Profilo dei metaboliti e attività antietà del riso Koji fermentato con Aspergillus Oryzae e Aspergillus Cristatus: uno studio comparativo Ⅱ

3. Discussione

Diverse parti del riso, come lolla, crusca, embrione ed endosperma, dalla superficie all'interno, hanno composizioni chimiche diverse (26). In particolare, la crusca di riso ne contiene variacidi fenoliciEflavonoidi, che sono noti per esibireattività antiossidante.Inoltre, la parete cellulare del riso è composta da una struttura di arabinoxilano che include xilosio, arabinosio, acido ferulico e acido ferulico (27).La parete cellulare del riso è generalmente difficile da penetrare e il koji di riso offre il vantaggio di una facile penetrazione del parete cellulare del riso da parte di vari enzimi come proteasi e glucosidasi dei microbi dell'inoculo (24. Pertanto il koii del riso mostralivelli più elevati di attività inibitoria della tirosinasiEattività antiossidantirispetto alle sue materie prime perché contiene preziosi composti arricchiti (28.

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Abbiamo seguito l'approccio metabolomico per il koji di riso fermentato con due diversi funghi filamentosi, che hanno chiarito differenze significative nell'attività enzimatica, nella produzione di metaboliti e nelle bioattività. Le attività di vari enzimi come a-amilasi, &glucosidasi e -glucosidasi prodotte dall'A. cristatus e dall'A. oryzae inoculati sono aumentate con il tempo di fermentazione (Figura 3). Poiché questi enzimi scompongono la struttura dell'arabinoxilano, diversi acidi fenolici sono stati separati dalla parete cellulare del riso in entrambi i campioni, come mostrato nella Figura 2. Questi acidi fenolici sono potenziali antiossidanti che alleviano lo stress ossidativo 291. Pertanto, le attività antiossidanti e il dosaggio del TPC sono aumentati con aumentando il tempo di fermentazione man mano che il contenuto di acido fenolico aumentava (Figure 2 e 4) la crescita di A. cristatus nel riso koji. Oltre a staccarsi dalla parete cellulare del riso, la glucosidasi idrolizza la forma flavonoide glucosidica in una forma agliconica che possiede una maggiore attività antiossidante 30]. L'aumento della forma flavonoide glucoside e della forma aglicone aumenta le attività antiossidanti come ABTS, DPPH FRAP e TFC, che possono influenzare l'attività antiossidante del RAC, come mostrato nella mappa della rete di correlazione (Figura 4). Questo fenomeno è stato osservato anche in uno studio precedente che mostrava la biotrasformazione degli isoflavoni del glucoside in agliconi e l'aumento dei modelli di attività antiossidante in base al tempo di mento nella soia fermentata con. cristato [311.

RAO ha un livello più elevato di attività a-glucosidasica che scinde i legami a-glicosidici e genera automaticamente un contenuto più elevato di glucosio. Oltre al fatto che il glucosio è la principale fonte di carbonio per i funghi, nel RAC il livello di glucosio è diminuito dopo la fermentazione perché è stato utilizzato per la sintesi di metaboliti secondari come i derivati ​​dell'auroglaucina, che sono composti di pigmenti distintivi prodotti da A. cristatus, e non A. .orizne. Precedenti studi hanno riportato che i derivati ​​​​dell'auroglaucina hanno attività nel DPPH e sono assunti come potenziali composti antiossidanti [32]. Inoltre, la parete cellulare del riso collassata potrebbe consentire agli enzimi di penetrare nelle parti più interne del riso [24]. Quindi, sempre più metaboliti potrebbero essere estratti liberamente senza interruzioni dalla parete esterna del riso.

Nella mappa della rete di correlazione tra bioattività e metaboliti sia di RAO che di RAC (Figura 4), le tendenze comuni erano che i flavonoidi, gli acidi organici, i derivati ​​dello zucchero e gli acidi grassi fossero suggeriti come potenziali contributori alle bioattività. I flavonoidi e gli acidi fenolici sono rinomati antiossidanti e hanno molti vantaggi rispetto a varie funzioni. Grazie alla loro capacità di alleviare lo stress ossidativo, vengono utilizzati per migliorare la qualità del cibo e migliorare l'invecchiamento cutaneo [33]. Inoltre, uno studio precedente ha riportato che gli acidi grassi e gli antiossidanti potrebbero creare un effetto sinergico per la prevenzione e la gestione dell'invecchiamento cutaneo [34].

