ASTRATTO

La tirosinasi è un enzima importante nel controllo della formazione di melanina nei melanosomi e svolge un ruolo chiave nella pigmentazione dei capelli e della pelle. L'espressione anormale o l'attivazione della tirosinasi è associata a diverse malattie come l'albinismo, la vitiligine, il melanoma e il morbo di Parkinson. L'eccessiva deposizione di melanina potrebbe causare malattie come lentiggini e macchie marroni nel corpo umano, ed è anche strettamente correlata all'imbrunimento di frutta e verdura e alla muta degli insetti. Rilevare e inibire l'attività della tirosinasi è di straordinario valore nel progresso della diagnosi e del trattamento di queste malattie. Pertanto, sono state sviluppate molte sonde di rilevamento ottico selettivo e piccoli inibitori molecolari, che hanno dato un contributo significativo alla ricerca di base e clinica su queste malattie. In questo documento vengono esaminati il ​​rilevamento e l'inibizione della tirosinasi e la sua applicazione nei prodotti sbiancanti, con particolare attenzione allo sviluppo di sonde e inibitori fluorescenti. Si spera che questa revisione aiuti a progettare sonde e inibitori della tirosinasi più efficienti e sensibili, oltre a far luce su nuovi trattamenti per malattie come il melanoma.

Secondo studi pertinenti,cistancheè un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale ècistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante,antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche epellesbiancanterisiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi di cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importanteinfluenzando melaninaproduzione. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può quindi ridurre la generazione di radicali liberi nel corpoinibentemelaninaproduzione.

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1. Introduzione

La tirosinasi (EC 1.14.18.1; catecol ossidasi; polifenolossidasi [1] o difenolasi) è considerata l'enzima contenente rame più importante nella formazione della melanina. La tirosinasi può catalizzare l'idrossilazione e la successiva ossidazione dell'unità monofenolo a ortochinone sotto l'azione dell'ossigeno molecolare. Si trova nei melanosomi, il sito per la sintesi, lo stoccaggio e il trasporto della melanina. I valori di pH dei melanosomi lievemente e gravemente melanizzati sono rispettivamente di circa 4,5 e 3. Il pH ottimale per l'attività della tirosinasi è 6,8 [2]. Raper [3] e Mason [4] sono stati i primi a chiarire i percorsi biosintetici della formazione della melanina in vari organismi, che sono stati recentemente abbelliti da Schallreuter et al. [5] e Cooksey et al. (figura 1) [6].

La tirosinasi è ampiamente presente nelle piante, negli animali e nei microrganismi. Dato il coinvolgimento della tirosinasi nella patogenesi del melanoma, il monitoraggio e la regolazione farmacologica della sua attività aiuterà la diagnosi e il trattamento della malattia [7]. Le sonde sono state sviluppate per rilevare specificamente l'attività della tirosinasi in ambienti fisiologici. Sono stati sviluppati anche inibitori che potrebbero rendere inattiva la tirosinasi e alcuni di essi sono stati utilizzati clinicamente per curare le malattie. Ad esempio, l'acido cogico e l'arbutina [8], come inibitori specifici della tirosinasi, sono stati utilizzati clinicamente come prodotti sbiancanti. Con i progressi nella scoperta di farmaci, recentemente è stato progettato e sintetizzato un numero crescente di composti efficaci in grado di rilevare/inibire l'attività della tirosinasi. Ciò faciliterebbe notevolmente il progresso della diagnosi e del trattamento di quelle malattie derivanti dalla produzione aberrante di melanina. In questa recensione, discuteremo i progressi nello sviluppo di sonde e inibitori basati su piccole molecole per l'attività della tirosinasi endogena. Si spera che ci aiuti a saperne di più sulla tirosinasi e a trovare composti più funzionali che mirano/regolano la tirosinasi.

2. Struttura della tirosinasi

Il sito attivo della tirosinasi presenta una struttura centrale di rame dual-core composta da due ioni di rame (Fig. 2), che si legano ai residui di istidina nella proteina. I due centri ionici di rame sono collegati da un ponte di coordinazione endogeno. La tirosina e altre sostanze sono complessate con l'enzima, attraverso il legame tra il centro attivo dell'enzima e il gruppo ossidrile. Nel processo della reazione catalitica della melanina, il sito catalitico è classificato in tre forme: stato di ossidazione (Eoxy), stato di riduzione (Emet) e stato di deossigenazione (Edeoxy), la differenza sta nella struttura del centro attivo dello ione rame binucleare (figura 2).

