Zerumbone, un sesquiterpene di zenzero tropicale di Zingiber Officinale Roscoe, attenua la melanogenesi indotta da -MSH nelle cellule B16F10 Parte 1

Astratto:Zerumbone (ZER), un costituente attivo della famiglia delle Zingiberaceae, ha dimostrato di esibire diverse attività biologiche, come antinfiammatorie, antiallergiche, antimicrobiche e antitumorali; tuttavia, non è stato studiato per le proprietà anti-melanogeniche. Nel presente studio, dimostriamo che ZER e Zingiber sono estratti officinali (ZO) che attenuano significativamente l'accumulo di melanina nelle cellule melanogeniche B16F10 stimolate dall'ormone stimolante i melanociti (-MSH). Inoltre, per chiarire il meccanismo molecolare mediante il quale ZER sopprime l'accumulo di melanina, abbiamo analizzato l'espressione del fattore di trascrizione associato alla melanogenesi, il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF) e i suoi geni bersaglio, come la tirosinasi, la proteina 1 correlata alla tirosinasi. TYRP1) e la proteina 2 correlata alla tirosinasi (TYRP2), nelle cellule B16F10 stimolate da -MSH. Qui, abbiamo scoperto che ZER inibisce l'espressione mediata da MITF di geni melanogenici su stimolazione -MSH. Inoltre, le cellule trattate con diverse concentrazioni di zerumbone e ZO hanno mostrato un aumento della fosforilazione delle chinasi extracellulari regolate dal segnale 1 e 2 (ERK1/2), che sono coinvolte nel meccanismo di degradazione del MITF. L'inibizione farmacologica di ERK1/2 utilizzando U0126 ha sufficientemente invertito l'effetto anti-melanogenico di ZER, suggerendo che è necessaria una maggiore fosforilazione di ERK1/2 per la sua attività anti-melanogenica. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che gli estratti ZER e ZO possono essere utilizzati come ingredienti attivi nei cosmetici sbiancanti per la pelle a causa del loro effetto anti-melanogenico.

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale èCistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante,antinfiammatorioe promozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tracistancheEsbiancamento della pellerisiede nell'effetto antiossidante della cistancheglicosidi. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata datirosinasie la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può quindi ridurre la generazione di radicali liberi nel corpoinibendo la produzione di melanina.

Clicca su Come usare Cistanche

Per maggiori informazioni:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Parole chiave:zerumbone; Zingiber officinale Roscoe; melanogenesi; MITF; ERK1/2

1. Introduzione

La melanogenesi, la produzione di melanina da parte dei melanociti epidermici, è stimolata dall'ormone stimolante i melanociti (-MSH) che viene secreto dai cheratinociti dopo l'esposizione alle radiazioni ultraviolette (UV) [1,2]. Il fattore delle cellule staminali (SCF) è un altro fattore melanogenico che controlla strettamente la migrazione, la proliferazione e la differenziazione dei melanociti per il mantenimento della melanogenesi cutanea postnatale [3]. Il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF), che è un fattore di trascrizione melanogenico, viene attivato attraverso la via di segnalazione cAMP-PKA-CREB (proteina legante l'elemento di risposta ciclico dell'adenosina monofosfato-proteina chinasi A-cAMP) alla stimolazione -MSH tramite il recettore della melanocortina 1 (MC1R) nelle membrane citoplasmatiche dei melanociti epidermici [4]. È noto che diverse sostanze chimiche, come la forskolina e l'IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), attivano la via di segnalazione cAMP-PKA-CREB, portando all'induzione della melanogenesi [5]. Diversi studi hanno rivelato che l'attivazione sostenuta delle chinasi extracellulari regolate 1 e 2 (ERK1/2), che è coinvolta nel meccanismo molecolare dell'oncogenesi, promuove la fosforilazione del MITF a Ser73 e la sua successiva degradazione tramite proteolisi ubiquitina-dipendente [6,7 ]. Infatti, è stato riportato che U0126, un inibitore selettivo della via ERK1/2, aumenta l'espressione del MITF e l'attività della tirosinasi, portando alla produzione di melanina [6]. Il MITF stabilizzato e attivato aumenta l'espressione di geni melanogenici, come la tirosinasi, la proteina 1 correlata alla tirosinasi (TYRP1) e la proteina 2 correlata alla tirosinasi (TYRP2). La trasformazione della tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (L-DOPA), che è la fase iniziale della melanogenesi, è catalizzata dalla tirosinasi. Le proteine ​​correlate alla tirosinasi (TRP) catalizzano ulteriori reazioni di ossidazione e tautomerizzazione [8]. Dopo la sintesi della melanina, la melanina matura viene trasportata dai melanociti epidermici nel citoplasma dei cheratinociti basali per proteggere le cellule dai raggi UV [2].

