Cistanche deserticola è una pianta in via di estinzione utilizzata per la medicina e il cibo. Il nostro scopo è esplorare le differenze nel metabolismo tra le infiorescenze nelle parti non medicinali e gli steli succulenti nelle parti medicinali per rafforzare l'applicazione e lo sviluppo delle parti non medicinali di C. deserticola. Abbiamo eseguito l'analisi metabolomica tramite LC-ESI-MS/MS sulle infiorescenze e sugli steli succulenti di tre ecotipi (terreno salino-alcalino, prateria e terreno sabbioso) di C. deserticola. Sono stati identificati un totale di 391 metaboliti comuni in sei gruppi, di cui isorhamnetin O-hexoside (infiorescenza) e rosinidin O-hexoside (steli succulenti) possono essere utilizzati come marcatori chimici per distinguere steli succulenti e infiorescenze. Confrontando le differenze metaboliche tra i tre ecotipi, abbiamo scoperto che la maggior parte dei diversi metaboliti correlati allo stress salino-alcalino erano flavonoidi. In particolare, abbiamo mappato la via biosintetica dei glicosidi feniletanoidi (PhG) e mostrato le differenze metaboliche nei sei gruppi. Per comprendere meglio i meccanismi farmacodinamici e gli obiettivi di C. deserticola, abbiamo esaminato 88 componenti chimici e 15 potenziali obiettivi di malattia attraverso l'attracco molecolare. I principi attivi di C. deserticola hanno un notevole effetto docking sugli obiettivi delle malattie dell'invecchiamento come l'osteoporosi, le malattie vascolari e l'aterosclerosi. Per esplorare il valore d'uso dell'infiorescenza, abbiamo analizzato l'attracco molecolare dei metaboliti flavonoidi unici nell'infiorescenza con obiettivi di infiammazione. I risultati hanno mostrato che crisoberillo e cinaroside avevano punteggi più alti per gli obiettivi di infiammazione. Questo studio fornisce una base scientifica per la scoperta e l'industrializzazione del valore delle risorse delle parti non medicinali di C. deserticola e la realizzazione dello sviluppo sostenibile di C. deserticola. Fornisce inoltre una nuova strategia per esplorare le indicazioni delle erbe cinesi.

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale è il cistanoside, che ha vari effetti come la promozione della funzione antiossidante, antinfiammatoria e immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, inibendo così la produzione di melanina.

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1. Introduzione

Cistanche deserticola è una pianta commestibile e medicinale che viene spesso chiamata "ginseng del deserto". 1 C. deserticola è stata registrata per la prima volta nella Materia Medica cinese di Shen Nong circa 1800 anni fa ed è stata ampiamente utilizzata come tonico tradizionalmente considerevole in Cina e Giappone per molti anni. I composti che sono stati isolati da C. deserticola sono glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi, lignani, acidi grassi, alditoli, carboidrati e polisaccaridi, tra i quali il PhG è il principale ingrediente attivo.2 La moderna farmacologia mostra che gli estratti di C. deserticola (come i glicosidi feniletanoidi, i polisaccaridi, ecc.) hanno una vasta gamma di funzioni medicinali, specialmente nel migliorare la funzione sessuale, migliorare la memoria, la regolazione immunitaria, la protezione del fegato, l'attività lassativa, l'attività antiossidante, ecc.3-5 Oltre alla sua valore medicinale, C. deserticola ha un valore ecologico per il controllo del deserto grazie alla sua capacità di crescere in ambienti aridi, così come in condizioni di stress salino-alcalino.6 Tuttavia, le fonti selvatiche di C. deserticola sono state considerate in pericolo negli ultimi tempi anni a causa della domanda di mercato in rapida crescita e dello sfruttamento eccessivo. È stato elencato come una delle piante di classe II che necessitano di protezione in Cina.2 Di conseguenza, è urgente sviluppare efficacemente le risorse di C. deserticola e determinare l'ambiente migliore per la crescita di C. deserticola.