La resina epossidica è composta da due atomi quadrati di rame (II); ogni atomo è costituito da due equatori forti e il ligando è un NH assiale più debole [9]. La molecola di ossigeno esogeno lega e collega i due centri di rame sotto forma di perossidi. La lunghezza del legame CueCu è di circa 0.35 nm. La combinazione di molecole di ossigeno porta alla formazione della struttura (m-h2:h2 -perosso) [10], quindi il centro attivo Eossi può essere scritto come [Cu(II)eO2eCu(II)]. La struttura elettronica dei perossidi svolge un ruolo cruciale nelle funzioni biologiche di Eoxy. A causa della forte azione dell'accettore s*, il perossido ha una carica meno negativa, mentre l'accettore di elettroni p interagisce con gli elettroni nell'orbitale s* del perossido, il che indebolisce notevolmente la forza del legame ossigeno-ossigeno, rendendo il nucleo del centro attivo della tirosinasi facilmente frangibile [9]. Mettyrosinase (Emet) è simile a Eoxy e contiene anche due atomi di rame tetragonale (II) accoppiati attraverso un ponte endogeno. La differenza è che il legante a ponte tra gli ioni di rame è l'idrossido invece del perossido [2]. In termini di proprietà ossidative, anche Emet ed Eoxy sono leggermente diversi. Emet non è in grado di ossidare i composti monofenolici. In assenza di substrati, Emet esiste come forma principale negli organismi. La deossitirosinasi (Edeoxy), simile alla deossi emocianina, ha una struttura simmetrica [(Cu(I)eCu(I)]. Non esiste un legante a ponte come il perossido o l'idrossido tra il rame binucleare; quindi l'idrossido in acqua è un legante a ponte essenziale.

3. Meccanismo d'azione della tirosinasi

Sebbene i ricercatori abbiano condotto studi approfonditi sulla tirosinasi e sulle sue proteine ​​correlate, il meccanismo della sua reazione catalitica è ancora controverso. Ad esempio, l'attività catalitica nello stesso sito attivo della tirosinasi è diversa. Il centro catalitico della tirosinasi contiene un centro di rame binucleare, denominato rispettivamente Cu(A) e Cu(B). Ogni ione di rame nel centro attivo è coordinato con tre diversi residui di istidina. C'è una grande differenza tra l'attività del micofenolato e l'attività della difenolasi e la tirosinasi ridotta ha una fase di ritardo quando reagisce con il monofenolo. Questi sono argomenti importanti che devono essere continuamente esplorati e studiati [11].

La reazione tra tirosinasi e relativi substrati avviene principalmente attraverso la formazione di un efficace legame di coordinazione tra il gruppo ossidrile sul substrato e il centro attivo della tirosinasi. Olivares et al. [12] hanno proposto che Eoxy e substrati adatti nei mammiferi inneschino l'attività del micofenolato e l'attività della difenolasi. Durante l'attività micofenolica, i monofenoli (L-tirosina) vengono ossidati per formare o-chinoni (o-dopachinone), un importante precursore della melanina, ed Edeoxy. Durante l'attività difenolasica, Eoxy ed Emet possono anche ossidare gli o-difenoli (L-DOPA) per produrre o-dopachinone [13]. Questo meccanismo è generalmente accettato dai ricercatori in quanto può riflettere in modo più accurato le caratteristiche cinetiche della tirosinasi, in cui la fase limitante nella produzione di melanina è il ciclo del monofenolo [14].

