementi (legno, fuoco, acqua, Metallo o Oro, e Terra o suolo). Queste erbe medicinali sono state mescolate allo stesso rapporto per l'equilibrio di ciascun elemento, e Poncirus trifoliata e ginseng corrispondenti alla Terra sono stati combinati con gli altri elementi per corrispondere alle proporzioni (Tabella 1). Le sei piante medicinali sono state estratte in etanolo al 30% mediante ultrasuoni (20 kHz, 2 ore). Dopo la concentrazione con un evaporatore rotante, è stato aggiunto il 30% (v/v) di butilenglicole e la soluzione è stata diluita per preparare un estratto contenente l'1% di contenuto solido.
Tabella 1. Composizione di erbe miste
2) Colture cellulari e reagenti
Cellule di fibroblasti primari umani (HDFn) sono state ottenute da PromoCell (prepuzio giovanile di fibroblasti dermici umani normali, C-12300; PromoCell, Germania). Colture cellulari con Dulbeccoglucosio medio alto di Eagle modificato (glucosio alto DMEM, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) contenente il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, SH30084.03, Hyclone) e l'1% di antibioticoagenti antimicotici (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) sono stati coltivati a 37 gradi in un incubatore di CO2 al 5%.
3) Saggio di vitalità cellulare (saggio MTT)
Il test MTT ha misurato la vitalità cellulare e determinato la citotossicità dell'MHE. Le cellule sono state seminate a 5×103 cellule/pozzetto su una 96-pozzetto e coltivate per 24 ore in coltura cellularecondizioni. Quindi, abbiamo scartato il terreno, lavato le cellule con una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), collocato le cellule in un nuovo terreno privo di siero etrattato le cellule con concentrazioni di {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 e 1.00 percento dei campioni e le cellule sono state incubate per 24 e 48 ore. Quindi, abbiamo aggiunto 100 μL di soluzione MTT(0.5 percento , 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil-2H bromuro di tetrazolio) a ciascuno bene e incubate le cellule per altre 2 ore. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, abbiamo aggiunto 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) al 100%, agitato le cellule per 10 minuti e misurato l'assorbanza a 590 nm con un lettore di micropiastre (Epoch 2 microplate reader, BioTek, USA).
4) Misurazione della generazione pro-collagene di tipo I
La concentrazione di pro-collagene di tipo I nel terreno di coltura cellulare è stata misurata utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio (Procollagen tipo I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRaBio, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. Ogni campione è stato analizzato in tre repliche.
5) Misurazione dei livelli di espressione dell'mRNA mediante Quantitativa
Reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT PCR) Le cellule sono state seminate a 1×105 cellule/pozzetto su piastre 6-pozzetti. Le cellule HDFn sono state coltivate per 24 ore; quindi, le cellule sono state sincronizzate con glucosio alto DMEM senza FBS per 24 ore. Il terreno è stato sostituito con terreno privo di siero e trattato con concentrazioni di 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 e 0,75 percento dei campioni per 24 e 48 ore. L'estrazione dell'RNA è stata eseguita con le cellule HDFn utilizzando un kit di estrazione dell'RNA (kit di estrazione dell'RNA universale TaKaRa MiniBEST, 9767A, Takara Bio, USA) e i campioni sono stati purificati seguendo i protocolli del produttore. L'RNA isolato (1 ug) è stato sintetizzato in cDNA utilizzando un kit di reagenti TR (kit di reagenti PrimeScriptTM RT con gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Utilizzando una SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) e una macchina per PCR in tempo reale QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA), il i livelli di espressione genica sono stati standardizzati al gene housekeeping gliceraldeide 3- fosfato deidrogenasi (GAPDH). I primer utilizzati in questo studio sono presentati nella Tabella 2. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato per tre ripetizioni indipendenti. Analisi della curva di fusioneè stato eseguito per ciascun set di primer.