Le parti medicinali tradizionali delle piante medicinali sono ampiamente utilizzate, mentre le parti non medicinali vengono spesso scartate. Un gran numero di studi ha dimostrato che alcune parti non medicinali come Salvia miltiorrhiza, Paris polyphylla e Crocus sativus hanno composizioni chimiche ed effetti farmacologici simili alle parti medicinali. La ricerca sulle parti non medicinali favorisce l'espansione delle risorse mediche, in particolare per la protezione delle piante medicinali in via di estinzione.7,8 Qiao et al. hanno utilizzato la tecnologia GC-MS per identificare 40 componenti volatili nell'infiorescenza di C. deserticola.9 Peng et al. hanno utilizzato la trascrittomica e la metabolomica per analizzare in modo completo gli effetti analgesici di diverse parti della citronella.10 Yang et al. isolati tipi di flavonoidi dalle parti aeree di Salvia miltiorrhiza e ne ha studiato l'attività antiossidante.8 La parte medicinale di C. deserticola è un fusto succulento, che causa ogni anno lo scarto di un gran numero di infiorescenze, con conseguente enorme spreco di risorse .

I metaboliti, in quanto prodotti finali di vari processi biochimici catalizzati dagli enzimi, forniscono utili informazioni molecolari per la biochimica degli organismi in un dato momento.11 Il metabolismo è strettamente correlato alla qualità delle piante. I metaboliti primari influenzano la crescita e lo sviluppo delle piante e i metaboliti secondari possono aiutare le piante a resistere allo stress ambientale.12 Pertanto, la tecnologia metabolomica è ampiamente utilizzata nella valutazione della qualità delle piante.13-15 In precedenza abbiamo integrato il trascrittoma e il metaboloma per valutare la qualità dei gambi succulenti di i tre ecotipi di C. deserticola ed esplorare il meccanismo molecolare della variazione di qualità.16 Abbiamo scoperto che l'20 -acetilatteoside può essere utilizzato come marcatore chimico per distinguere tre ecotipi. Wenjing Liu et al. basato su 1 H NMR non mirato alla strategia di metabolomica mirata basata su LC-MS, ha condotto un confronto approfondito del gruppo chimico di quattro specie succulente di Cistanche e ha identificato echinacoside, acetonide, betaina, mannitolo, 6-deossicatalpolo, saccarosio, e l'8- acido epi-organico può essere utilizzato come marcatore chimico per distinguere quattro specie Cistanche.17 Pingping Zou et al. ha applicato la metabolomica basata su 1 H NMR per identificare le parti superiore e inferiore dello stelo di C. deserticola e ha scoperto che i metaboliti primari seriali, in particolare i carboidrati e i metaboliti del ciclo dell'acido tricarbossilico, come molecole primarie che governano la discriminazione.18 HaiLi Qiao et al. dimostrato che nei fiori è stato riscontrato un contenuto più elevato di esteri e aromatici, che sono stati significativamente aumentati rispetto ai composti volatili delle gemme attraverso l'analisi GC-MS dei componenti volatili dell'infiorescenza di C. deserticola. 9 Allo stato attuale, la ricerca sulla variazione qualitativa tra il fusto succulento e l'infiorescenza di C. deserticola dal punto di vista del metabolismo è ancora carente.

Gli studi esistenti hanno utilizzato la simulazione di rete del docking molecolare per esplorare gli obiettivi ei meccanismi della medicina cinese nel trattamento delle malattie.19-21 Jianling Liu et al. ha studiato le combinazioni di farmaci efficaci basate sulla farmacologia del sistema tra i composti di Cistanche tubulosa. Hanno vagliato preliminarmente 61 composti e 43 bersagli correlati alla neuroinfiammazione, di cui il verbascoside e il tubuloside B potrebbero svolgere un ruolo chiave nella neuroprotezione.22 YingQi Li et al. farmacologia di rete integrata e modello zebrafish per studiare i componenti a doppio effetto di Cistanche tubulosa per il trattamento sia dell'osteoporosi che del morbo di Alzheimer.23 I componenti chimici di C. deserticola sono complessi e hanno un'ampia gamma di effetti farmacologici. Tuttavia, i meccanismi terapeutici non sono ancora chiari. È di grande importanza chiarire gli obiettivi della malattia ei meccanismi per l'ulteriore sviluppo di C. deserticola.