La melanogenesi anormalmente aumentata causa molteplici tipi di disturbi della pelle, come il cancro della pelle, il cloasma e le lentiggini [4]; pertanto, piccole molecole o prodotti naturali che prendono di mira l'attività catalitica della tirosinasi o i regolatori delle vie di segnalazione nella melanogenesi, tra cui ERK1/2, o la trascrizione mediata da MITF di geni melanogenici, sono stati identificati come ingredienti attivi da sfruttare nel cosmetico industria. Diverse piccole molecole, come l'acido cogico, l'arbutina e la niacinamide, sono ampiamente utilizzate come ingredienti cosmetici a causa delle loro attività anti-melanogeniche. Tuttavia, i rapporti hanno dimostrato che l'acido cogico causa molteplici effetti collaterali, tra cui citotossicità, dermatiti, cancro della pelle e carcinoma epatocellulare, a causa della sua attività genotossica [9]. Sebbene l'arbutina, che è stata isolata dalla pianta dell'uva ursina, sia stata usata per trattare il disturbo da iperpigmentazione, recentemente il suo uso come ingrediente cosmetico è stato limitato a causa dei suoi numerosi effetti collaterali [9]. È stato riportato che la niacinamide ha un'attività anti-melanogenica e questa attività viene svolta inibendo il trasferimento del melanosoma dai melanociti ai cheratinociti circostanti [10]. Pertanto, è stato generalmente utilizzato come composto sbiancante per la pelle nell'industria cosmetica. Per superare i limiti degli agenti sbiancanti per la pelle consolidati che hanno diversi effetti collaterali, è importante sviluppare ingredienti sbiancanti per la pelle sicuri derivati ​​da fonti naturali. Ad esempio, -thujaplicin, linderanolide B, 4-butil resorcinolo e plumbagin sono stati identificati come composti anti-melanogenici a causa dei loro effetti inibitori della tirosinasi [4,11]. La nobiletina, la withaferina A, il sesamolo e la chaetocina mostrano proprietà anti-melanogeniche modulando gli intermedi di segnalazione nella via della melanogenesi [11].

Lo Zerumbone (ZER) è un prodotto naturale, che viene isolato dagli oli essenziali volatili di piante appartenenti alla famiglia delle Zingiberaceae, come Zingiber zerumbet Smith e Zingiber officinal Roscoe [12]. Diversi studi hanno dimostrato che lo ZER ha una vasta gamma di attività biologiche, tra cui attività antimicrobiche, antiossidanti, antidiabetiche, antitumorali, antinfiammatorie, antiallergiche e antiangiogeniche [12]. È interessante notare che ZER ha dimostrato di esercitare un effetto protettivo contro il danno ossidativo indotto dai raggi ultravioletti A (UVA) nei cheratinociti cutanei, grazie alla sua capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) attraverso l'attivazione del fattore nucleare E{{8} }fattore correlato-2 (Nrf2) [1,13]. Ciò suggerisce che lo ZER può essere utilizzato come additivo funzionale nei cosmetici per la cura della pelle. Tuttavia, il meccanismo dettagliato delle proprietà anti-melanogeniche dell'azione ZER deve ancora essere studiato.