3.1. Meccanismo dell'attività dei micofenolati

Durante la sintesi della melanina, la funzione principale dell'enzima è quella di ossidare i substrati di monofenolo in o-chinone mediante Eoxy. Questo processo è una caratteristica importante che distingue la tirosinasi da altre ossidoriduttasi come la catecol ossidasi. Durante il ciclo del monofenolo (Fig. 2), l'atomo di ossigeno sul fenolo deprotonato è coordinato con lo ione rame del centro attivo della tirosinasi ossidata per formare il complesso micofenolato Eoxy (EoxyM), e quindi il fenolo viene sostituito orto-elettrofilicamente alla difenolasi Emet complesso (EmetD). EmetD subisce un processo di scissione per generare direttamente o-chinone ed Edeoxy. Edeoxy si combina direttamente con le molecole di ossigeno per riformare Eoxy. Questo è il processo ciclico dell'attività del micofenolato. Questo processo non termina finché la reazione del substrato non è completa. Nel processo di reazione del ciclo del monofenolo, se l'Emet allo stato naturale incontra un substrato di monofenolo, subirà una reazione di ossidazione estremamente lenta e ostacolerà il normale svolgimento della reazione del monofenolo. Pertanto, questo periodo è chiamato "periodo di ritardo" perché Emet stesso non può legare le molecole di ossigeno [12].

3.2. Meccanismo dell'attività della difenolasi

4. Funzione della tirosinasi

La tirosinasi fa parte della famiglia del rame di tipo 3 ed esiste nel primo processo di formazione della melanina. Partecipa principalmente ai seguenti due processi di reazione [17]: (1) idrossilazione della L-tirosina a L-DOPA; (2) ossidazione di L-DOPA per formare dopachinone. Il dopachinone alla fine formerà la melanina attraverso una serie di reazioni. Gli altri due membri della famiglia del rame di tipo 3 sono la catecol ossidasi e l'emocianina. La catecol ossidasi mostra solo attività difenolasica e l'emocianina è sulla linfa di molti molluschi e artropodi portatori di ossigeno. Sebbene i centri attivi delle proteine ​​della famiglia del rame di tipo 3 siano conservati in termini di struttura totale e capacità di collegare le molecole di ossigeno, le loro potenziali attività enzimatiche sono leggermente distinte a causa della variabilità dell'attaccamento del substrato al centro enzimatico o dell'incontrollabilità che il substrato può raggiungere.

Oltre a partecipare al processo di produzione della melanina, la tirosinasi svolge anche altre importanti funzioni fisiologiche. Nelle spugne, nelle piante e in alcuni invertebrati, la tirosinasi è principalmente coinvolta nel processo di guarigione delle ferite e nella risposta immunitaria primaria [18]. Negli artropodi, la tirosinasi può favorire il processo di indurimento dello strato corneo degli animali dopo la muta. La tirosinasi batterica può essere secreta nel suolo e partecipare al processo di accoppiamento casuale di diversi composti aromatici per formare humus. Inoltre, è stato scoperto che la tirosinasi può anche essere un potenziale antidoto per le sostanze tossiche del benzene [13,19]. Inoltre, svolge un ruolo indispensabile nell'uccisione delle piante parassite contro i batteri simbiotici fenolici, la produzione di pigmenti naturali e la sintesi di antibiotici aminoacidi come la lincomicina. Il punto comune di questi effetti è inseparabile dalla tirosinasi utilizzando reazioni redox con molecole di ossigeno [11].

5. Malattie correlate alla tirosinasi

La distribuzione della tirosinasi è strettamente connessa con le funzioni fisiologiche di piante e animali. Si ritiene generalmente che i colori delle piume, dei capelli, degli occhi, dell'epidermide degli insetti, dei semi e di altri pigmenti siano il risultato della tirosinasi [10]. La tirosinasi ha funzioni diverse ma importanti in diversi organismi. Nella maggior parte degli insetti in condizioni fisiologiche normali, la tirosinasi esiste sotto forma di zimogeno e diversi tipi di tirosinasi esistono in parti specifiche degli insetti per completare specifiche funzioni fisiologiche [20]. Oltre a partecipare alla produzione di melanina, la tirosinasi degli insetti è l'unico enzima coinvolto nella cheratosi. La cheratina indurita dagli insetti può bloccare l'invasione di microrganismi e corpi estranei e proteggere il morbido corpo degli invertebrati. Negli artropodi, la tirosinasi partecipa anche ad altri due importanti processi fisiologici, vale a dire la risposta di difesa e la guarigione delle ferite. La melanina prodotta dalla tirosinasi nei mammiferi viene secreta nei cheratinociti dell'epidermide e dei capelli, scolorando la superficie corporea, proteggendo così la pelle e gli occhi, resistendo alle radiazioni ultraviolette e prevenendo il surriscaldamento dei tessuti interni [10]. La tirosinasi trovata nei mammiferi è comunemente scoperta nei melanociti, che sono cellule altamente specifiche che esistono nella pelle, nei follicoli piliferi e negli occhi per produrre pigmenti [4,21]. Quando la funzione della tirosinasi è ridotta o assente, influenzerà il metabolismo della melanina e causerà malattie come l'epilessia e l'albinismo. Anche le malattie autosomiche recessive negli animali e nell'uomo sono correlate alla perdita di tirosinasi o alla diminuzione dell'attività [22].

