MicroRNA nello sviluppo e nelle malattie dei reni Ⅱ

Sviluppo del rene

ILrene dei mammiferi(o metanefro) è un organo vitale che svolge un ruolo fondamentale nelescrezione dei rifiuti metabolici,regolazione del volume del liquido extracellulare, Emantenimento dell'elettrolitoEomeostasi acido-base. Inoltre, il rene produce ormoni importanti, come ad eseritropoietina, calcitriolo,renina, Eprostaglandine(48). La capacità funzionale del rene è correlata al numero di nefroni funzionanti che si formano durante lo sviluppo del rene prima della nascita, chiamato anche dotazione nefronale. Ogni rene umano contiene in media 1,000,000 nefroni, anche se questo numero varia considerevolmente, con stime che vanno da 200,000 a 2,000,{{8 }} nefroni (49, 50). Coninvecchiamento,perdita della riserva funzionale del nefronesi verifica nel tempo (51, 52); pertanto, una bassa dotazione nefronale alla nascita è associata ad un aumento del rischio di sviluppare ipertensione e malattia renale cronica (CKD) più avanti nella vita (53-55). Inoltre, CAKUT, che porta a una diminuzione della dotazione e della funzione nefronale, è la principale causa di insufficienza renale nei bambini, con conseguente significativa morbilità e mortalità associata al trapianto e alla dialisi (56, 57). Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della determinazione del numero di nefroni e della normale formazione dei nefroni fornisce informazioni su nuove strade per prevedere, prevenire e trattare la malattia renale infantile.

QUANTO TEMPO IMPIEGA LE CISTANCHE A FUNZIONARE SUI PAZIENTI CON MALATTIE RENALI?

Sviluppo del rene metanefricoinizia intorno al giorno embrionale 10,5 (E10.5) nei topi e intorno alla quinta settimana di gestazione negli esseri umani (58). In risposta ai segnali induttivi provenienti dal mesenchima metanefrico, la gemma ureterale si estende dall'estremità caudale del dotto di Wolff e invade il mesenchima adiacente (Figura 2). Contemporaneamente, i morfogeni emanati dalla gemma ureterale inducono la condensazione del mesenchima metanefrico per formare il mesenchima a cappuccio (chiamato anche progenitori del nefrone) attorno alle punte della gemma ureterale. Man mano che la nefrogenesi progredisce, la gemma ureterale subisce cicli successivi di ramificazione, allungamento e differenziazione per generare i dotti collettori del rene. Una sottopopolazione di progenitori del nefrone subisce una transizione mesenchimale-epiteliale per formare vescicole renali, che dopo la polarizzazione e l'allungamento diventano strutture corporee a forma di virgola e S. Infine, la porzione distale del corpo a forma di S si fonde con il dotto collettore per formare un nefrone funzionale (59–61). Il corpo a forma di S subisce un'ulteriore differenziazione per formare i tipi cellulari maturi del nefrone, oltre al dotto collettore. Le cellule progenitrici stromali Foxd1+ sono adiacenti ai progenitori del nefrone nella zona corticale esterna o nefrogenica del rene in via di sviluppo (Figura 2) (62). Si ritiene che i segnali provenienti dallo stroma corticale inibiscano l'espansione delle cellule progenitrici del nefrone e ne stimolino la differenziazione, poiché l'ablazione dello stroma renale determina una ridotta differenziazione dei progenitori del nefrone (63). Le cellule progenitrici Foxd1+ danno origine a tutte le cellule stromali del rene metanefrico, comprese le cellule interstiziali corticali e midollari renali, i periciti, i fibroblasti perivascolari, le cellule mesangiali e le cellule muscolari lisce vascolari (64, 65). Perturbazioni in qualsiasi fase di questo processo possono portare a CAKUT, la principale causa di insufficienza renale cronica infantile (66, 67).

Il nefrone maturo è composto da un glomerulo che funge da unità di filtrazione e da un compartimento tubolare di assorbimento posteriore suddiviso in un tubulo contorto prossimale, un'ansa di Henle, un tubulo contorto distale e un dotto collettore (Figura 2). La barriera di filtrazione del glomerulo (che comprende l’endotelio fenestrato, la membrana basale glomerulare, i processi del piede e i diaframmi a fessura dei podociti) consente la filtrazione del plasma e di piccoli soluti, trattenendo selettivamente proteine ​​come albumina e immunoglobuline nel sangue (68, 69). Nel frattempo, il compartimento di riassorbimento tubulare è responsabile del mantenimento dell’omeostasi dell’acqua, del riassorbimento dei soluti (inclusi sodio, potassio, calcio, fosforo, magnesio, glucosio e molti altri) e dell’escrezione di acidi e altri rifiuti.