D'altra parte, l'auroglaucina e i derivati ​​​​del lisofosfolipide servono come contributori aggiuntivi ai metaboliti nel RAC [35]. I derivati ​​dell'auroglaucina hanno attività antiossidanti, come affermato sopra, e quindi, assumiamo che abbiano il potenziale per terminare le reazioni a catena dei radicali liberi per alleviare gli stress cutanei. Yaagi et al. hanno dimostrato che i lisofosfolipidi potrebbero mantenere l'idratazione della pelle migliorando l'espressione di fattori associati alla barriera cutanea e alle funzioni di idratazione della pelle [36]. L'idratazione è un fattore vitale per la salute della pelle perché la secchezza induce danni alla pelle che sono caratterizzati da rugosità, pelle squamosa e rughe sottili [37,38]. Stimiamo che l'auroglaucina e i lisofosfolipidi abbiano migliori effetti anti-invecchiamento della pelle nella fase finale della fermentazione in RAC rispetto a RAO. Zhai et al. dimostrato che il tè di mattoni Fuzhuan, che contiene il fungo dominante A. cristatus, può inibire il fotoinvecchiamento tramite l'estinzione dei ROS e l'attivazione delle cascate di segnalazione Nrf2 [21]. Pertanto, presumiamo che RAC offra un potenziale anti-invecchiamento più elevato rispetto a RAO agendo attraverso vie indirette come stabilire migliori condizioni della pelle per un'abbondante idratazione ealleviare lo stress dei radicali liberi.

Nel complesso, riteniamo che gli acidi grassi potenziati, gli acidi fenolici, i flavonoidi, i lisofosfolipidi e gli idrochinoni possano aumentare le attività antiossidanti e migliorare l'espressione dell'RNA di elastina e collagene, nonché sopprimere l'espressione dell'RNA di MMP-1, alla fine di fermentazione. Questi composti hanno mostrato diversi modelli di cambiamento nei metaboliti a seconda del fungo dell'inoculo e hanno influenzato varie bioattività. Questo studio ha chiarito la differenza nel metabolismo complessivo tra diverse specie dello stesso genere Aspergillus utilizzando un approccio metabolomico. Inoltre, diverse attività enzimatiche hanno influenzato la produzione di diversi metaboliti e indotto diverse bioattività in RAO e RAC

4. Materiali e Metodi

4.1. Prodotti chimici e reagenti

4.2. Preparazione ed estrazione del campione

Le muffe koji A. oryzae KCCM 11372 (Korean Culture Center of Microorganism, KCCM; Republic of Korea) e A. cristatus (Aspergillus cristatus Cosmax-GF from Cosmax BTI R&I center; Seongnam, Korea) sono state utilizzate per la fermentazione del riso e inoculate separatamente . Ciascun microrganismo è stato mantenuto su agar estratto di malto (estratto di malto, 20 g; glucosio, 20 g; peptone, 1 g; agar, 20 g/L) a 28 °C. Il bioprocesso delle fasi di fermentazione per la produzione di koji è stato adattato da Lee et al. [11]. I campioni di koji di riso fermentati con A. oryzae e A. cristatus sono stati raccolti ogni 2 giorni (dal giorno 0 al giorno 8) e conservati in condizioni di congelamento profondo (-80 °C) fino a ulteriori analisi. Tutti i campioni sono stati preparati con due repliche biologiche.

Il metodo di estrazione del campione di koji di riso è stato adattato da Lee et al. con lievi modifiche [11]. In breve, i campioni di koji di riso liofilizzato polverizzato (5 g) sono stati estratti aggiungendo l'80 percento di etanolo acquoso (40 mL) e agitando su un agitatore orbitale (200 rpm per 24 ore) a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione dei campioni a 10,000 rpm per 5 min a 4 ◦C, i surnatanti sono stati filtrati con un filtro Millex GP da 0,22 µm (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). Gli estratti dei campioni filtrati sono stati essiccati utilizzando un concentratore a vuoto veloce (Hanil, Seoul, Corea) e il peso secco è stato misurato per valutare la resa di estrazione.

