Sistema laccasi-mediatore che utilizza un mediatore naturale come agente sbiancante per la decolorazione della melanina Parte 1

Astratto: In questo studio, è stato sviluppato un sistema mediatore laccasi (LMS) che utilizza un mediatore naturale come agente sbiancante per la decolorazione della melanina. Sono stati utilizzati sette mediatori naturali per sostituire i mediatori sintetici e superare con successo il basso potenziale redox della laccasi e l'accesso limitato della melanina al sito attivo della laccasi. L'attività di decolorazione della melanina delle laccasi da Trametes versicolor (lacT) e Myceliophthora thermophila (lacM) è stata notevolmente migliorata utilizzando mediatori naturali tra cui acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone, che hanno mostrato una bassa citotossicità. I gruppi metossi e chetoni dei mediatori naturali svolgono un ruolo importante nella decolorazione della melanina. Le costanti di specificità di lacT e lacM per la decolorazione della melanina sono state migliorate rispettivamente di 247 e 334, quando l'acetosiringone è stato utilizzato come mediatore. LMS che utilizza pizzo e acetosiringone potrebbe anche decolorare la melanina presente nel film di idrogel di cellulosa, che imita la condizione della pelle. Inoltre, LMS potrebbe decolorare non solo gli analoghi sintetici dell'eumelanina preparati dall'ossidazione della tirosina, ma anche la melanina naturale prodotta dalle cellule di melanoma.

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale ècistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche esbiancamento della pellerisiede nell'effetto antiossidante della cistancheglicosidi. Melaninanella pelle umana è prodotto dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contienecistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, quindiinibendo la produzione di melanina.

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1. Introduzione

Le laccasi (EC 1.10.3.2, benzenediolo: diossigeno ossidoreduttasi) sono proteine ​​multirame che catalizzano l'ossidazione di vari composti fenolici e non fenolici attraverso un meccanismo di reazione catalizzata dai radicali mediante la riduzione dell'ossigeno molecolare [1,2]. Le laccasi sono state utilizzate come biocatalizzatori per processi di biodegradazione, come il biorisanamento di coloranti [3,4], prodotti farmaceutici [5,6], erbicidi [7] e delignificazione [8-10]. Le laccasi sono state utilizzate anche per catalizzare la polimerizzazione di precursori di coloranti e composti organici [11]. In particolare, le loro proprietà attraenti, come la bassa specificità del substrato, l'uso dell'ossigeno come accettore finale di elettroni, la generazione di acqua come sottoprodotto e l'assenza di richiesta (o nessuna produzione) di perossidi, li rendono interessanti in campo biotecnologico e campi ambientali [1,11,12].

Quattro ioni rame nel sito attivo sono coinvolti nell'attività catalitica della laccasi. Il rame "blu" (sito T1) ossida il substrato e il cluster di rame trinucleare (T2/T3) riceve gli elettroni dal sito T1 per ridurre l'ossigeno molecolare [1,12,13]. In particolare, il potenziale redox del sito T1 Cu è considerato un fattore importante nel determinare la capacità catalitica delle laccasi [14]. Le laccasi possiedono un potenziale redox relativamente basso (0.4–0.8 V) rispetto alle perossidasi ligninolitiche (oltre 1 V) come la perossidasi di manganese e la lignina perossidasi. Le laccasi non possono ossidare direttamente substrati non fenolici con un potenziale redox superiore a 1,3 V [13,14]. Pertanto, per superare i limiti della laccasi, i sistemi mediatori della laccasi (LMS) utilizzano piccoli composti molecolari, come il 2,20 -azinobis(3- etilbenztiazolina-6-solfonato) (ABTS), { Sono stati suggeriti {24}}idrossibenzotriazolo (HOBt), acido violurico (VLA), N-idrossiftalimmide (HPI), N-idrossiacetanilide (NHA) e TEMPO, che agiscono come mediatori redox [15-17].