In questo studio, abbiamo utilizzato la metabolomica per studiare le differenze metaboliche delle infiorescenze e degli steli succulenti dei tre ecotipi (terreno salino-alcalino, prateria e terreno sabbioso) di C. deserticola e abbiamo confrontato gli ecotipi di terreno erboso e sabbioso con quello salino- ecotipo terrestre alcalino per esplorare la variazione metabolica in C. deserticola che è influenzata dallo stress alcalino del sale. In particolare, abbiamo identificato e analizzato i metaboliti di sei gruppi coinvolti nella biosintesi dei PhG. Abbiamo applicato il docking molecolare per escludere potenziali composti e bersagli e abbiamo disegnato diagrammi di simulazione di rete, nonché analisi di arricchimento GO e KEGG. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sulle differenze metaboliche tra l'infiorescenza e gli steli succulenti dei tre ecotipi di C. deserticola.

2. Materiali e metodi

2.1 Materiali vegetali e raccolta di campioni

Abbiamo raccolto le infiorescenze (il suffisso del numero di serie del campione è "1") e gli steli succulenti (il suffisso del numero di serie del campione è "2") per C. deserticola nella fase di scavo (da aprile a maggio 2017) da tre diversi ecotipi: Lago Ebinur dello Xinjiang (A1 e A2: terreno salino-alcalino), Tula Village dello Xinjiang (B1 e B2: prateria) e Alxa Left Banner della Mongolia Interna (C1 e C2: terreno sabbioso) nella Cina nordoccidentale (Tabella 1 e Fig. 1a) . Gli esemplari del buono sono stati depositati nell'erbario dell'Istituto per lo sviluppo delle piante medicinali presso l'Accademia cinese delle scienze mediche a Pechino, in Cina. I campioni sono stati raccolti sul campo e conservati rapidamente in azoto liquido. Dopo la pulizia con PBS, i tessuti staminali succulenti sono stati tagliati in piccoli pezzi e immediatamente conservati a 80 gradi Celsius nel congelatore fino all'ulteriore lavorazione. 18 campioni (tre repliche biologiche per habitat, due parti di tessuto per campione) sono stati prelevati dalle parti spesse dell'infiorescenza e dai gambi carnosi per l'analisi del metaboloma.

2.2 Estrazione e separazione dei metaboliti

Il campione liofilizzato è stato frantumato utilizzando un mixer mill (MM 400, Retsch) con una perla di zirconia per 1,5 min a 30 Hz. 100 mg di polvere sono stati pesati ed estratti durante la notte a 4 gradi con 1,0 mL di metanolo acquoso al 70%. Dopo la centrifugazione a 10 000 g per 10 minuti, gli estratti sono stati assorbiti prima dell'analisi LC-MS.

Il sistema LC-ESI-MS/MS (UPLC, Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A system) è stato utilizzato per analizzare l'estratto del campione liofilizzato. Le condizioni analitiche erano le seguenti: colonna UPLC, Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (1,8 mm, 2,1 mm×100 mm); solvente, acqua (0.04% di acido acetico): acetonitrile (0.04% di acido acetico); programma gradiente, 100 : 0 v/v a 0 min, 5: 95 v/v a 11,0 min, 5: 95 v/v a 12,0 min, 95: 5 v/v a 12,1 min e 95 : 5 v/v a 15,0 min; portata, 0,40 ml min 1; temperatura, 40 gradi; e volume di iniezione, 2 ml. L'effluente è stato alternativamente collegato a una trappola ionica lineare a triplo quadrupolo ESI (Q TRAP)-MS. In questo esperimento, un campione di controllo qualità è stato preparato mediante miscelazione uniforme; durante l'analisi, i campioni di controllo qualità sono stati analizzati ogni 10 iniezioni per monitorare la stabilità delle condizioni di analisi.24-26