6. Indagini di tirosinasi

Le sonde sono sostanze che riconoscono specificamente il bersaglio e rilasciano segnali rilevabili che riflettono la presenza e l'attività del bersaglio. Il metodo colorimetrico tradizionale per l'analisi della tirosinasi è stato limitato a causa della sua bassa sensibilità [23]. In un primo momento, il gruppo di Willner [24e27] ha riportato diversi altri metodi di rilevamento basati sull'elettrochimica e sulle nanoparticelle d'oro, che non solo aumentano la versatilità del rilevamento, ma aggiornano anche notevolmente la colorimetria in termini di sensibilità. È stata anche introdotta una strategia fluorescente per progettare sonde tirosinasi altamente sensibili come mostrato in Fig. 3. I punti quantici inizialmente sviluppati e le sonde fluorescenti polimeriche coniugate possono essere applicate per monitorare l'attività della tirosinasi [28]. Tuttavia, le sonde fluorescenti a piccole molecole sono particolarmente attraenti a causa dei loro speciali vantaggi come sensibilità, specificità e compatibilità. Nel 2008, il team di Zhu ha sintetizzato un nuovo oligo solubile in acqua (fenilenevinilene) (Pr1) come un fluoroforo FL contenente testata tirosina (WH) come sonda fluorescente per la tirosinasi. È stato dimostrato che Pr1 è adatto per rilevare l'attività della tirosinasi finora in una soluzione acquosa tampone anche in gel di agarosio [29]. In primo luogo, una sonda fluorescente (Pr2) a base di cianina nel vicino infrarosso (NIR) è stata utilizzata per monitorare l'attività della tirosinasi nel 2010 da Ma et al. [30]. Il significativo cambiamento di colore prima e dopo la reazione potrebbe essere rilevato ad occhio nudo. Tuttavia, queste sonde mostrano anche una modalità di spegnimento causata dalla porzione di chinone generata dall'ossidazione catalizzata dalla tirosinasi. Per l'uso funzionale, tuttavia, l'approccio migliore consiste nell'implementare un saggio biologico nella modalità di accensione a causa della sua sensibilità e maggiore idoneità per il bioimaging della tirosinasi nei sistemi viventi. Nel 2010 Kim e coll. [31] hanno proposto una sonda fluorogenica attiva basata su BODIPY per rilevare l'attività della tirosinasi endogena in cellule di melanoma vive (Pr3, Fig. 4). Sulla base di precedenti ricerche sulla tirosinasi applicata per rimuovere i gruppi protettivi delle ammine [32], Yan et al. [33] sonde tirosinasi preparate, Pr4 e Pr5, in cui un gruppo fenolo e un gruppo naftilammina sono stati collegati attraverso un legame urea nel 2012. È importante sottolineare che Pr4 è stata la prima sonda fluorogenica con accensione a due fotoni progettata per rilevare l'attività della tirosinasi in tampone acquoso e cellule viventi. Nel 2013 Wang e coll. [34] hanno dimostrato che la sonda fluorescente basata su NBD-NH2- (Pr6 e Pr7) contenente frazioni fenoliche (WH) può essere utilizzata per rilevare l'attività della tirosinasi e schermare potenziali inibitori della tirosinasi con un "accensione" strategia. Tuttavia, in questo lavoro non vi è alcun esperimento biologico correlato all'imaging cellulare. Nel 2016, Li e colleghi hanno progettato un gruppo di nuove sonde basate su 7- ammino-4-(trifluorometil)-cumarina come fluoroforo FL e le hanno sintetizzate, Pr8-11, con distanze variabili tra FL fluoroforo e fenoli. Pr9 è risultato essere una sonda fluorogenica "accesa" altamente sensibile e selettiva per l'imaging di cellule di melanoma vive [35]. Nel 2018, il team di Wu è stato il primo a utilizzare una sonda fluorescente FL (Pr12) per diagnosticare il melanoma precoce nei modelli murini di roditori (Figg. 4 e 5A). La sonda può essere attivata dall'ossidazione mediata dalla tirosinasi e quindi idrolizzare i legami ureici per produrre un segnale di fluorescenza. Allo stesso tempo, può anche monitorare in modo sensibile e selettivo il livello di tirosinasi endogena nelle cellule viventi e nel pesce zebra (Fig. 5 B/C) [36].