6) Analisi Western blot
I lisati proteici dalle cellule di fibroblasti sono stati estratti con un tampone di lisi (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Giappone). Il metodo Bradford è stato utilizzato per quantificare le proteine.Quantità uguali di proteine sono state miscelate con tampone campione 5X (TLP-102-01, TransLab, Corea) e denaturate a 99 gradi per 10 minuti. Le proteine sono state separate dal 10% di SDS-PAGE a 150 V per 150 minuti e trasferite su membrane PVDF (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Giappone). Le membrane sono state bloccate con lo 0,5% di albumina di siero bovino (BSA, A4503-10G; Sigma) per 1 ora e lavate con soluzione salina tamponata con Tris che includeva Tween-20 (10X TBS con Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Corea) tre volte; le membrane sono state quindi incubate con anticorpi primari contro MMP-1 (Anticorpo anti-MMP1 ricombinante [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -Actin (Anti- -Actina (N-tern) e PA0207 (Abfrontier , Corea) a 4 gradi durante la notte. Dopo il risciacquo, le membrane sono state trattate con anti-rabbit IgG-perossidasi di rafano (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, USA) come anticorpo secondario per 1 ora. Il rilevamento della chemiluminescenza è stato eseguito utilizzando il reagente per il rilevamento del western blotting ECL Prime (GE Healthcare, USA) e il ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Giappone). Per l'analisi quantitativa, le immagini acquisite sono state analizzate con Image software (analizzatore CS 4, società ATTO, Giappone).
7) Analisi statistica
L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism versione 3.03 per Windows (GraphPad Software, USA). I risultati sono presentati come media ± DS di 3 esperimenti. Uno spaiatoÈ stato utilizzato il test t di Student e i valori p<0.05 were considered statistically significant.
2. Valutazione dell'efficacia in vivo
1) Reagenti e prodotti cosmetici
I prodotti di prova erano lozioni per la pelle, creme essenziali e creme per gli occhi; quelle creme contenevano l'1 percento dell'MHE come ingrediente attivo mostrato nella Tabella 3.
2) Partecipanti umani
Tutti i volontari hanno accettato lo scopo e il contenuto del test e hanno firmato i moduli di consenso informato scritto prima di iniziare il test. Non erano autorizzati a utilizzare altri prodotti per la cura della pelle e i prodotti di prova sono stati applicati sul viso nell'ordine pelle-crema per gli occhi (solo sulle zampe di gallina)-crema essenziale-crema lozione. Lo studio è stato condotto secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki e approvato dall'Institutional Review Board of Korea National Institute for Bioethics Policy (#P01-202108-13-001).
3) Test di efficacia
Hanno partecipato a questo studio ventuno soggetti di sesso femminile di età compresa tra 45 e 55 anni (media ±SD 50,81±2.86) con pelle normale. I prodotti di prova sono stati applicati due volte al giorno (mattina e sera) per 4 settimane. I partecipanti hanno visitato il centro di ricerca ogni 2 settimane e i siti di test sono stati misurati in laboratorio, dove la temperatura ambiente e l'umidità relativa sono state mantenute rispettivamente a 22 ± 2 gradi e 50 ± 5%. I partecipanti si sono acclimatati per 20 minuti in laboratorio dopo essersi lavati il viso e sono stati valutati l'idratazione, l'elasticità, la consistenza e le zampe di gallina della pelle. L'idratazione della pelle è stata misurata utilizzando un Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Colonia, Germania); l'elasticità è stata misurata utilizzando un Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Colonia, Germania), e la consistenza e le zampe di gallina sono state misurate utilizzando un DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, francese).
4) Valutazione delle reazioni avverse della pelle
Le reazioni avverse sono state controllate ad ogni visita mediante questionario e osservazione. Nella valutazione, i parametri soggettivi sono stati classificati come prurito, formicolio, solletico, bruciore, bruciore,rigidità e rigidità e i parametri oggettivi sono stati classificati come eritema, edema, squame e papule.
5) Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS®. La significatività statistica delle differenze tra i punti temporali è stata determinata utilizzando l'analisi delle misure ripetute; un valore p<0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Il tasso di variazione ( percentuale ) rispetto al valore di riferimento è stato calcolato come segue:
Tasso di modifica=((dopo il trattamento-baseline)/baseline)×100 percento