Le scansioni con trappola ionica lineare (LIT) e triplo quadrupolo (QQQ) sono state acquisite su uno spettrometro di massa con trappola ionica lineare a triplo quadrupolo (Q TRAP), sistema API 6500 Q TRAP LC/MS/MS, dotato di un Interfaccia ESI turbo ion-spray, funzionante in modalità ioni positivi e controllata dal software Analyst 1.6 (AB Sciex). I parametri operativi della sorgente ESI erano i seguenti: una sorgente ionica, turbo spray; temperatura sorgente 500 gradi; tensione spray ionico (IS) 5500 V; Ion source gas I (GSI), gas II (GSII), curtain gas (CUR) sono stati impostati rispettivamente a 55, 60 e 25,0 psi; il gas di collisione (CAD) era alto (12 psi). La messa a punto dello strumento e la calibrazione della massa sono state eseguite con soluzioni di glicole polipropilenico da 10 e 100 mmol L 1 in modalità QQQ e LIT, rispettivamente. Le scansioni QQQ sono state acquisite come esperimenti MRM con gas di collisione (azoto) impostato su 5 psi. Il potenziale di declustering (DP) e l'energia di collisione (CE) per le singole transizioni MRM sono state eseguite con ulteriore ottimizzazione. Per ciascun periodo è stato monitorato un insieme specifico di transizioni MRM in base ai metaboliti eluiti in questo periodo.

2.3 Identificazione e quantificazione dei metaboliti

L'analisi qualitativa dei dati MS primari e secondari è stata effettuata confrontando i valori degli ioni precursore (Q1), degli ioni frammento (Q3) (finestre di isolamento (±15 Da), tempo di permanenza (ms) o tempo di ciclo (1 secondo)), tempo di ritenzione (RT) e modelli di frammentazione con quelli ottenuti iniettando standard utilizzando le stesse condizioni se gli standard fossero disponibili o condotti utilizzando un database autocompilato MWDB (NetWare Biological Science and Technology Co., Ltd Wuhan, Cina) e pubblicamente disponibile database dei metaboliti se gli standard non erano disponibili. Durante l'identificazione sono stati eliminati segnali ripetuti di K plus , Na plus , NH4 plus e altre sostanze ad alto peso molecolare. L'analisi quantitativa dei metaboliti era basata sulla modalità MRM. Gli ioni caratteristici di ciascun metabolita sono stati vagliati attraverso lo spettrometro di massa QQQ per ottenere le intensità del segnale. L'integrazione e la correzione dei picchi cromatografici sono state eseguite utilizzando Multi Quant versione 3.0.2 (AB SCIEX, Concord, Ontario, Canada). I corrispondenti contenuti di metaboliti relativi sono stati rappresentati come integrali dell'area del picco cromatografico.

I valori VIP (variabile importante nella proiezione) dei campioni di C. deserticola (tre repliche biologiche) sono stati calcolati dal software SIMCA-P (versione 14.1, Sartorius Stedim Biotech, Ume˚a, Svezia) sulla base dell'analisi delle componenti principali e del minimo parziale ortogonale Analisi discriminante dei quadrati. Impostiamo fold-change $2 o #0.5 e valore VIP $1 come soglia per vagliare i metaboliti significativamente diversi. I dati sui metaboliti sono stati normalizzati, l'analisi della mappa termica del cluster è stata eseguita su tutti i campioni e lo script del programma R è stato utilizzato per disegnare le mappe termiche del cluster.

2.4 Docking molecolare

2.4.1 Raccolta di composti chimici.Attraverso i risultati sperimentali preliminari del nostro gruppo di ricerca e i risultati della ricerca in letteratura, un totale di 127 composti isolati dai gambi succulenti di C. deserticola sono stati raccolti e scaricati dal sito Web di Chemical Book o utilizzati ChemDraw per disegnare la struttura molecolare 2D. Inoltre, abbiamo trovato 4 evita (chrysoberyl, cynaroside, hesperetin e homoeriodictyol) rilevati solo nell'infiorescenza attraverso i risultati del metaboloma. La struttura 2D è stata convertita in una struttura tridimensionale con il software ChemDraw 3D ed è stata eseguita l'ottimizzazione preliminare. Quindi la struttura tridimensionale ottimizzata preliminare è stata verificata dal software Avogadro e un'ulteriore ottimizzazione energetica è stata utilizzata per generare il formato del file composto finale richiesto per il successivo docking molecolare.