Nel 2016, il gruppo di Ma [37] ha sviluppato una nuova sonda fluorogenica denominata Mela-TYR (Pr13, Fig. 4) per mirare ai melanosomi per rilevare l'attività della tirosinasi. Pr13 è stato progettato incorporando ftalimmide con morfolina e 4-urea derivata da ammino-fenolo. La sonda mostra una risposta di accensione altamente sensibile e selettiva alla tirosinasi attraverso una reazione di scissione di ossidazione. Le sonde di fluorescenza sopra descritte contenevano principalmente un gruppo 4-idrossifenile come frazione di riconoscimento (WH) e mostravano una risposta di fluorescenza parallela a diverse specie reattive dell'ossigeno (ROS) e alla tirosinasi, quindi interferenti con i ROS. Il gruppo di Ma ha scoperto una nuova frazione di riconoscimento della tirosinasi, 3-idrossibenzilossi (WH), che ha mostrato diversi meccanismi di reazione per tirosinasi e ROS [38]. Una sonda di fluorescenza NIR (Pr14, Fig. 4) è stata sviluppata installando 3- idrossibenzilossi in un fluoroforo NIR (HXPI) e ha mostrato una risposta off-on altamente specifica alla tirosinasi anziché al ROS, superando così l'interferenza. La presenza del gruppo 3- idrossi facilita l'idrossilazione da parte della tirosinasi nella 4-posizione vacante ma non da parte del ROS, e l'intermedio subirebbe l'eliminazione spontanea di 1,6-riarrangiamento, rilasciando fluoroforo libero. L'elevata specificità della sonda sviluppata è stata dimostrata dall'imaging e dal rilevamento dell'attività della tirosinasi endogena nelle cellule viventi e nei pesci zebra, e l'elevata specificità della sonda è stata ulteriormente verificata mediante un test di immunoassorbimento enzimatico (Figg. 4 e 6). Il gruppo di Ma ha successivamente sviluppato un'altra sonda fluorogenica attiva (Pr15, Fig. 4) basata sulla resorufina incorporata con un gruppo 3-idrossifenile [39]. È stato utilizzato per rilevare e visualizzare l'attività della tirosinasi endogena in una varietà di cellule viventi. Ispirato dal progetto di cui sopra, Zhang e collaboratori [40] hanno proposto una sonda tirosinasi fluorogenica (Pr16, Fig. 4) con resorufina come fluoroforo e l'estere pinacolo dell'acido boronico m-tolilico (WH) come nuovo riconoscimento della tirosinasi metà. La sonda ha mostrato un'elevata selettività per la tirosinasi rispetto ad altre sostanze biologiche, tra cui i ROS. Tuttavia, è stato gravemente interferito da H2O2. Nel 2019, Hu et al. [41] hanno riportato una nuova sonda fluorogenica con elevata selettività chimica basata sulla fluoresceina (Pr17, Fig. 4), che può tracciare la tirosinasi in vitro e in vivo e realizzare l'elevata rilevazione chemoselettiva della tirosinasi. Inoltre, la sonda ha reagito in una soluzione acquosa e ha mostrato un miglioramento della fluorescenza di oltre 24 volte in presenza di tirosinasi. Inoltre, Pr17 ha mostrato ottime caratteristiche di permeabilità della membrana cellulare e dei tessuti, che hanno contribuito al suo successo nel seguire l'attività della tirosinasi endogena in distinte cellule viventi aiutate e modelli di zebrafish. Il gruppo di Ding ha costruito una nuova sonda di fluorescenza NIR solubile in acqua (Pr18, Fig. 4) in grado di riconoscere specificamente la tirosinasi, che è altamente stabile all'interno della temperatura e del pH fisiologici e può rilevare accuratamente la tirosinasi nei sistemi biologici senza essere disturbata da entità onnipresenti. Può essere utilizzato per l'imaging della tirosinasi in cellule viventi, zebrafish e modelli murini xenogenici [42].

