MicroRNA nello sviluppo e nelle malattie dei reni Ⅲ

MiRNA nel tumore di Wilms

Tumore di Wilms,Onefroblastoma, è l'infanzia più comunecancro renale, con un'incidenza di 1 bambino su 10,000 nel Nord America (111). Si tratta principalmente di una malattia sporadica, anche se forme familiari si verificano in circa l'1%-2% dei casi (112, 113). I tumori di Wilms derivano da una nefrogenesi aberrante, dove i precursori renali embrionali pluripotenti non riescono a differenziarsi e a persisterein modo anomalo nella vita postnatale(111, 114, 115). Questi tumori istologicamente si assomiglianosviluppo dei renicon unmorfologia disturbata(116), e mutazioni nei geni coinvolti nella nefrogenesi fetale, inclusi WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) e TP53 (123, 124), sono associati a circa il 40% dei casi Tumori di Wilms (125). Studi recenti che hanno utilizzato il sequenziamento dell’intero genoma e dell’intero esoma dei tumori di Wilms hanno identificato nuove mutazioni nei geni a rischio di cancro (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), geni che codificano per proteine ​​che mediano le modifiche degli istoni durante la nefrogenesi (BCOR, MAP3K4) (126 ) e geni che elaborano i miRNA (121, 122, 128, 129).

QUANTO TEMPO IMPIEGA LE CISTANCHE A FUNZIONARE SUI PAZIENTI CON MALATTIE RENALI?

Tra i geni che processano i miRNA, sono state riportate mutazioni in DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 e XPO5 (codifica per l'exportina 5) nei tumori di Wilms naive al trattamento e trattati con chemioterapia neoadiuvante (Figura 3) (121, 122, 128, 129 ). Circa il 33% dei tumori di Wilms esaminati presenta mutazioni deleterie nei geni della via di elaborazione dei miRNA (128). Una mutazione ricorrente dell'hotspot (E1147K) in un residuo legante met al (Mg2+) del dominio RNasi IIIb di DROSHA, che sembra essere esclusivo del tumore di Wilms, abolisce l'attività catalitica di questo dominio, determinando una mutazione incompleta scissione dei pri-miRNA e ridotta maturazione dei miRNA (128). Le mutazioni dell'hotspot somatico che colpiscono il dominio RNasi IIIb di DICER1 compromettono l'elaborazione dei miRNA 5p (quelli derivati ​​dal braccio 5' della forcina pre-miRNA) (129) e si trovano spesso come mutazioni di "secondo successo" che agiscono in tandem con DICER1 mutazioni germinali che inducono la tumorigenesi di Wilms nella sindrome DICER1 (un disturbo che aumenta la suscettibilità a una varietà di tumori) (130-132). Non è chiaro il motivo per cui la compromissione della funzione DICER1 nei tumori di Wilms determini una nefrogenesi persistente e aberrante, a differenza della perdita di Dicer1 nei progenitori del nefrone di topo, che causa un aumento dell'apoptosi e la cessazione prematura della nefrogenesi (72–75). Alcune potenziali possibilità includono che l'attività di dosaggio genico potrebbe essere cruciale nel determinare la sopravvivenza cellulare o che le mutazioni nel dominio RNasi IIIb potrebbero influenzare la specificità del legame del miRNA da parte di DICER1.

Le mutazioni nei geni che elaborano i miRNA sono associate alla downregulation di importanti miRNA, inclusi i membri delle famiglie miR-200 (121) e let-7 (Figura 3) (121, 129). Lasciamo che i miRNA -7 e la proteina Lin28 legante l'RNA funzionino di concerto per controllare i tempi di cessazione della nefrogenesi murina, possibilmente attraverso la regolazione del gene che promuove la crescita Igf2 (133). La sovraespressione di Lin28 durante lo sviluppo renale provoca l'espansione dei progenitori nefrogenici, inibendo la loro onda finale di differenziazione, che culmina nella trasformazione neoplastica che ricorda molto il tumore di Wilms umano (134). L'aumento del numero di copie di DNA di LIN28B e la perdita di copie di DNA di let-7a sono stati osservati rispettivamente nel 25% e nel 46% dei campioni di tumore di Wilms umano (126). In linea con queste osservazioni, le mutazioni germinali nel gene umano DISL3L2, che codifica per un'esoribonucleasi responsabile della degradazione delle forme preprocessate di let-7, causano la sindrome di Perlman e la predisposizione al tumore di Wilms (135, 136). La sindrome di Perlman è una sindrome da crescita eccessiva congenita caratterizzata da macrosomia, polidramnios, dismorfismi facciali, displasia renale e nefroblastomatosi (una lesione precursore del tumore di Wilms) (137). Tra i bambini con sindrome di Perlman che sopravvivono oltre il periodo neonatale, il 64% sviluppa il tumore di Wilms (138). È interessante notare che delezioni complete o parziali di DISL3L2 sono state riscontrate in circa il 30% dei tumori sporadici di Wilms esaminati (136).