2.4.2 Raccolta della raccolta Target.Abbiamo cercato bersagli proteici della malattia attraverso la letteratura e il database STITCH. Abbiamo ottenuto i target genici corrispondenti utilizzando il database Uniport e recuperato l'ID PDB dell'aplotipo proteico e la struttura delle piccole molecole mediante RCSB. Nel determinare il farmaco positivo, abbiamo utilizzato la letteratura e il sito Web di Yaodu per identificare preliminarmente 45 bersagli di malattie correlate che sono stati segnalati, comprese 10 malattie correlate ai gambi succulenti di C. deserticola in letteratura. Queste dieci malattie erano l'aterosclerosi, l'osteoporosi, la demenza senile, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la costipazione cronica, la tachicardia ventricolare da torsione di punta, le malattie vascolari, le lesioni del miocardio e il cancro del retto. Inoltre, abbiamo raccolto 467 obiettivi correlati all'infiammazione e ottenuto 2 obiettivi importanti (6KBA e 7AWC) attraverso lo screening, che sono stati utilizzati per l'analisi dell'attracco molecolare dei flavinoidi specifici dell'infiorescenza.

2.4.3 Simulazione di docking molecolare.Per valutare l'affinità di legame dei composti in C. deserticola con i bersagli candidati, abbiamo eseguito una simulazione di docking molecolare tramite il software QuickVina 2.0, un'utilità open source sviluppata dal gruppo di ricerca Alhossary. Per verificare l'affinità di legame tra i target e i composti, abbiamo calcolato un punteggio di docking tramite QuickVina 2.0. I punteggi di docking che hanno superato quelli dei farmaci positivi (i dati per ogni farmaco positivo possono essere ottenuti dai corrispondenti bersagli in RCSB o in letteratura) hanno indicato una forte affinità di legame tra i bersagli candidati e i composti corrispondenti.27–30 Noi ha utilizzato PyMOL (versione 2.0 Schr¨odinger, LLC) per tracciare i risultati dell'aggancio del composto e del bersaglio.

2.4.4 Costruzione della rete componente-bersaglio-percorso e analisi della funzione GO/KEGGLa costruzione della rete componente-bersaglio-percorso è stata condotta utilizzando il software di visualizzazione della rete Cytoscape. Nelle interazioni di rete, i nodi rappresentano componenti, obiettivi e percorsi, mentre i bordi rappresentano l'interazione reciproca. Abbiamo utilizzato il valore del punteggio dell'attracco molecolare del composto e del gene bersaglio come indicatore del colore della connessione. Più verde è il colore, maggiore è il valore del punteggio. Una rete di interazione proteina-proteina (PPI) associata a bersagli genici è stata costruita e analizzata con STRING.31

Per scoprire ulteriormente le funzioni biologiche all'interno della rete costruita, abbiamo utilizzato il modulo di annotazione funzionale del database DAVID29 per eseguire analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e KEGG sui geni bersaglio.