Nel presente studio, sono stati studiati gli effetti inibitori dell'estratto di ZER e Zingiber officinal (ZO) sulla melanogenesi stimolata da -MSH e sui loro meccanismi sottostanti. Qui, mostriamo che ZER sopprime significativamente la melanogenesi indotta da -MSH regolando la fosforilazione di ERK1/2 e inibendo l'espressione mediata da MITF dei geni melanogenici.

2. Risultati

2.1. Zerumbone (ZER) sopprime la melagenesi indotta da -MSH nelle cellule di melanoma di topo B16F10

Per studiare l'effetto anti-melanogenico dello zerumbone (ZER), abbiamo inizialmente valutato la sua citotossicità sia nelle cellule B16F10 che nelle cellule HaCaT. La struttura chimica di ZER è mostrata nella Figura 1A. È stato osservato che ZER a concentrazioni superiori a 20 µM ha mostrato un forte effetto citotossico, mentre, a quelle inferiori a 20 µM, ZER non ha mostrato citotossicità in entrambe le linee cellulari (Figura 1B). Successivamente, abbiamo studiato gli effetti inibitori di ZER sull'accumulo e la secrezione di melanina indotta da -melanociti stimolanti l'ormone ( -MSH) nelle cellule B16F10. È stato dimostrato che ZER sopprime fortemente l'accumulo intracellulare di melanina indotto da MSH e la sua secrezione nel mezzo di coltura (Figura 1C, D). Inoltre, abbiamo scoperto che ZER attenua la melanogenesi in modo più efficace rispetto a 1 mM di arbutina o 0,2 mM di acido kojico, i ben noti costituenti attivi dei cosmetici sbiancanti per la pelle (Figura 1D). Per chiarire se ZER è sufficiente per sopprimere la melanogenesi nelle cellule umane, abbiamo utilizzato cellule di melanoma umano G361 che producono melanina. Come mostrato nella Figura 1E, ZER riduce significativamente il contenuto di melanina extra e intracellulare indotto dal fattore delle cellule staminali (SCF). Questi risultati confermano l'attività anti-melanogenica di ZER nelle cellule melanogeniche di topo B16F10 e G361 umane.

2.2. Zerumbone sopprime l'espressione genica del fattore di trascrizione della melanogenesi, MITF e i suoi geni bersaglio nelle cellule di melanoma umano G361 

È stato riportato che la segnalazione di endotelina-1 e SCF svolge ruoli essenziali nella melanogenesi nei melanociti umani e in diversi sottotipi di melanoma [3,14–16]. In questo studio, abbiamo scoperto che ZER sopprime la melanogenesi su stimoli melanogenici, -MSH e SCF, nelle cellule di melanoma del topo B16F10 e G361 umane (Figura 1).

Pertanto, abbiamo misurato le alterazioni nei livelli di espressione dei geni e delle proteine ​​​​correlati alla melanogenesi dopo stimolazione SCF nelle cellule di melanoma umano G361. Abbiamo scoperto che ZER attenua l'espressione della proteina MITF e tirosinasi indotta da SCF rispettivamente 2-4 h e 24-48 h dopo la stimolazione SCF (Figura 2A). Inoltre, l'espressione genica dei geni correlati alla melanogenesi, come MITF, tirosinasi e proteina 1 correlata alla tirosinasi (TYRP1) è stata soppressa nelle cellule G361 trattate con ZER (Figura 2B, C). Questi risultati hanno rivelato il tempo di picco per l'espressione dei geni correlati alla melanogenesi sulla stimolazione SCF; l'induzione massima dell'mRNA MITF è stata osservata entro 1-2 ore e si è osservato che i livelli di mRNA di tirosinasi e TYRP1 raggiungevano il loro massimo 24-48 ore dopo la stimolazione SCF.