Uno studio recente ha rafforzato il significato della rete di regolamentazione dei miRNA nell'eziologia del tumore di Wilms. Gli autori hanno scoperto che il gene dell'adenoma pleiomorfo 1 (PLAG1) è uno dei geni più costantemente sovraregolati nei tumori di Wilms con mutazioni nei geni di elaborazione dei miRNA (125). L'espressione ectopica di PLAG1 nel rene di topo in via di sviluppo provoca neoplasia, che è accompagnata dalla transattivazione del suo gene bersaglio, l'oncogene del tumore di Wilms IGF2. miR-16 e miR-34, che sono sottoregolati nei tumori di Wilms, sono stati identificati come potenziali regolatori dell'espressione di PLAG1 (125). La tabella 2 riassume altri studi che hanno riportato un'espressione aberrante di miRNA specifici associati all'eziologia del tumore di Wilms. È interessante notare che questi miRNA possono funzionare come oncogeni (chiamati oncomiR) o soppressori tumorali nel contesto dello sviluppo del tumore di Wilms, a seconda della natura dei loro bersagli.

MiRNA come potenziali biomarcatori e agenti terapeutici

A parte la loro localizzazione intracellulare, i miRNA sono presenti in quantità significative anche nei fluidi biologici, inclusi sangue, plasma, urina, latte materno e saliva (139). Questi miRNA circolanti si trovano impacchettati in microparticelle (esosomi, microvescicole e corpi apoptotici) (140, 141), coniugati con proteine ​​AGO (142) o nucleofosmina 1 (143), o caricati in HDL (144), che li rendono notevolmente stabile anche in condizioni sfavorevoli, come ebollizione, variazioni estreme del pH, conservazione prolungata e cicli multipli di congelamento-scongelamento (145, 146). Pertanto, le firme dei miRNA nei fluidi biologici possono riflettere associazioni con condizioni fisiologiche o patologiche (147). Insieme, queste caratteristiche rendono i miRNA circolanti attraenti per l’uso come biomarcatori non invasivi per la diagnosi e la prognosi delle malattie.

I miRNA circolanti possono essere estratti direttamente da fluidi biologici non frazionati o preparazioni di vescicole lari extracellulari utilizzando kit di estrazione disponibili in commercio (148) o TRIzol (149). Dopo l'isolamento, i miRNA possono essere conservati a –70 gradi e rimanere stabili fino a 1 anno (148). Sono disponibili diverse piattaforme per la profilazione dei miRNA, tra cui l'ibridazione di microarray, la qPCR e il sequenziamento di nuova generazione (150). Microarray e qPCR sono le metodologie più frequentemente utilizzate per studiare l'espressione di miRNA conosciuti (151). Entrambi i metodi hanno il vantaggio di essere semplici da usare, relativamente rapidi dall'etichettatura dell'RNA alla generazione dei dati e relativamente convenienti (152). Tuttavia, si basano sulla disponibilità e sull'annotazione accurata delle sequenze di miRNA nei database per la progettazione di sonde e primer (150). Sebbene più costoso, il sequenziamento di nuova generazione consente il rilevamento simultaneo di specie di miRNA sia note che nuove e offre un'elevata sensibilità (153). Inoltre, la risoluzione del singolo nucleotide del sequenziamento di nuova generazione consente l’identificazione degli isomiR, che sono isoforme mature di miRNA che differiscono da quelle canoniche per lunghezza, sequenza o entrambi (154, 155), che modificano la specificità di targeting del miRNA ( 156).

Diversi studi hanno studiato il potenziale dei miRNA circolanti come biomarcatori per le malattie renali pediatriche (157-160). Ad esempio, uno studio ha identificato 14 miRNA che erano significativamente sovraregolati nel siero di pazienti con tumore di Wilms. È interessante notare che una firma basata sull'espressione miR-100-5p e miR-130-3p potrebbe differenziare questi pazienti dai controlli sani con accuratezza, sensibilità e specificità (159). Sebbene i risultati di questo studio e di molti altri studi abbiano fornito una motivazione convincente per esplorare il potenziale dei miRNA circolanti come biomarcatori, è necessario superare diversi ostacoli sul campo prima di un’applicazione clinica diffusa. In primo luogo, esiste una relativa mancanza di consenso tra gli studi probabilmente a causa dell'assenza di una metodologia standardizzata per la purificazione (161) e l'analisi dei campioni (ad esempio, differenze nelle piattaforme di profilazione dei miRNA, rif. 162, 163; o differenze nella libreria smRNA-Seq metodi di preparazione, rif. In secondo luogo, vi è la mancanza di studi su campioni di grandi dimensioni e di indagini dettagliate su specificimalattie.Un altro aspetto importante è che l'influenza di variabili confondenti come età, sesso e fattori esterni (ad esempio tabacco, alcol, ecc.) sui profili miRNA non è stata completamente esplorata (per una revisione approfondita, fare riferimento al rif. 165).