3. Risultati

3.1 Profili metabolici di C. deserticola

Per ottenere una panoramica dei cambiamenti metabolici dei tre ecotipi C. deserticola infiorescenze e steli succulenti, è stata eseguita un'analisi del metaboloma ampiamente mirata utilizzando LC-ESI-MS/MS. Come mostrato in Fig. 1b, le infiorescenze e gli steli succulenti di C. deserticola di diversi ecotipi hanno mostrato diverse separazioni e la separazione di diversi tessuti era maggiore di quella di diversi ecotipi. E i tre campioni replicati hanno punteggi PC simili, indicando che i metaboliti di C. deserticola hanno mostrato poca separazione tra i campioni replicati. Inoltre, i campioni di controllo qualità (mix) sono raggruppati insieme al centro del grafico dei punteggi PCA. Il diagramma del petalo (Fig. 1c) e il diagramma ribaltato (Fig. 1d) indicavano che c'erano 391 metaboliti comuni nei sei gruppi e il numero di metaboliti rilevati nell'infiorescenza era generalmente superiore a quello nello stelo succulento. Il numero di metaboliti rilevati nell'infiorescenza salino-alcalina (A1) era il più grande, con un totale di 515, di cui 18 metaboliti sono stati rilevati solo in A1. Il numero di metaboliti rilevati negli steli succulenti delle praterie (B2) era il minimo, con un totale di 458, senza i suoi metaboliti unici.

Sono stati determinati i contenuti relativi di 578 metaboliti, incluse 35 categorie di metaboliti (file ESI S1). I metaboliti più abbondanti delle infiorescenze e dei gambi succulenti in entrambi i tre ecotipi erano lipidi, glicerolipidi, amminoacidi, nucleotidi e loro derivati, glicosidi feniletanoidi (PhG) e flavonoidi (Fig. S3a, 3b e c). Dopo la normalizzazione, il contenuto proporzionale di ciascun metabolita è stato determinato dall'area media di risposta del picco durante UPLC-MS/MS, come mostrato in Fig. 1e con una mappa termica, ed è stato ulteriormente eseguito con analisi di clustering gerarchico. Più metaboliti secondari hanno mostrato alti livelli di concentrazione relativa in A1 e C2 rispetto ad altri gruppi. Tra i metaboliti secondari in tutti e tre gli ecotipi, il contenuto relativo di glicosidi feniletanoidi (PhG) negli steli succulenti era superiore a quello delle infiorescenze, mentre il contenuto relativo di flavonoidi nelle infiorescenze era superiore a quello degli steli succulenti.

In questa analisi del metaboloma, sono stati rilevati 12 principali componenti attivi di C. deserticola, tra cui 2′-acetilatteoside, acteoside, cistanoside A, coniferina, echinacoside, formononetin-7-O-glucoside, inosina, isoacteoside, ononin, pinoresinol, siringhe e uridina. È stata disegnata una mappa termica di clustering gerarchico (Fig. 1f) per i principali componenti attivi di C. deserticola rilevati dal metaboloma, mostrando che il contenuto relativo dei principali componenti attivi nello stelo succulento era superiore a quello nell'infiorescenza. Rispetto ai diversi tessuti, i principi attivi con un contenuto relativamente elevato nell'infiorescenza erano 2′-acetilatteoside e coniferina, mentre i principi attivi con un contenuto relativamente elevato negli steli succulenti erano acteoside, cistanoside A, echinacoside e isoacteoside. Rispetto a diversi ecotipi, il contenuto relativamente elevato di principi attivi nel terreno salino-alcalino era 2′-acetilatteoside, acteoside, coniferina, echinacoside e isoacteoside. Il contenuto relativamente alto nelle praterie era di echinacoside e il contenuto relativamente alto nei terreni sabbiosi era di cistanoside A.

3.2 Differenza metabolica tra infiorescenza e fusto succulento di C. deserticola

Per comprendere la differenza nel metabolismo tra infiorescenza e fusto succulento di C. deserticola in tre ecotipi, abbiamo esaminato i diversi metaboliti. È stata osservata un'elevata prevedibilità (Q2) dei modelli OPLS-DA per generare un confronto a coppie tra infiorescenza e fusto succulento in terreno salino-alcalino (Q2 = 0.996), prateria (Q2 = 0.997) , e terreno sabbioso (Q2 = 0.997) (Fig. S1a). I valori Q2 e R2 erano più alti nel test di permutazione rispetto al modello OPLS-DA (figura S1b). Per identificare potenziali variabili, impostiamo fold-change Maggiore o uguale a 2 o Minore o uguale a 0.5 e Valore VIP Maggiore o uguale a 1 come soglia per vagliare i metaboliti significativamente diversi in ogni coppia di confronti. I primi 10 diversi metaboliti delle tre infiorescenze dell'ecotipo e dei gambi succulenti sono stati mostrati nella Tabella S1. Rispetto agli steli succulenti, il contenuto relativamente elevato di metaboliti differenziali nelle infiorescenze erano flavonoidi, come flavonolo, flavone e flavone C-glicosidi.