2.3. Zerumbone sopprime i geni melanogeni e l'espressione degli enzimi nelle cellule B16F10 del topo

Per studiare il meccanismo molecolare mediante il quale ZER sopprime la melanogenesi, abbiamo misurato l'espressione genica del fattore di trascrizione della melanogenesi, MITF, e dei suoi geni bersaglio, come la proteina 1 correlata alla tirosinasi (TYRP1), la tirosinasi e la proteina 2 correlata alla tirosinasi (TYRP2) in assenza o presenza di ZER. Poiché il tempo di picco per l'espressione dei geni correlati alla melanogenesi sulla stimolazione SCF e -MSH è noto rispettivamente per le cellule di melanoma umano G361 (Figura 2) e B16F10 di topo [4], abbiamo ulteriormente misurato l'espressione di MITF, tirosinasi, TYRP1 e TYRP2 in cellule di melanoma di topo B16F10 trattate con ZER dopo 2 ore o 48 ore di incubazione con -MSH. La Figura 3A mostra che ZER è sufficiente per attenuare l'espressione di MITF, TYRP1, TYRP2 e tirosinasi indotta da -MSH nelle cellule B16F10. Allo stesso modo, i livelli di espressione della proteina MITF, tirosinasi e TYRP2 sono diminuiti dopo il trattamento con ZER. La fosforilazione di CREB mediata dalla proteina chinasi A (PKA) è un importante percorso di segnalazione che aumenta il MITF a livello trascrizionale dopo stimolazione con -MSH [4]. Pertanto, qui, abbiamo analizzato se la diminuzione della fosforilazione di CREB da parte di ZER potesse mediare la soppressione del MITF. Abbiamo scoperto che la fosforilazione di CREB indotta da MSH non è stata influenzata dal trattamento ZER, suggerendo che ZER sopprime l'espressione MITF indotta da MSH indipendentemente dall'asse della via di segnalazione PKA-CREB (Figura 3B). Poiché la tirosinasi è un enzima limitante la velocità, che regola la sintesi della melanina [2,4,11], abbiamo ulteriormente analizzato i livelli di proteina tirosinasi intracellulare e la sua attività enzimatica dopo il trattamento con arbutina, acido cogico e ZER. La Figura 3C mostra che ZER riduce sufficientemente i livelli di proteina tirosinasi indotta da -MSH nelle cellule B16F10. Inoltre, la Figura 3D rivela che 10 µM ZER sopprime in modo più efficace l'ossidazione della L-DOPA rispetto agli inibitori della tirosinasi, all'arbutina e all'acido cogico, suggerendo che l'ossidazione della L-DOPA a dopachinone attraverso l'attività enzimatica della tirosinasi è soppressa nelle cellule trattate con ZER . Questi risultati dimostrano che ZER attenua la melanogenesi mediata da -MSH sopprimendo l'espressione genica di MITF, un fattore di trascrizione associato alla melanogenesi e dei suoi geni bersaglio.