4.3. Analisi GC-TOF-MS

Le fasi di derivatizzazione dei campioni di koji di riso estratti erano descritte da Lee et al. [11]. L'analisi GC-TOF-MS è stata condotta su un sistema GC Agilent 7890A (Santa Clara, CA, USA) con un Pegasus HT TOF-MS (Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA). Il gas di trasporto (elio) è stato utilizzato con un RTx-5MS (30 m di lunghezza × 0,25 mm di diametro interno, J&W Scientific, Folsom, CA, USA) a una portata costante di 1,5 mL/min. Le temperature dell'iniettore e della sorgente ionica sono state mantenute rispettivamente a 250 e 230 °C. La temperatura del forno è stata mantenuta a 75°C per 2 min e poi aumentata a 300°C a 15°C/min, che è stata mantenuta per 3 min. Quindi, 1 µL del campione è stato iniettato con un intervallo di scansione di massa di m/z 50–800. Tutte le analisi dei campioni sono state eseguite con tre repliche analitiche.

4.4. Analisi UHPLC–LTQ–Orbitrap–MS

I campioni di koji di riso estratti sono stati analizzati per i metaboliti secondari utilizzando la spettrometria di massa tandem orbitrap quadrupolare a trappola lineare per cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS) utilizzando i protocolli descritti da Kwon et al. [39]. Ciascun campione è stato separato utilizzando una colonna Phenomenex KINETEX® C18 (100 mm 2,1 mm, dimensione delle particelle di 1,7 m; Torrance, CA, USA). Gli spettri di massa e l'intervallo di array di fotodiodi in entrambe le modalità ioniche positive e negative sono stati sintonizzati rispettivamente per m/z 100-1000 e 200-600 nm.

4.5. Elaborazione dati e analisi statistica

I dati grezzi GC-TOF-MS e UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS sono stati trasformati in formato netCDF (*.cdf) utilizzando rispettivamente il software Leco ChromaTOF e Thermo Xcalibur. I rispettivi file CDF netti (*.cdf) sono stati sottoposti all'elaborazione dei dati mediata da software MetAlign (accessibile il 13 luglio 2021)) utilizzando i protocolli descritti da Lee et al. [11,24]. I dati spettrometrici di massa, che rappresentano la massa di picco adatta (m/z), i tempi di ritenzione (min) e le informazioni sull'area di picco come variabili, sono stati valutati utilizzando il software SIMCA-P plus 12.0 (Umetrics, Umea, Svezia) per l'analisi statistica multivariata. Prima dell'analisi delle componenti principali (PCA), dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) e dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA), i set di dati sono stati trasformati in log e la varianza unitaria è stata ridimensionata per confrontare il riso koji fermentato con diversi funghi. PASW Statistics 18 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per testare differenze significative (p-value di <0.05) mediante analisi della varianza unidirezionale e per calcolare i valori del coefficiente di correlazione per una mappa di correlazione. La mappa della rete di correlazione tra i metaboliti che hanno un valore del coefficiente di correlazione di Pearson superiore a 0,5 e le bioattività è stata costruita con il software Cytoscape (https://www.cytoscape.org/ (accessibile il 13 luglio 2021)). L'identificazione dei metaboliti provvisori è stata effettuata abbinando i pesi molecolari e la composizione molecolare, il tempo di ritenzione, il frammento di massa

modelli e assorbanza dei dati ultravioletti (UV) dalla letteratura e dalla nostra libreria interna

4.6. Determinazione delle attività enzimatiche

I test di attività enzimatica per -amilasi, -glucosidasi e -glucosidasi sono stati eseguiti secondo studi precedenti [25,40,41]. Una quantità di 10 g di ciascun campione di koji di riso è stata estratta in 90 mL di acqua agitando su un agitatore orbitale a 120 pm e 25 ◦C per 1 h. Dopo aver filtrato i campioni, i surnatanti sono stati utilizzati per valutare le attività enzimatiche.