MiRNA nel rene in via di sviluppo

Negli studi su topi transgenici condizionali, i miRNA sono emersi come regolatori critici della morfogenesi renale in più linee cellulari. Gli studi iniziali che valutavano un ruolo funzionale dei miRNA nello sviluppo renale utilizzavano la delezione condizionale di Dicer (70) in diverse linee renali. Tuttavia, è noto che Dicer ha anche ruoli indipendenti dai miRNA (71), il che ha complicato l'interpretazione di questi modelli. La delezione condizionale di Dicer nel mesenchima metanefrico precoce o nei progenitori del nefrone determina un'aumentata apoptosi dei progenitori del nefrone, livelli elevati della proteina proapoptotica Bim e la cessazione prematura della nefrogenesi (72-75) (Tabella 1). È interessante notare che la perdita dell'espressione di Bim nei progenitori del nefrone carenti di Dicer diminuisce l'apoptosi e ripristina parzialmente la formazione del nefrone. Due miRNA espressi nei progenitori del nefrone, miR-17 e miR-106, sono stati identificati come soppressori dell'espressione BIM (76). Insieme, questi risultati indicano che i miRNA controllano l'equilibrio tra sopravvivenza e apoptosi nei progenitori dei nefroni per garantire la formazione di un numero corretto di nefroni durante la nefrogenesi.

Figura 2. Illustrazione schematica delle fasi di sviluppo del rene metanefrico. I segnali provenienti dall'abbozzo ureterale innescano la condensazione del mesenchima metanefrico per formare un cappuccio di progenitori del nefrone (mesenchima a cappuccio) attorno alle punte dell'abbozzo ureterale. Il mesenchima del cappuccio subisce una transizione mesenchimale-epiteliale per formare vescicole renali, che si sviluppano sequenzialmente in corpi a forma di virgola e S. Queste strutture si collegano al peduncolo ureterale, che dà origine al dotto collettore. Le cellule nel dominio prossimale del corpo a forma di S si differenziano in cellule epiteliali specializzate del corpuscolo renale maturo (cioè podociti e cellule della capsula di Bowman), mentre le cellule nelle porzioni media e distale si differenziano nei segmenti tubulari del nefrone (tubuli prossimali , anse di Henle e tubuli distali). Creato con BioRender.com.

La delezione condizionale di Dicer nella linea della gemma ureterale determina uno spettro di anomalie che somigliano fortemente a CAKUT, inclusa la displasia renale e lo sviluppo di cisti del dotto collettore (73, 77, 78). La cessazione prematura della morfogenesi della ramificazione (in risposta alla ridotta espressione di Wnt11 e c-Ret dalla gemma ureterale) è probabilmente il principale fattore che contribuisce alla displasia renale (73). L'inizio della formazione delle cisti avviene intorno a E15.5 ed è associato a difetti nella lunghezza delle ciglia primarie, aumento della morte cellulare per apoptosi ed eccessiva proliferazione cellulare (73). Poiché Dicer ha importanti ruoli indipendenti dai miRNA nella cellula, la delezione condizionale di Dgcr8 è stata utilizzata per confermare che i fenotipi osservati nei modelli condizionali Dicer-knockout sono effettivamente il risultato della perdita di miRNA. Animali con delezione di Dgcr8 nel nefrone distale e derivati ​​del dotto collettore sviluppano idronefrosi e cisti del dotto collettore (79), un fenotipo simile a CAKUT che assomiglia alla perdita dell'attività di Dicer nella linea della gemma ureterale.