Questi mediatori consentono l'ossidazione di composti voluminosi attraverso diverse vie di ossidazione. Il sistema laccasi-ABTS ossida i substrati generando un radicale cationico ABTS tramite un meccanismo di trasferimento elettronico (ET). Gli LMS con HOBt, VLA, HPI o NHA producono radicali nitrossilici tramite il meccanismo di trasferimento dell'atomo di idrogeno (HAT) [1,12,17]. Inoltre, mediatori come TEMPO ei suoi analoghi reagiscono attraverso percorsi ionici per generare ioni ossoammonio [1,12,18]. L'uso di questi mediatori può ossidare un'ampia gamma di composti in varie applicazioni, come la degradazione dei coloranti [3,4], la degradazione dei farmaci [5,6] e la degradazione della lignina [8-10]. Tuttavia, le applicazioni dei mediatori sintetici nei campi industriali sono state limitate a causa della loro potenziale tossicità, costo elevato ed effetto di inattivazione enzimatica. Recentemente, le molecole fenoliche derivate dalla lignina come mediatori naturali (ad esempio, siringaldeide, acetosiringone, vanillina, acetovanillone, metil vanigliato, acido ferulico, acido sinapico, acido p-cumarico, ecc.) sono state studiate per sostituire i mediatori sintetici [1,12] . I vantaggi dei mediatori naturali sono il basso costo e la bassa tossicità perché ottenuti da fonti naturali e rinnovabili [19].

La melanina è un gruppo di pigmenti naturali prodotti dalla melanogenesi attraverso la polimerizzazione ossidativa della tirosina da parte dei melanociti. La melanina naturale può essere classificata in cinque categorie di eumelanina, feomelanina, tutta la melanina, feomelanina e neuromelanina [20]. Recentemente sono state studiate varie applicazioni mediche ed elettrochimiche che utilizzano melanina o precursori della melanina [20,21]. Il colore della pelle umana è principalmente determinato dalla presenza di melanina. Nell'industria cosmetica è stata proposta la depigmentazione diretta della melanina mediante enzimi per lo sviluppo di agenti sbiancanti per la pelle. Diverse perossidasi sono state studiate per decolorare la melanina. Woo et al. ha dimostrato che la melanina sintetica può essere decolorata direttamente dalla lignina perossidasi di P. chrysosporium [22]. I gruppi Keneko e Mohorˇciˇc hanno riportato anche la decolorazione enzimatica della melanina da parte della perossidasi di manganese isolata da funghi (Sporotrichum pruinose e Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. hanno riferito che le miscele di enzimi grezzi contenenti perossidasi di manganese, lignina perossidasi e laccasi hanno mostrato attività di depigmentazione della melanina [25]. Quando le perossidasi decolorano la melanina, richiedono il perossido di idrogeno (H2O2) come cofattore che può irritare la pelle. Pertanto, per ridurre l'utilizzo di H2O2, nel sistema di combinazione enzimatica è stata introdotta la glucosio ossidasi o laccasi [26,27]. Le laccasi possono decolorare la melanina senza l'uso di perossido di idrogeno. Khammuang e Sarnthima hanno riferito che la laccasi di Lentinus polycarpous Lév ha mostrato attività di decolorazione della melanina utilizzando ABTS, vanillina e acido vanillico come mediatori [28].

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali

2.2. Decolorazione della melanina mediante LMS

La soluzione satura di melanina (1,4 mg/mL) è stata preparata mediante dissoluzione di 3 mg di melanina sintetica in 1,3 mL di 10 mM NaOH. La soluzione è stata centrifugata a 8500 rpm per 5 minuti per rimuovere la melanina non disciolta, e il surnatante è stato diluito con 0.1 M tampone fosfato di acido citrico (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 o 7) e utilizzato come soluzione substrato per LMS. La concentrazione di melanina nella soluzione del substrato era di 63 µg/mL e confermata spettrofotometricamente a 475 nm. 0,8 mL di soluzione di substrato di melanina è stata miscelata con 0,1 mL di soluzione di mediatore (0–1 mM) in una provetta Eppendorf da 1,5 mL. La reazione di decolorazione della melanina è stata avviata aggiungendo 0,1 mL di soluzione di laccasi (15,8 µg (0,6 U) lacT o 19,2 µg (1,8 U) lacM) a una miscela di melanina e mediatore a 25 °C in un bagno d'acqua agitato a 120 rpm . Dopo la reazione, la miscela di reazione è stata centrifugata e l'assorbanza del supernatante è stata misurata a 475 nm. La resa di decolorazione ( percentuale ) è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

Decolorazione ( percentuale ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Studio cinetico della decolorazione della melanina mediante LMS

2.4. Citotossicità dei mediatori naturali

La linea cellulare di melanoma B16F10 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Corea) è stata utilizzata per determinare la citotossicità dei mediatori naturali per LMS. È stato eseguito un test del rosso neutro (NR) per misurare la citotossicità dei mediatori [29]. NR misura la vitalità dei lisosomi delle cellule vive. Cellule di melanoma con una concentrazione di 3 × 104 cellule sono state dispensate in ciascun pozzetto di una piastra 96-pozzetti. Dopo 24 ore di coltivazione, le cellule sono state trattate con mediatori naturali (1, 2, 5, 10, 22 e 46 mM). Dopo un'ulteriore coltura per 2 giorni, le cellule sono state trattate con una soluzione NR da 50 µg/mL sciolta in DMEM e incubate per 3 ore. Dopo aver rimosso il surnatante mediante aspirazione, è stata utilizzata una soluzione di desorbimento NR (1% di acido acetico glaciale, 49% di etanolo e 50% di acqua distillata) per l'estrazione del colore. Dopo il processo di estrazione, la variazione di assorbanza è stata misurata a 540 nm.