4.7. Determinazione delle attività antiossidanti e del contenuto totale di fenoli e flavonoidi

Per determinare l'attività antiossidante dei campioni di koji di riso, i test ABTS, DPPH, potere antiossidante riducente ferrico (FRAP), contenuto fenolico totale (TPC) e contenuto totale di flavonoidi (TFC) sono stati condotti in triplicato

I saggi ABTS e FRAP sono stati eseguiti utilizzando il metodo descritto da Lee et al. [24]. In breve, la soluzione madre ABTS diluita con acqua distillata per ottenere un'assorbanza finale di 0.7 ± 0.02 a 750 nm (180 µL) è stata aggiunto a ciascun estratto del campione (20 µL) in una 96-piastra a pozzetti. La reazione è stata lasciata avvenire per 6 minuti al buio a temperatura ambiente. L'assorbanza è stata misurata a 750 nm utilizzando uno spettrofotometro. Per il test FRAP, una miscela di tampone acetato 300 mM (pH 3,6), cloruro di ferro (III) 20 mM e soluzione 2,4,6-tripiridil-S-triazina (TPTZ) 10 mM in HCl 40 mM (10:1:1, v/v/v) sono stati preparati. Il campione (10 µL) è stato miscelato con 300 µL di reagente FRAP e incubato a temperatura ambiente per 6 min. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm. Il dosaggio DPPH è stato eseguito seguendo il metodo adattato da Won et al. [42], dove 180 µL della soluzione madre DPPH (0,2 mM in etanolo) sono stati miscelati con 20 µL di koji di riso con due diversi estratti fungini in 96-pozzetti e lasciati reagire per 20 minuti a temperatura ambiente nell'oscurità. L'assorbanza dei radicali liberi mediante DPPH è stata misurata a 515 nm. I risultati di ABTS, FRAP e DPPH sono rappresentati come concentrazione di capacità antiossidante equivalente (TEAC) di Trolox (mM) per milligrammo di koji. Le curve di concentrazione standard variavano da 0,0078 mM a 1 mM TEAC.

Per i saggi TFC e TPC, un metodo utilizzato da Lee et al. [25] è stato seguito. Per il saggio TFC, 20 µL di ciascun campione di koji di riso sono stati miscelati con 20 µL di 1 N NaOH e 180 µL di 90 percento di glicole dietilenico in un 96-pozzetto. Dopo incubazione della miscela per 60 minuti a temperatura ambiente, l'assorbanza è stata misurata a 405 nm. TFC è presentato come la concentrazione equivalente di naringina (NE) (mM) per milligrammo di koji. La curva di concentrazione standard era lineare tra 0,0027 e 0,3445 mM NE. Per l'analisi del saggio TPC, 20 µL di ciascun campione sono stati incubati con 100 µL di reagente Folin-Ciocalteu 0,2 N in 96-pozzetti a temperatura ambiente per 6 minuti. Quindi, alla miscela sono stati aggiunti 80 µL di una soluzione di carbonato di sodio al 7,5% (Na2CO3) e sono stati lasciati reagire per 60 minuti a temperatura ambiente. Infine, l'assorbanza è stata valutata a 750 nm. I risultati sono indicati come concentrazioni di acido gallico equivalente (GE) (mM) per milligrammo di koji in un intervallo di concentrazione standard di 0,0230–2,9391 mM GE.

4.8. Colture cellulari

4.9. Reazione a catena della polimerasi in tempo reale

Per isolare e quantificare l'RNA totale dai pellet cellulari, è stato utilizzato il reagente Trizol e l'analisi è stata eseguita utilizzando uno spettrofotometro. La sintesi del cDNA è stata effettuata in un volume totale di reazione di 20 µL; la miscela di reazione consisteva in 2 µg di RNA totale, oligo (dT) e premix di trascrizione inversa nelle seguenti condizioni di reazione: 45 °C per 45 min, seguiti da 95 °C per 5 min. RT-PCR è stato utilizzato per la quantificazione dell'espressione genica e i risultati sono stati successivamente analizzati utilizzando il software di sistema StepOne PlusTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Le amplificazioni RT-PCR sono state condotte utilizzando SYBR Green PCR Master Mix con ROX premiscelato (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e primer (Bioneer, Daejeon, Corea) in uno strumento ABI 7300 seguendo il protocollo del produttore. Le condizioni di reazione erano le seguenti: inizio a 95 ◦C per 10 min, seguito da condizioni di ciclaggio di 95 ◦C per 15 s, 60 ◦C per 30 s e 72 ◦C per 30 s per 40 cicli. -actina è stata utilizzata come controllo interno.