Nella terra salina-alcalina, rispetto alle infiorescenze, gli steli succulenti avevano 43 metaboliti differenziali up-regolati e 71 metaboliti differenziali down-regolati (Fig. 2a). La mappa termica (Fig. 2b) ha mostrato che il contenuto relativo delle infiorescenze era superiore a quello degli steli succulenti. Confrontando gli steli succulenti con le infiorescenze, i principali metaboliti sovraregolati erano cianidina 3-O-rutinoside (keracyanin), icariina (kaempferol 3,7-O-diglucoside 8-prenil derivato), acido omovanillico , estere metilico dell'acido clorogenico e rosinidina O-esoside. I principali metaboliti differenziali sottoregolati includevano N′, N′′-di-p-coumaroilspermidina, 8-C-esosil-luteolina O-esoside, acido caffeico, isorhamnetina O-esoside e isorhamnetina 5- O-esoside (figura 2c). L'analisi dell'arricchimento della via metabolica KEGG (Fig. 2d) ha classificato i metaboliti differenziali identificati dall'infiorescenza e dallo stelo succulento nella biosintesi dei flavonoidi, nella biosintesi dei flavoni e dei flavonoli, nella biosintesi degli isoflavonoidi, nella biosintesi dei fenilpropanoidi e nel metabolismo dei lipidi dell'etere.

Nei prati, rispetto alle infiorescenze, gli steli succulenti avevano 35 metaboliti differenziali up-regolati e 54 metaboliti differenziali down-regolati (Fig. 2a). La mappa termica (Fig. 2b) ha mostrato che il contenuto relativo delle infiorescenze era superiore a quello degli steli succulenti. Confrontando gli steli succulenti con le infiorescenze, i principali metaboliti sovraregolati erano l-( plus )-arginina, acido adipico, N-metilnicotinammide, acido 4-idrossibenzoico e diidromiricetina. I principali metaboliti differenziali down-regolati includevano rosinidina O-esoside, acido caffeico, isorhamnetin O-esoside, vendita 5- O-esoside e isorhamnetin 5- O-esoside (Fig. 2c). L'analisi dell'arricchimento della via metabolica KEGG (Fig. 2d) ha classificato i metaboliti differenziali identificati dall'infiorescenza e dallo stelo succulento nella biosintesi dei flavonoidi, nella biosintesi dei flavoni e dei flavonoli, nella biosintesi dei diterpeni, nella biosintesi degli isoflavonoidi e nel trascinamento circadiano.

Nella terra sabbiosa, rispetto alle infiorescenze, gli steli succulenti avevano 40 metaboliti differenziali up-regolati e 87 metaboliti differenziali down-regolati (Fig. 2a). La mappa termica (Fig. 2b) ha mostrato che il contenuto relativo delle infiorescenze era superiore a quello degli steli succulenti. Confrontando gli steli succulenti con le infiorescenze, i principali metaboliti sovraregolati erano O-feruloil 4-idrossilcumarina, siringa, rosinidina O-esoside, 3-(4-idrossifenil) acido propionico e acido omovanillico. I principali metaboliti differenziali down-regolati includevano crisoeriolo acido O-ramnosil-O-glucuronico, C-esosil-apigenina O-caffeoilesoside, vendita O-malonilesoside, isorhamnetina O-esoside e 8-C-esosil-luteolina O- esoside (figura 2c). L'analisi dell'arricchimento della via metabolica KEGG (Fig. 2d) ha classificato i metaboliti differenziali identificati dall'infiorescenza e dallo stelo succulento in biosintesi di flavoni e flavonoli, biosintesi di flavonoidi, biosintesi di isoflavonoidi, biosintesi diterpenoidi e degradazione di composti aromatici.