2.5. Preparazione e decolorazione del film idrogel di melanina/cellulosa

Per misurare l'attività di decolorazione di LMS per il film di melanina/cellulosa, il film di idrogel preparato è stato tagliato in un foglio di 1 × 2 cm. Il film di idrogel è stato immerso in 4 mL di tampone fosfato di acido citrico 0.1 M (pH 5,5); successivamente, 0.5 mL di acetosiringone 1 mM e 0.5 mL di lace solution (2.5 U) sono stati aggiunti al tampone. La reazione di decolorazione è stata condotta a bagnomaria con agitazione a 120 pm e 25°C per 3 h. Dopo la reazione, il film è stato lavato con acqua distillata e attaccato al lato interno della cuvetta per misurare la variazione degli spettri nell'intervallo 400-800 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis. Anche le reazioni di controllo senza lacM o mediatori sono state condotte nelle stesse condizioni. Il rilascio della melanina dalla pellicola o il cambiamento di colore della pellicola di melanina/cellulosa non è stato rilevato nelle condizioni di reazione. Inoltre, è stata registrata anche la variazione dei parametri di colore (valori L*, a* e b*) del film di melanina/cellulosa dopo la reazione di decolorazione mediante LMS utilizzando un colorimetro (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Giappone). I valori ∆L (differenza di luminosità metrica), ∆E (differenza di colore totale), YI (indice di giallo) e WI (indice di bianco) sono stati ottenuti utilizzando le seguenti equazioni [30-32]:

2.6. Preparazione di melanina naturale

La melanina naturale è stata ottenuta da cellule di melanoma B16F10. Le cellule sono state trattate con ormone stimolante alfa-melanociti per produrre melanina. Dopo 4 giorni di incubazione, le cellule sono state catturate usando tripsina-EDTA e sonicate per 10 min. Il surnatante è stato ottenuto mediante centrifugazione a 8000 rpm per 10 minuti e poi regolato a pH 1,5 utilizzando 6 M HCl. La soluzione è stata fatta bollire a 100°C per 4 ore per idrolizzare le frazioni proteiche residue. La soluzione contenente melanina naturale è stata lavata con acetone, seguita da cloroformio ed etanolo, e quindi lavata con acqua deionizzata per eliminare i residui, come cellule, componenti dei media e frazioni proteiche [33,34]. Tutti i processi di lavaggio sono stati eseguiti più di due volte. Infine, la melanina naturale è stata ottenuta mediante liofilizzazione e utilizzata come substrato per LMS.