Sidu et al. ideato e sintetizzato una sonda fluorescente raziometrica (Pr19, Fig. 4) basata su naftalimmide. Pr19 ha un'elevata selettività e sensibilità per la tirosinasi e il limite di rilevamento (LOD) è piuttosto basso [43]. L'eccitazione o lo spostamento dello spettro di emissione si verifica dopo che la sonda è stata combinata con i reagenti. Può essere registrato utilizzando il rapporto dell'intensità di fluorescenza misurata a due diverse lunghezze d'onda, che è chiamato misurazione del rapporto. Le sonde fluorescenti raziometriche basate su questo principio mostrano la loro sensibilità e selettività e possono essere utilizzate per lo studio della funzione enzimatica in sistemi vivi [44]. Il team di Guo ha proposto una nuova sonda fluorescente NIR raziometrica e attiva (Pr20, Fig. 4) per il rilevamento in tempo reale dell'attività della tirosinasi endogena. Queste caratteristiche speciali di Pr20, combinate con rara citotossicità, caratteri fotofisici superiori e permeabilità della membrana cellulare, lo rendono ideale per la rilevazione quantitativa dell'attività tirosinasica endogena [45]. I derivati ​​della cianina, come i tipici coloranti fluorescenti NIR, possono essere aggregati in modo controllabile in soluzioni acquose e quindi esibiscono molte proprietà spettrali significativamente diverse. L'atomo di cloro al centro dello scheletro di cianina è facilmente sostituito da altri gruppi funzionali. Sulla base di questa funzione, Zhang et al. [46] hanno sviluppato una nuova sonda fluorescente a base di cianina (Pr21, Fig. 4) per il rilevamento raziometrico della fluorescenza dell'attività della tirosinasi (Fig. 7). La determinazione del rapporto ha ottenuto un buon rapporto segnale/rumore e il valore LOD dell'attività della tirosinasi era di 0,02 U/mL. Inoltre, Pr21 è stato impiegato con successo nell'imaging dell'attività della tirosinasi endogena nelle cellule B16 e distinguendola qualitativamente da altre cellule tumorali/normali in assenza di tirosinasi (Fig. 7).

7. Inibitori della tirosinasi

Gli inibitori sono generalmente suddivisi in inibitori reversibili e inibitori irreversibili in base al fatto che gli inibitori che interagiscono con gli enzimi causino l'inattivazione permanente dell'enzima. L'inibizione caratteristica della tirosinasi è l'inibizione reversibile. Per l'inibizione caratterizzata da inibizione reversibile, la combinazione di inibitore ed enzima è un processo di equilibrio dinamico reversibile [47-49]. L'aumento della concentrazione dell'inibitore causerà la diminuzione dell'attività enzimatica, ma l'inibitore inibisce solo l'attività enzimatica piuttosto che inattivare permanentemente l'enzima. Quando la concentrazione dell'inibitore diminuisce, l'attività della tirosinasi aumenterà. Nel frattempo, l'inibizione irreversibile sarà l'inattivazione permanente della tirosinasi. Secondo i diversi siti e metodi degli inibitori della tirosinasi che interagiscono con l'enzima, possono essere suddivisi in quattro forme: legame competitivo, non competitivo, misto e lento.