3.3 Differenze metaboliche correlate allo stress salino-alcalino in tre ecotipi di C. deserticola

Per cogliere le caratteristiche metaboliche uniche dei tre ecotipi del terreno salino-alcalino di C. deserticola, abbiamo schermato i diversi metaboliti in terreno salino-alcalino rispetto a prateria e terreno sabbioso rispetto a terreno salino-alcalino. È stata osservata un'elevata prevedibilità (Q2) dei modelli OPLS-DA per generare un confronto a coppie tra terreno salino-alcalino rispetto a prateria di infiorescenza (Q2 = 0.997) e fusto succulento (Q2 = 0.991) . Nel frattempo, alta prevedibilità (Q2) dei modelli OPLS-DA tra terreno sabbioso rispetto a terreno salino-alcalino dell'infiorescenza (Q2 = 0.988) e fusto succulento (Q2 = 0.995). I valori Q2 e R2 erano più alti nel test di permutazione rispetto al modello OPLS-DA (Fig. S2†). Per identificare potenziali variabili, impostiamo fold-change maggiore o uguale a 2 o minore o uguale a 0.5 e valore VIP maggiore o uguale a 1 come soglia per vagliare i metaboliti significativamente diversi in ciascuna coppia di confronti. La tabella 2 mostrava i diversi metaboliti delle infiorescenze e degli steli succulenti correlati allo stress salino-alcalino (terreno salino-alcalino vs. prateria e terreno sabbioso vs. terreno salino-alcalino), ordinati per categoria di metaboliti, e dimostrava che la maggior parte dei metaboliti era la classe dei flavonoidi . Tra questi, il contenuto relativo di antociani, flavonoidi, flavonolo, flavanone, catechina e loro derivati ​​e isoflavoni è il più alto nei terreni salino-alcalini. Inoltre, la heatmap (Fig. 3d) ha mostrato che i gruppi con un contenuto relativo più elevato di metaboliti differenziali dei flavonoidi erano A1 e C1. Il contenuto relativo di antociani era il più alto nel gruppo A2, e il contenuto relativo di flavonoidi e flavonoli era il più alto nel gruppo A1.

Le mappe vulcaniche (Fig. 3a) hanno mostrato che il numero di metabolismo differenziale sovraregolato nei suoli salino-alcalini è superiore a quello dei prati e dei suoli sabbiosi, sia nelle infiorescenze che negli steli succulenti. I primi 20 metaboliti differenziali di ciascun confronto sono stati mostrati in Fig. 3b. Nella terra salina-alcalina rispetto alla prateria, le vie KEGG dei metaboliti differenziali dell'infiorescenza erano principalmente arricchite nella biosintesi dei flavonoidi, flavonolo e biosintesi dei flavonoli, biosintesi dei diterpenoidi, biosintesi degli isoflavonoidi e biosintesi dei fenilpropanoidi. Inoltre, le vie KEGG dei diversi metaboliti dello stelo succulento erano principalmente arricchite nella sinapsi dopaminergica, nel metabolismo delle purine, nella biosintesi dei flavonoidi, nel metabolismo delle pirimidine e nel trascinamento circadiano. Nella terra salina-alcalina rispetto alla prateria, le vie KEGG dei metaboliti differenziali dell'infiorescenza erano principalmente arricchite nella biosintesi degli isoflavonoidi, nella biosintesi dei metaboliti secondari, nella biosintesi dei flavoni e dei flavonoli, negli agenti antineoplastici da prodotti naturali e nell'asma. Inoltre, le vie KEGG dei diversi metaboliti dello stelo succulento erano principalmente arricchite nella biosintesi dell'amminoacil-tRNA, nella digestione e nell'assorbimento delle proteine, nel metabolismo centrale del carbonio nel cancro, nella biosintesi degli amminoacidi e nella biosintesi dei fenilpropanoidi (Fig. 3c).

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