3. Risultati e discussioni

3.1. L'effetto dei mediatori sulla decolorazione della melanina da parte di LMS

L'effetto di vari mediatori sulla reazione di decolorazione della melanina da parte di LMS è stato studiato utilizzando due laccasi di T. versicolor (lacT) e M. thermophila (lacM) (Figura 1).Quando lacT è stato utilizzato senza un mediatore per la decolorazione della melanina, la resa della decolorazione era solo dell'1% dopo 5 ore di reazione. Quando HOBt è stato utilizzato come mediatore per lacT, la resa di decolorazione è stata leggermente aumentata al 2% dopo 5 ore di reazione. L'uso di vari mediatori sintetici, come HOBt, ABTS, VLA e TEMPO, nell'ossidazione catalizzata da laccasi di composti fenolici o non fenolici ha migliorato significativamente le velocità di reazione [10,15]. Quando l'accesso dei composti bersaglio nel sito attivo della laccasi è limitato dal loro ostacolo sterico, i radicali mediatori formati dalla laccasi possono ossidare efficacemente i composti bersaglio mediante il trasferimento di elettroni o il meccanismo di trasferimento dell'atomo di idrogeno [12]. HOBt è uno dei mediatori sintetici più comunemente utilizzati in LMS grazie al suo elevato potenziale redox (1,1 V) [6]. Tuttavia, HOBt non è un buon ingrediente cosmetico a causa della sua potenziale tossicità cellulare e della capacità di inattivare la laccasi. Pertanto, abbiamo selezionato sette mediatori naturali, acetosiringone, siringaldeide, acido p-cumarico, vanillina, acido vanillico, alcol vanillico e acetovanillone, per la reazione di decolorazione della melanina mediante LMS. È interessante notare che tutti i mediatori naturali agiscono come mediatori più efficienti di HOBt per la decolorazione della melanina per mancanza. Quando sono stati utilizzati acetosiringone, siringaldeide e acido p-cumarico, le rese di decolorazione sono state rispettivamente del 28%, 22% e 18% dopo 5 ore di reazione. Questi risultati dimostrano l'utilità dei mediatori naturali per la reazione di decolorazione della melanina mediante LMS. I mediatori nell'LMS sono ossidati a radicali mediatori dalla laccasi e i radicali mediatori inducono l'ossidazione e la decolorazione della melanina. Quando la mancanza è stata utilizzata senza un mediatore per la decolorazione della melanina durante un tempo di reazione sufficiente, che potrebbe raggiungere lo stato di equilibrio, la resa di decolorazione è stata del 7% dopo 24 ore di reazione. I mediatori naturali, ad eccezione dell'acido vanillico, agiscono come mediatori più efficienti di HOBt per la decolorazione della melanina da parte di lacT dopo 24 ore di reazione. La resa di decolorazione dopo 24 ore di reazione usando l'acido vanillico come mediatore era inferiore a quella dopo 5 ore di reazione. Ciò può essere causato dalla bassa stabilità della forma radicalica ossidata dell'acido vanillico. Quando sono stati utilizzati acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone, le rese di decolorazione sono state rispettivamente del 34%, 30% e 31% dopo una reazione di 24 ore. L'acido p-cumarico è stato più efficiente nel migliorare la velocità di reazione iniziale rispetto all'acetovanillone, mentre l'acetovanillone ha indotto una maggiore resa di decolorazione allo stato di equilibrio rispetto all'acido p-cumarico.

Anche l'effetto del mediatore sulla reazione di decolorazione da parte di LMS usando lacM era molto simile a quello ottenuto da LMS usando lacT. Quando il pizzo è stato utilizzato senza un mediatore per la decolorazione della melanina, la resa della decolorazione era solo del 2% dopo 5 ore di reazione. HOBt come mediatore per lacM non ha migliorato la resa di decolorazione durante la reazione di 5 ore. Tutti i mediatori naturali, ad eccezione dell'acido p-cumarico e della vanillina, hanno agito come mediatori efficienti della decolorazione della melanina da parte di lacM. Quando sono stati utilizzati acetosiringone e siringaldeide, le rese di decolorazione sono state rispettivamente del 25% e del 22% dopo 5 ore di reazione. L'acido p-cumarico e la vanillina sono stati utilizzati come mediatori efficienti per ciascuno, ma non sono stati in grado di migliorare in modo efficiente il tasso di decolorazione in LMS utilizzando il pizzo. Ciò può essere causato dalla minore specificità del substrato di lacM per l'acido p-cumarico e la vanillina. Le rese di decolorazione dopo 24 ore di reazione di lacM con acido p-cumarico e vanillina erano simili a quelle ottenute da lacT. Ciò indica che le forme ossidate di acido p-cumarico e vanillina possono decolorare efficacemente la melanina, sebbene il loro tasso di ossidazione da parte di lacM fosse molto inferiore a quello di lacT. Quando lacM senza mediatore è stato utilizzato per la decolorazione della melanina durante un tempo di reazione sufficiente, la resa della decolorazione è stata del 5% dopo 24 ore di reazione. I mediatori naturali, ad eccezione dell'acido vanillico, agiscono anche come mediatori più efficienti di HOBt per la decolorazione della melanina da parte di lacM dopo 24 ore di reazione. Quando acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone sono stati usati come mediatori per lacM, le rese di decolorazione erano rispettivamente del 34%, 28% e 31% dopo 24 ore di reazione. Quando l'acido vanillico è stato utilizzato come mediatore sia per lacT che per lacM, ha mostrato la resa di decolorazione più bassa. Ciò può essere causato dalla bassa stabilità della forma radicalica ossidata dell'acido vanillico. Khammuang e Sarnthima hanno riferito che la vanillina e l'acido vanillico potrebbero essere usati come mediatori per la decolorazione della melanina usando la laccasi di Lentinus polycarpous [28]. Tuttavia, hanno mostrato un'attività di decolorazione molto inferiore per la melanina rispetto all'acetosiringone quando sono stati usati come mediatori per lacT e pizzo.