2.4. L'effetto anti-melanogenico di Zerumbone avviene attraverso la fosforilazione di ERK1/2

È noto che l'attivazione della protein chinasi B (AKT) e delle chinasi extracellulari regolate dal segnale (ERK1/2) da parte di fattori di crescita o stimoli melanogenici sopprime la melanogenesi attraverso la ridotta espressione del MITF e dei suoi geni bersaglio [11]. La fosforilazione del MITF a Ser73 e Ser409 in risposta alla via di segnalazione ERK1/2 promuove la sua degradazione dipendente dal proteasoma [17,18]. Pertanto, abbiamo studiato se ZER regola la fosforilazione di ERK1/2 nel topo B16F10 e nelle cellule di melanoma umano G361. Una maggiore fosforilazione di ERK1/2 (p-ERK1/2) ma non ERK1/2 totale (T-ERK1/2) è stata osservata durante il trattamento con ZER in modo dipendente dal tempo e dalla dose (Figura 4A, B). È interessante notare che la fosforilazione di ERK1/2 è stata osservata rapidamente aumentata entro 10-30 minuti e 1-2 ore dopo il trattamento ZER nelle cellule di melanoma di topo B16F10 e G361 umane (Figura 4A). Tuttavia, la fosforilazione di AKT e MEK non è stata osservata durante il trattamento con ZER, suggerendo che la fosforilazione di ERK1/2 indotta da ZER può sopprimere il MITF (Figura 4B). Poiché la fosforilazione di ERK1/2 promuove la fosforilazione e la degradazione proteasomica del MITF [17,18], abbiamo studiato se l'inibitore del proteasoma previene la riduzione del MITF da parte di ZER. La soppressione del MITF da parte di ZER non è stata osservata in presenza di MG132, confermando che ZER diminuisce l'espressione di MITF attraverso la degradazione proteasomica (Figura 4C). Successivamente, abbiamo studiato se ZER fosforila MITF a Ser73, che è il residuo bersaglio di ERK1/2. Per rilevare il MITF fosforilato, le cellule sono state esposte a -MSH e MG132. Qui, abbiamo scoperto che il MITF fosforilato (Ser73) era significativamente aumentato da ZER in presenza di -MSH e MG132 (Figura 4D). U0126, un inibitore selettivo della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) [19], ha abolito la fosforilazione del MITF indotta da ZER (Figura 4D). Inoltre, i livelli totali di proteina MITF nei lisati di cellule intere (WCL) non sono stati alterati da ZER e U0126 in presenza di MG132 (Figura 4D). Questi risultati indicano che la fosforilazione del MITF (Ser73) mediata da ERK1/2- e la degradazione del proteasoma sono un meccanismo critico nella soppressione del MITF mediata da ZER. Inoltre, la Figura 4E mostra che l'U0126 ha ripristinato in modo significativo i livelli ridotti di proteina MITF nelle cellule trattate con ZER. Coerentemente, la diminuzione del contenuto di melanina intracellulare da parte di ZER è stata ripristinata da U0126 a circa il 40 percento (Figura 4F), suggerendo che l'attivazione di ERK1/2 è necessaria per l'effetto anti-melanogenico di ZER.

2.5. Effetto anti-melanogenico degli estratti di Zingiber Officinale (ZO).

Lo ZER è un fitochimico derivato da diverse specie vegetali della famiglia delle Zingiberaceae, come Zingiber zerumbet e Zingiber officinal [12]. Pertanto, inizialmente abbiamo misurato la vitalità cellulare in assenza o presenza di estratto di ZO nelle cellule B16F10 e HaCaT. La figura 5A mostra che la vitalità cellulare non è stata alterata dal trattamento con estratto di ZO. Abbiamo ulteriormente analizzato gli effetti anti-melanogenici dell'estratto di Zingiber officinal (ZO). Poiché l'espressione di MITF e dei suoi geni melanogenici bersaglio sono stati diminuiti da ZER attraverso la via di segnalazione ERK1/2 attivata (Figure 2 e 3), abbiamo verificato se l'estratto di ZO sopprime il MITF indotto da MSH e la sua espressione di proteine ​​melanogeniche bersaglio nelle cellule B16F10. Simile all'effetto anti-melanogenico di ZER, MITF, tirosinasi e TYRP2 indotti da -MSH sono stati significativamente ridotti dall'estratto ZO in modo dose-dipendente (Figura 5B). È interessante notare che la fosforilazione di ERK1/2 è stata aumentata anche nelle cellule trattate con estratto di ZO (Figura 5B). L'espressione di MITF e dei suoi geni bersaglio, come tirosinasi, TYRP1 e TYRP2, è stata significativamente ridotta dopo il trattamento dell'estratto di ZO di 5 µg/µL (Figura 5C). Inoltre, il contenuto di melanina sia extracellulare che intracellulare è stato significativamente ridotto a circa il 40 percento dopo il trattamento dell'estratto di ZO di 5 μg/μL (Figura 5D). Inoltre, è stata osservata una ridotta attività della tirosinasi nelle cellule trattate con estratto di ZO (Figura 5E). Questi risultati suggeriscono che l'estratto di Zingiber officinal (ZO) sopprime la melanogenesi attenuando l'espressione genica melanogenica mediata dal MITF.

Per maggiori informazioni: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501