Studi condotti da due gruppi indipendenti hanno dimostrato che l'ablazione di Dicer dalla linea dello stroma renale Foxd1+ e dei suoi derivati ​​determina uno spettro di anomalie renali, con risultati coerenti riguardanti reni ipoplastici, numero glomerulare ridotto, maturazione glomerulare anomala e difetti vascolari modellazione (80, 81). Sebbene entrambi i gruppi abbiano descritto fenotipi ampiamente concordanti utilizzando modelli murini simili, sono state notate due differenze distinte. Nakagawa et al. osservato una mancanza del midollo interno e della papilla, nonché una diminuzione della zona nefrogenica (80). Al contrario, Phua et al. hanno mostrato un'espansione della popolazione progenitrice del nefrone e una papilla renale preservata (81). Nakagawa et al. ha proposto che questi difetti siano correlati all'interruzione della segnalazione del percorso Wnt, con conseguenti cambiamenti nella migrazione e proliferazione delle cellule stromali, a causa della sottoregolazione dei miRNA delle cellule stromali, miR-214, miR-199a{{7 }}p e miR-199a-3p (80). Lo studio di Phua et al. ha suggerito che i cambiamenti nei programmi apoptotici (inclusa l'aumentata espressione dei geni effettori Bim e p53) contribuiscono ai difetti fenotipici (81). È concepibile che le differenze di background genetico e/o l'efficienza della ricombinazione mediata da Cre possano essere responsabili delle differenze descritte da questi studi. Tuttavia, i fenotipi descritti sono coerenti con i noti ruoli sfaccettati dello stroma renale nello sviluppo del rene e i meccanismi alla base di questi fenotipi sono probabilmente complessi data la natura della delezione di Dicer. Sono necessari ulteriori studi che esaminino miRNA specifici in varie sottopopolazioni stromali per definire meglio i meccanismi di regolazione in gioco.

Lavori più recenti hanno affrontato la questione della funzione di miRNA specifici sia nei progenitori del rene che del nefrone in via di sviluppo. Utilizzando un modello di cellule staminali embrionali umane, Bantounas et al. ha mostrato che l'inibizione del cluster miR-199a~214 provoca glomeruli dismorfici, tubuli prossimali aberranti, diminuzione dell'espressione di WT1 e aumento dei capillari interstiziali negli organoidi simili ai reni (82). È interessante notare che la delezione globale del miR-210 sensibile all'ipossia determina un deficit nefronale specifico per il maschio (83). Ad esempio, la delezione condizionale del cluster miR-17~92 nei progenitori dei nefroni e dei loro derivati ​​nei topi compromette la proliferazione delle cellule progenitrici e riduce il numero di nefroni in via di sviluppo. Di conseguenza, i topi mutanti sviluppano proteinuria, fibrosi renale e funzionalità renale compromessa (84). Livelli disregolati del gene bersaglio miR-17~92, CFTR, sono implicati nella proliferazione difettosa delle cellule progenitrici e nella ridotta dotazione nefronale in questo modello murino (85).

Il sequenziamento di piccoli RNA (smRNA-Seq) è stato sempre più utilizzato per profilare i modelli di espressione dei miRNA e per la scoperta di nuove specie di miRNA. smRNA-Seq di cellule mesenchimali nefrogeniche E15.5 ha identificato 162 miRNA annotati che sono espressi in modo differenziale in questa popolazione cellulare rispetto ai reni interi e 49 nuove specie di miRNA (86). È interessante notare che i livelli di miRNA della famiglia miR-200 erano significativamente ridotti nei progenitori del nefrone. Dato che i membri della famiglia miR-200 sono regolatori chiave della transizione mesenchimale-epiteliale nel dotto collettore (87), ipotizziamo che la loro espressione potrebbe essere strettamente regolata per garantire la normale differenziazione epiteliale dei progenitori del nefrone durante lo sviluppo renale.

Funzione dei miRNA nel nefrone maturo

Oltre a essere necessari durante lo sviluppo renale, i miRNA regolano numerosi processi biologici nelle principali linee cellulari che formano il nefrone maturo (69, 88–91). In linea con questo, è stata descritta l'espressione segmento-specifica dei miRNA lungo il nefrone, inclusi miR-143 e miR-195a nel glomerulo, miR-107 e miR{{7} }a nel tubulo prossimale, miR-193 e miR-378a nel tratto spesso ascendente, miR-874 e miR-155 nel tubulo contorto distale e miR{{ 12}}c nel condotto di raccolta (87). Inoltre, studi funzionali nei compartimenti del nefrone maturo supportano ruoli distinti per i miRNA.