In conclusione, il koji di riso ha mostrato la produzione di diversi metaboliti e bioattività a seconda delle diverse specie di Aspergillus utilizzate. I livelli superiori diflavonoidie i derivati ​​dell'auroglaucina nel RAC sono risultati più elevatiattività antiossidanteche in RAO. Inoltre, gli effetti sinergici di acidi grassi ecomposti antiossidantitrovati in entrambi i koji sono stati associati con l'espressione dell'RNA delfattore antietà della pelle. Anche i derivati ​​dell'auroglaucina e i lisofosfolipidi trovati nel RAC erano candidati che potevano essere associati aEspressione dell'RNA dei fattori anti-invecchiamento cutanei. Pertanto, anche se il koji di riso viene fermentato utilizzando membri dello stesso genere (Aspergillus), ci sono differenze significative nelle attività enzimatiche e nei metaboliti per le diverse specie e influenzanobioattivitàad esempioantiossidanteEattività antietà. Pertanto, questo studio fornisce una visione completa, nonché la logica per una scelta razionale dei microbi di inoculazione, rispetto a

metabolomica, per migliorare la qualità della produzione commerciale di koji.

Materiali supplementari:I seguenti sono disponibili online all'indirizzo, Figura S1: Il grafico del punteggio PLS-DA (A, B) e il grafico del punteggio OPLS-DA (C) per il risokojifermentato conAspergillus cristatoOA. oryzesono stati ottenuti da UHPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS (A,C) e GC-TOF-MS (B)., Tabella S1: Elenco di metaboliti significativamente distinti dal risokojicon diversoAspergillus spp. durante la fermentazione identificato da UHPLC–LTQ–Orbitrap-MS/MS, Tabella S2: Elenco di metaboliti significativamente distinti dal risokojicon diversoAspergillus spp. durante la fermentazione identificato da GC-TOF-MS, Figura S2: mappa di correlazione delle bioattività (effetto delle cellule della pelle e attività antiossidante) e risokojifermentato conAspergillus cristatoOA. oryzemetaboliti secondo il coefficiente di correlazione di Pearson. Ogni quadrato indica i valori del coefficiente di correlazione di Pearson (r).

Contributi dell'autore:Concettualizzazione, CL e SL; metodologia, HL, SL, SK (Seoyeon Kyung) e JR; convalida, HL, SL e SK (Seoyeon Kyung); analisi formale, HL e SK (Seoyeon Kyung); ricerca, HL e SL; risorse, JR, SK (Seunghyun Kang) e MP; scrittura: preparazione della bozza originale, HL; scrittura: revisione e revisione, HL e SL; visualizzazione, HL; vigilanza, SL e CL; amministrazione del progetto, SK (Seunghyun Kang), MP e CL; finanziamento acquisizione, CL Tutti gli autori hanno letto e accettato quanto pubblicatoversione del manoscritto.

Finanziamento:Questo lavoro è stato sostenuto dal Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) attraverso l'Agricultural Microbiome R&D Program (The Strategic Initiative for Microbiomes in Agriculture and Food), finanziato dal Ministero dell'Agricoltura, dell'Alimentazione e delle aree rurali Affari(MAFRA) (Numero concessione 918011-04-3-HD020). Inoltre, questo lavoro è stato sostenuto dal Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry (IPET) attraverso il programma di sviluppo della tecnologia alimentare ad alto valore aggiunto, finanziato dal Ministero dell'agricoltura, dell'alimentazione e degli affari rurali (MAFRA) (concessione numero 318027-04-3-HD030)

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:I dati presentati in questo studio sono disponibili su richiesta presso ilautore corrispondente

Ringraziamenti:Questa ricerca è stata supportata dal Konkuk University Researcher Fund in2020.

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