I flavonoidi sono un insieme di composti composti da due anelli benzenici collegati da una catena a tre atomi di carbonio. Poiché i gruppi delle catene laterali ossidrile, metossilico e glicosidico si trovano negli anelli benzenici, la disposizione può essere suddivisa in flavonoli, calconi, diidroflavoni e arancioni (Fig. 8) [56]. I flavonoidi sono ampiamente distribuiti nelle foglie, nei semi, nelle bucce e nei seguaci delle piante e i ricercatori hanno verificato più di 4000 flavonoidi. Per alcune piante, i flavonoidi e i loro derivati ​​hanno protezione contro i raggi UV, i patogeni e gli erbivori [57]. L'analisi della struttura dell'estratto di radice di liquirizia mostra che la capacità inibitoria della tirosinasi di neoglicirrizina, glicirrizina, isoliquiritigenina e glicirrizina è correlata alla loro lipofilia. Tra questi, l'inibizione del monofenolo è più efficace di quella del difenolo, indicando che si tratta di una reazione limitante la velocità nella prima fase della reazione di ossidazione [58].

Alcuni flavoni contenenti una struttura {{0}}idrossi-4-chetonica possono inibire in modo competitivo l'attività enzimatica chelando il rame nel sito attivo della tirosinasi, con conseguente inattivazione irreversibile della tirosinasi. Dopo aver chelato la tirosinasi, la molecola teoricamente perde la sua struttura planare e si deforma. Gli inibitori competitivi sono generalmente paralleli nella struttura al substrato, quindi la molecola entra facilmente nel sito attivo della tirosinasi e impedisce l'ingresso di L-DOPA [59,60]. Jeong et al. estratto due flavonoli dalle foglie di Zanthoxylum piperitum. I flavonoli possono inibire l'attività della tirosinasi dei funghi, che è un'inibizione competitiva, ma non può inibire la produzione di melanina di Streptomyces bikiniensis. Successivamente, si è scoperto che il composto flavonoide isolato dalla Formosa filippina può anche inibire la tirosinasi e l'effetto inibitorio è migliore di quello dell'acido cogico [62]. Lian et al. hanno scoperto che il pigmento giallo cartamo può anche inibire l'attività della tirosinasi dei funghi, con un valore di concentrazione inibitoria a metà massima (IC50) di 1,01 mg/mL. Questa relazione di inibizione sembra essere dose-dipendente [63]. La (2R, 3R)-(þ)-purpurina estratta da Shuiliao inibisce il 70% dell'attività della tirosinasi e la concentrazione è di 0,50 mM. La capacità inibitoria è migliore di quella dell'acido cogico e dell'arbutina [64].

Il 7,8,40 -triidrossiflavone è un derivato flavonoide che inibisce l'attività della tirosinasi difenolasi in modo non competitivo con un valore IC50 di 10.31 ± 0,41 mM e un Ki di 9,50 ± 0,40 mm. Il meccanismo d'azione di questo composto con la tirosinasi è un meccanismo statico e mostra un singolo sito di legame con una costante di legame di (7,05 ± 1,20) × 104 M-1 a 298 K. I parametri termodinamici mostrano che il processo di legame è correlato al legame idrogeno e alle forze di van der Waals [51].

3,8-idrossichinolina (In1, Fig. 9 [65]) separata dai sussidi di Scolopendra mutilans può inibire la produzione e l'ossidazione della melanina nelle cellule Melan-a. In1 mostra un effetto antiossidante sviluppato dalla concentrazione e inibisce significativamente l'attività della tirosinasi dei funghi attraverso l'inibizione non competitiva. Allo stesso tempo, In1 risulta essere non citotossico nello studio, come mostrato nella Tabella 1 [65]. La frazione di acetato di etile dell'estratto di fiori di Nymphaea nuchal (NNFE) (100 mg/mL) può ridurre efficacemente la produzione di melanina e inibire l'attività della tirosinasi dei funghi. Il meccanismo sottostante implica l'interferenza con i fattori di trascrizione e le vie di segnalazione universali nella sintesi della melanina [66]. La capsaicina (In2, Fig. 9 [67]) e la diidrocapsaicina (In3, ​​Fig. 9) estratte dal pepe possono inibire l'attività della tirosinasi. Il risultato mostra che il valore IC50 di In2 è 1,73 volte inferiore a quello di In3. La costante di inibizione (Ki) supporta anche l'attività inibitoria di In3 (0,39 mM, Tabella 1) sulla tirosinasi inferiore a quella di In2 (0,30 mM, Tabella 1) [67]. È stato riscontrato che la caffeina (In4, Fig. 9 [68]) estratta dal polline di camelia mostra una forte attività inibitoria verso la tirosinasi dei funghi in un modello non competitivo come mostrato nella Tabella 1. In4 cambia il sito di legame della L-tirosina e l'anello conformazione adiacente al centro attivo legandosi alla tirosinasi. I risultati sperimentali mostrano che In4 ha un evidente effetto inibitorio sull'attività della tirosinasi nelle cellule e la generazione di melanina delle cellule di melanoma B16F10 è correlata alla concentrazione [68]. L'acido caftarico (In5, Fig. 9) estratto dall'uva può inibire competitivamente la tirosinasi e il valore IC50 (Tabella 1) è inferiore a quello dei composti relazionali, acido caffeico e acido clorogenico [47]. La floretina (In6, Fig. 9) può legarsi alla tirosinasi attraverso un processo statico, che provoca il cambiamento della conformazione della tirosinasi, inibendone così l'attività. Allo stesso tempo, In6 ha una forte capacità antiossidante e la capacità di ridurre l'o-dopachinone a LDOPA [48].