Topi privi di Dicer o Drosha nei podociti mostrano marcata proteinuria, glomerulosclerosi e rapida progressione verso l'insufficienza renale, secondaria alla rottura della barriera di filtrazione glomerulare (90-93). Analisi in silico hanno rivelato che varie trascrizioni sovraregolate nei glomeruli mutanti contengono sequenze bersaglio per i membri della famiglia miR-30. Come tutti e quattro i membri della famiglia miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d e miR-30c{ {9}}) sono normalmente altamente espressi nei podociti, questi miRNA potrebbero essere responsabili delle anomalie dei podociti e della distruzione della barriera di filtrazione glomerulare nei topi mutanti (91).

In modo piuttosto sorprendente, la cancellazione di Dicer dai tubuli prossimali dei mammiferi postnatali non influisce sullo sviluppo, sull'istologia o sulla funzione renale, ma protegge dal danno da ischemia/riperfusione renale. I topi mutanti mostrano una migliore funzionalità renale, un ridotto danno renale, una minore apoptosi tubulare e una migliore sopravvivenza rispetto ai loro compagni WT (94). Ciò probabilmente riflette la "somma" dell'effetto della delezione di più miRNA nel tubulo prossimale, poiché altri lavori hanno da allora dimostrato che l'espressione di miRNA specifici è protettiva nel danno da ischemia/riperfusione renale (ad esempio, miR-16 e miR-21; mentre altri sono dannosi (ad esempio, miR-182; rif. 97).

Sebbene i miRNA sembrino essere superflui per la funzione del tubulo prossimale, sono essenziali per i nefroni distali e per l’omeostasi dei dotti collettori (79, 88, 98). La raccolta dell'inattivazione specifica del dotto di Dicer e di altri geni critici associati alla biogenesi dei miRNA (inclusi Dgcr8, Ago1, 2, 3 e 4) causa insufficienza renale nei topi adulti a causa della progressiva fibrosi tubulointerstiziale e dell'infiammazione interstiziale (88). Ciò è preceduto da una transizione epiteliale-mesenchimale parziale (EMT) delle cellule del dotto collettore e da una downregulation dei membri della famiglia miR-200, che inibiscono l'EMT (88). Allo stesso modo, l'ablazione di Dicer o Dgcr8 dal nefrone distale e dai derivati ​​della gemma ureterale, rispettivamente, provoca anomalie renali e insufficienza renale (78, 98), che sono in ultima analisi associate alla downregulation dei membri della famiglia miR-200 (98). L'aumentata espressione del gene bersaglio miR-200 Pkd1 in questi topi mutanti interrompe la tubulogenesi e produce strutture simili a cisti (98). Queste differenze nella richiesta di miRNA funzionali nei tubuli prossimali e nel nefrone/dotto collettore distale potrebbero essere spiegate dalla distribuzione segmentale dei miRNA lungo la lunghezza del nefrone e del dotto collettore nei reni WT (88).

La delezione di Dicer nelle cellule secernenti renina nell'apparato iuxtaglomerulare determina un deficit delle cellule iuxtaglomerulari, ridotti livelli di renina circolante con conseguente riduzione della pressione arteriosa, ridotta funzionalità renale, pattern a strisce di fibrosi interstiziale e anomalie vascolari (89). La riduzione delle cellule iuxtaglomerulari suggerisce la necessità di miRNA maturi per il mantenimento del loro fenotipo. Successivamente, miR-330 e miR-125b-5p sono stati identificati come potenziali candidati che inibiscono o promuovono, rispettivamente, il fenotipo della muscolatura liscia delle cellule iuxtaglomerulari (99).

Altre aree di ricerca attive sui miRNA nel danno renale acuto (8-10), nella malattia del rene policistico (11) e nel trapianto di rene (10), sono state affrontate in modo esauriente in altre revisioni recenti.