Questi risultati indicano che i mediatori naturali sono più efficienti per la decolorazione della melanina da parte di LMS rispetto a HOBt. HOBt è stato considerato un efficiente mediatore sintetico per laccasi a causa del suo alto potenziale redox e del ruolo catalitico del gruppo NOH di HOBt [5]. L'efficienza dei mediatori nell'ossidare i substrati bersaglio dipende fortemente dalla capacità di formare radicali stabili e dall'impedimento sterico causato da voluminosi sostituenti alchilici piuttosto che dal potenziale redox dei mediatori [19,35]. La bassa stabilità dell'intermedio ossidato di HOBt è stata determinata mediante voltammetria ciclica [6]. Pertanto, la bassa resa di decolorazione mediante LMS utilizzando HOBt può essere causata dalla bassa stabilità di HOBt nelle condizioni di reazione della laccasi. Sebbene il potenziale redox della siringaldeide fosse inferiore a quello della HOBt, la siringaldeide mostrava una stabilità relativamente più alta della HOBt [6].

Come mostrato nella Figura 2, i mediatori naturali utilizzati in questo lavoro hanno vari sostituenti (ad esempio, idrossile, metossi, carbossile, chetone o aldeide) in diverse posizioni sull'anello benzenico [12,19]. I mediatori con due gruppi metossi (acetosiringone e siringaldeide) hanno mostrato tassi di decolorazione più elevati rispetto a quelli con un gruppo metossi. Il tasso di decolorazione ottenuto dall'acido p-cumarico senza gruppo metossi dipendeva dal tipo di laccasi. L'acido p-cumarico con lacT ha mostrato un tasso di decolorazione più elevato rispetto a quelli con un gruppo metossi, mentre l'acido p-cumarico con lacM ha mostrato il tasso di decolorazione più basso nella reazione di 5 ore. Fillat et al. hanno anche mostrato risultati simili per la decolorazione di inchiostri flessografici da parte di laccasi fungine con mediatori naturali [36]. I mediatori naturali fenolici (acetosiringone, siringa metilica e siringaldeide) con due sostituenti metossi nell'anello sono stati ossidati dalla laccasi più velocemente dell'acido p-cumarico senza gruppo metossi. Ciò indica che i gruppi metossi svolgono un ruolo più importante come donatori di elettroni rispetto al doppio legame della catena laterale dell'acido p-cumarico. Quando i mediatori con un gruppo metossi sono stati confrontati, la resa di decolorazione è aumentata nel seguente ordine: acetovanillone > vanillina > alcol vanillico > acido vanillico. L'acetovanillone, che ha un gruppo chetonico, ha mostrato un tasso di decolorazione e una resa più elevati rispetto ai mediatori con gruppi aldeidici, idrossilici e carbossilici. Anche l'acetosiringone con un gruppo chetonico ha mostrato un tasso di decolorazione e una resa più elevati rispetto alla siringaldeide con un gruppo aldeidico.

Nei seguenti esperimenti, acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone, che hanno mostrato un'elevata capacità di decolorazione della melanina, sono stati selezionati come mediatori per LMS per decolorare la melanina. L'effetto del mediatore sulla reazione di decolorazione da parte di LMS è stato studiato nel tempo (Figura S1). La reazione di decolorazione usando lacT con acetosiringone, siringaldeide e acetovanillone ha portato rispettivamente a rese di decolorazione del 21%, 18% e 1% dopo 1 ora di reazione. La reazione di decolorazione utilizzando lacM con acetosiringone e siringaldeide ha portato rispettivamente a rese di decolorazione del 19% e del 18% dopo 1 ora di reazione. Entrambe le laccasi hanno mostrato profili di reazione simili quando è stato utilizzato lo stesso mediatore. L'acetosiringone e la siringaldeide hanno migliorato significativamente il tasso di decolorazione durante la reazione iniziale. Questi risultati mostrano che l'acetosiringone e la siringaldeide contenenti gruppi dimetossi erano più efficienti nel migliorare il tasso iniziale di decolorazione da parte di LMS rispetto all'acetovanillone contenente un gruppo metossi. Fillat et al. ha anche riferito che i gruppi metossi nelle strutture ad anello dei mediatori agiscono come acceleratori per l'ossidazione dei substrati [36]. D'altra parte, la resa di decolorazione dopo 24 ore di reazione con acetovanillone era simile a quella con siringaldeide, sebbene l'acetovanillone aumentasse moderatamente la velocità di reazione.

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