Dal punto di vista terapeutico, diversi farmaci basati su miRNA sono attualmente in fase di sperimentazione clinica ma non hanno ancora ottenuto l’approvazione della FDA (166, 167). Gli approcci principali per la terapia con miRNA prevedono il ripristino dei livelli di miRNA utilizzando imitatori di miRNA o l'inibizione di miRNA specifici utilizzando antagomiR (168). Una delle sfide associate allo sviluppo di terapie basate sui miRNA è l’identificazione dei candidati miRNA per ciascuna malattia. Poiché più miRNA sono disregolati in ciascuna malattia, dovrebbe essere eseguita un'attenta analisi dei campioni dei pazienti in combinazione con test in vitro e in vivo che affrontino i meccanismi patofisiologici influenzati dai miRNA in questione per restringere i miRNA candidati per l'intervento terapeutico (168, 169). Un'altra sfida riguarda lo sviluppo di strategie per migliorare la stabilità in vivo e la somministrazione di farmaci sito-specifici con tossicità minima ed effetti fuori bersaglio. Le molecole di RNA sono chimicamente instabili a causa della presenza del gruppo 2′-idrossile sull'anello pentoso. Per fornire maggiore stabilità e protezione dalle nucleasi presenti nel siero o nel compartimento endocitico delle cellule, le aziende biotecnologiche hanno generato molecole di RNA con modifiche chimiche (gruppo 2′-O-metil, fosforotioato o acidi nucleici bloccati) nella loro spina dorsale (166). Per quanto riguarda la somministrazione in vivo, le tecnologie includono quelle basate sui lipidi (ad esempio, nanoparticelle lipidiche e liposomi neutri) e dendrimeri coniugati a una porzione mirata, tra molte altre strategie. Le principali sfide associate ai sistemi di rilascio di miRNA sono l'immunotossicità e l'affinità target-specifica verso il sito della malattia (170). Strategie di somministrazione mediante vari metodi di somministrazione (iniezioni intraperitoneali, endovenose e sottocutanee) o utilizzando vettori contenenti promotori specifici e inducibili per il rene sono state utilizzate con successo per il targeting selettivo del rene e per evitare potenziali effetti avversi in altri tessuti e organi (171, 172). ).

Tabella 2. Elenco dei miRNA alterati nel tumore di Wilms

Elenco di miRNA, campioni/campioni analizzati, livelli di miRNA osservati in questi campioni/campioni rispetto ai controlli appropriati, gene bersaglio, conseguenze delle modifiche dei miRNA e riferimenti. CAMKK2, proteina chinasi chinasi 2 calcio/calmodulina-dipendente; CDC7, ciclo di divisione cellulare 7; CDH1, caderina 1; CREB1, proteina legante l'elemento di risposta del cAMP 1; EYA1, occhi assenti, omologo 1; E2F3, fattore di trascrizione E2F 3; FRS2, substrato 2 del recettore FGF; Glut1, trasportatore del glucosio 1; IGF1R, recettore IGF1; Jag1, frastagliato1; MET, transizione mesenchimale-epiteliale; MKNK1, serina / treonina chinasi 1 che interagisce con MAPK; Omologo di PTEN, fosfatasi e tensina; PUMA, p53-modulatore sovraregolato dell'apoptosi; p73, proteina tumorale p73; SIX1, sineoculis homeobox omologo 1; TGFBR1, recettore TGF-1; WT, tumore di Wilms.

Riepilogo

C'è stata un'esplosione di informazioni riguardanti la biogenesi dei miRNA, la regolazione dell'espressione dei miRNA e la funzione dei miRNA sin dalla scoperta iniziale dei miRNA nel 1993 (6, 7). Ciò è stato accompagnato da una sempre maggiore comprensione di come funzionano i miRNA sia nella fisiologia normale che nella fisiopatologia di molte malattie. È diventato chiaro che la disregolazione dell’espressione dei miRNA interrompe lo sviluppo precoce del rene ed è implicata nella patogenesi delle malattie renali dello sviluppo, come il tumore CAKUT e Wilms. Con i recenti sviluppi nell’uso dei miRNA come biomarcatori e come nuovi bersagli farmacologici, le conoscenze su come i miRNA regolano lo sviluppo e le malattie dei reni sono fondamentali per capire come potrebbero essere utilizzati in nuovi approcci diagnostici e terapeutici a queste malattie. Per realizzare pienamente questi sforzi, sono fondamentali studi futuri che identifichino la funzione di miRNA specifici nello sviluppo renale, oltre alle tecnologie per ottimizzare il targeting terapeutico di piccoli oligonucleotidi nel rene

Ringraziamenti

Il laboratorio di JH è sostenuto da sovvenzioni del NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK125015 e R01DK102843). DMC è stato sostenuto dal Nephrotic Syndrome Study Network Career Development Award e dalla borsa di studio post-dottorato del Consiglio consultivo per la ricerca dell'ospedale pediatrico di Pittsburgh. MT è stato supportato dal programma di tirocinio di ricerca estiva dell'Università di Pittsburgh (R25DK119180). Le figure sono state create con BioRender.com. Indirizzare la corrispondenza a: Jacqueline Ho, Divisione di Nefrologia, Dipartimento di Pediatria, UPMC Children's Hospital di Pittsburgh, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, USA. Telefono: 412.692.9440; E-mail: jacqueline.ho2@chp.edu.

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