MiRNA nelle malattie renali pediatriche In questa sezione, forniamo una panoramica del ruolo dei miRNA nelle malattie renali dello sviluppo, compresi i tumori CAKUT e Wilms. I CAKUT sono tra le forme più frequenti di malformazioni alla nascita, colpendo circa 3-7 su 1000 nati vivi (100). L'interruzione dello sviluppo dei reni e del tratto urinario inferiore porta ad un ampio spettro di manifestazioni cliniche osservate nella CAKUT, comprese anomalie renali (cioè agenesia renale, ipoplasia e displasia renale e reni displastici multicistici), anomalie ureteropelviche (cioè ostruzione della giunzione ureteropelvica), sistema collettore duplex e anomalie della vescica e dell'uretra (101–103). Questa eterogeneità fenotipica è probabilmente dovuta a complesse interazioni tra fattori genetici, epigenetici e/o ambientali prenatali che influenzano lo sviluppo dei reni e del tratto urinario inferiore, con conseguente CAKUT (101). La maggior parte delle nostre attuali conoscenze sulla patogenesi di CAKUT deriva da modelli murini e forme sindromiche di CAKUT. Questi studi hanno portato all’identificazione di diversi geni CAKUT, molti dei quali sono implicati nello sviluppo precoce del rene, tra cui PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 e altri (101, 104, 105). Tuttavia, singole mutazioni o varianti del numero di copie nei geni codificanti proteine ​​non spiegano la maggior parte dei casi CAKUT (~80%) (101, 106).

Come accennato in precedenza, la deplezione di miRNA maturi da diversi lignaggi cellulari del rene in via di sviluppo nei modelli murini provoca anomalie renali che imitano il CAKUT umano (73, 74, 78, 79). Inoltre, le delezioni della linea germinale di MIR17HG, che codifica il cluster miR-17~92, causano la sindrome di Feingold di tipo 2 nell'uomo (107). Sebbene il fenotipo renale nei pazienti con sindrome di Feingold di tipo 2 con mutazioni MIR17HG rimanga indefinito, è stata segnalata un'incidenza del 18% di CAKUT nei casi di sindrome di Feingold associati a mutazioni MYCN (108, 109). Insieme, queste osservazioni suggeriscono che le mutazioni nei miRNA espressi durante lo sviluppo del rene potrebbero causare CAKUT negli esseri umani, in particolare perché molti miRNA sono altamente conservati tra topi e esseri umani.

Per verificare questa ipotesi, uno studio ha esaminato 1248 pazienti con CAKUT non sindromico provenienti da 980 famiglie e ha cercato mutazioni in 96 regioni dell'ansa staminale di 73 geni miRNA dello sviluppo renale (106). All'interno di questa coorte, sono stati identificati 31 individui con 17 diverse varianti a singolo nucleotide che colpiscono 16 diversi geni miRNA. Tra questi, due nuove varianti nei miRNA sono risultate potenzialmente patogene. MIR19B1 (un membro del cluster miR-17~92) era associato alla presenza di agenesia renale destra e MIR99A era associato a grave reflusso vescico-ureterale e ptosi renale. Questo numero sorprendentemente basso di varianti patogene candidate è in parte dovuto ai limiti di questo studio, poiché l'analisi ha tenuto conto solo delle mutazioni nei geni miRNA inclusi nell'approccio del gene candidato e non ha rilevato variazioni del numero di copie e ampi riarrangiamenti del DNA (106) .

In un approccio alternativo, i segmenti dell'uretere di pazienti con una varietà di CAKUT sono stati analizzati per l'espressione differenziale del trascritto tramite microarray, per la presenza di target di miRNA previsti bioinformatica e di miRNA maturi tramite qPCR (110). Utilizzando questo approccio su più fronti, sono stati identificati sette miRNA con potenziali ruoli in CAKUT e, tra questi, has-miR-144 era significativamente aumentato nei pazienti con CAKUT. L'analisi dell'ontologia genetica ha indicato che i geni bersaglio has-miR-144 previsti contribuiscono ai processi biologici coinvolti nello sviluppo di CAKUT, incluso lo sviluppo del tubo (22 geni bersaglio), lo sviluppo del sistema urogenitale (18 geni bersaglio), lo sviluppo dei reni (14 geni bersaglio) e sviluppo degli organi embrionali (18 geni bersaglio) (110).

Sono necessari ulteriori studi per definire i meccanismi molecolari alla base dei ruoli patogeni dei miRNA nel CAKUT. I risultati di tali studi saranno fondamentali per migliorare la cura dei pazienti affetti da CAKUT e prevenire la loro progressione verso la malattia renale cronica, fornendo un’adeguata consulenza genetica ai pazienti e alle loro famiglie e sviluppando nuove strategie terapeutiche.