I ricercatori hanno valutato due spiro acridine (AMTAC-01, In7, Fig. 9) e (AMTAC-02, In8, Fig. 9) come inibitori della tirosinasi. I risultati mostrano che i derivati ​​dell'acridina interagiscono fortemente con la tirosinasi dei funghi. In8 è più efficace nell'inibire l'attività enzimatica rispetto a In7, come mostrato nella Tabella 1, che indica che il gruppo metossi di In8 è altamente correlato con l'attività inibitoria [49]. Diversi 21 tiosemicarbazoni alogenati (TSC) sono stati sintetizzati e studiati. È stato riscontrato che le TSC 6, 12 e 21 (In9/10/11, Fig. 9 [69]) mostrano potenti proprietà inibitorie con IC50 diverse, rispettivamente (Tabella 1). Dimostrano un meccanismo reciprocamente reversibile e competitivo per inibire la tirosinasi. Tra i composti studiati, i derivati ​​acetofenone para-sostituiti dei tiosemicarbazoni hanno la più alta affinità per l'enzima [69]. La penicillina V (In12, Fig. 9) è un farmaco antibiotico batteriolitico b-lattamico. Gli studi hanno scoperto che In12 può inibire l'attività del micofenolato e della difenolasi. Gli studi sull'estinzione della fluorescenza e sul docking molecolare hanno dimostrato che In12 può formare un'interazione statica vicino alla tasca catalitica dell'enzima, ostacolando così il trasporto del substrato al sito attivo e riducendo la plasticità del rame per la catalisi [70]. Recentemente Raza et al. ha studiato il potenziale inibitorio di N-(fenil-sostituito)-4-{(4-[(E)-3- fenil-2-propenil]-1-piperazinil) butanammidi ( 5a-e) sulla tirosinasi. Tutti i composti sono risultati biologicamente attivi, con 5b (In13, Fig. 9) che mostra il più alto potenziale inibitorio [71]. Mahjan et al. progettato e sintetizzato chinazolinone ben ammidi 4a-h (In14e21, Fig. 9). Attraverso lo studio dell'effetto inibitorio dei composti sull'attività della tirosinasi, è stato riscontrato che tutti i composti mostrano valori IC50 inferiori rispetto all'acido cogico standard, come mostrato nella Tabella 1 [72]. Shenn et al. trovato un nuovo inibitore della tirosinasi, il peptide ECGYF (EF-5, In22) come mostrato in Fig. 9. Il legame tra In22 e tirosinasi dipende principalmente dal legame idrogeno e dalle interazioni idrofobiche e l'effetto dell'inibizione della tirosinasi è più forte di quella dell'arbutina e del glutatione [73]. Lui et al. isolato tre tamariscinoli 1/2/3 (In23/24/25) e due composti fenolici 4 e 5 (In26 e 27) come mostrato in Fig. 9. Gli esperimenti hanno dimostrato che tutti gli isolati hanno effetti inibitori sulla tirosinasi dei funghi, con In23 che è il quello più efficace (Tabella 1) [74].

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