Osteopontina del latte per lo sviluppo dell'intestino, dell'immunità e del cervello nei suini pretermine
Jun 14, 2022
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Livelli carenti di osteopontina del latte (OPN) nel latte artificiale possono in parte spiegare le differenze di sviluppo tra i bambini alimentati con latte artificiale o materno. Votiamo a favore delle dimensioni di una dieta a base di latte integrata con latte bovinoOPNmigliora l'intestino, l'immunità e lo sviluppo del cervello e lo ha testato in un modello di maiale pretermine. I suini pretermine partoriti con taglio cesareo (90% di gestazione) sono stati alimentati con latte bovino crudo (CON, n=19) o la stessa dieta integrata con una dose fisiologicamente rilevante di OPN (46 mg/(kg:d), n{ {3}}). Durante lo studio sono stati valutati gli endpoint relativi agli esiti clinici, l'immunità sistemica e lo sviluppo neurocognitivo e i tessuti intestinali sono stati raccolti il giorno 19. Il modello di crescita, lo sviluppo motorio iniziale e la maggior parte dei parametri immunitari sistemici erano simili tra OPN eCONmaiali. I suini OPN avevano rapporti villo-cripta più elevati rispetto ai suini CON e una maggiore conta di monociti e linfociti al giorno 8. Le funzioni digestive e di assorbimento intestinale e le prestazioni cognitive (test T-labirinto) erano simili tra i maiali OPN e CON. In conclusione, l'integrazione alimentare conOPNal di sopra dei livelli basali di latte bovino hanno indotto miglioramenti minori nella struttura intestinale e nell'immunità sistemica senza alcun effetto sulle prestazioni cognitive. Restano da determinare i livelli minimi di OPN negli alimenti per lattanti per garantire un adattamento ottimale nell'immediato periodo neonatale.
Parole chiave: osteopontina; proteine del latte bioattive; neonati pretermine; salute intestinale; immunità sistemica; sviluppo del cervello; cognizione
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1. Introduzione
L'ottimizzazione dei livelli di proteine bioattive negli alimenti per lattanti può aiutare a ridurre le differenze ben consolidate nello sviluppo e nella resistenza alle malattie tra i lattanti alimentati con latte artificiale e il latte materno[1-3]. L'osteopontina (OPN) è una proteina acida con elevata glicosilazione e fosforilazione considerata importante per stimolare lo sviluppo nell'immediato periodo neonatale ed è abbondantemente presente nel latte materno precoce[4-6]. Le concentrazioni di latte OPN variano notevolmente tra le specie e nel latte umano anche la variazione interindividuale tra le madri è elevata. Un calo durante il periodo di allattamento sembra tuttavia un'osservazione coerente [5,7]. In uno studio multicentrico, il livello mediano di OPN era di 160 mg/L a circa 13 settimane dopo il parto [7]. Il livello superiore del 25% di OPN nel latte materno era 230-495 mg/L, che è molto più alto dei livelli medi riportati per il latte bovino (~18 mg/L) o gli alimenti per lattanti (~9 mg/L)[ 4]. Attualmente, il latte bovino OPNi è disponibile in commercio e può quindi essere aggiunto agli alimenti per lattanti per raggiungere livelli simili a quelli che si trovano nel latte umano.
A causa del sito di legame dell'integrina (RDG) altamente conservato nell'OPN, ci si può aspettare che gli effetti biologici siano simili tra le specie [8]. Il frammento contenente la sequenza RDG è altamente resistente alla rottura a causa delle glicosilazioni vicine al motivo di legame dell'integrina [9], supportando così il potenziale bioattivo dell'OPN del latte nativo nell'intestino. In vitro, il latte OPN è in grado di stimolare la proliferazione cellulare intestinale ed esercitare attività antibatteriche come parte di un complesso con lattoferrina (LF), un'altra importante proteina bioattiva del latte [10,11]. Gli effetti benefici del latte OPN nell'intestino sono stati dimostrati anche in vivo. Lo sviluppo intestinale nelle scimmie rhesus appena nate è stato migliorato dall'OPN del latte bovino e il trascrittoma digiunale degli animali alimentati con latte artificiale integrato con OPN era simile a quello delle controparti allattate al seno [12]. Latte dieteticoEffetti OPN, sia localmente nell'intestino che sistemicamente a seguito di un minore assorbimento intestinale nei bambini, sono stati in parte attribuiti alla sua capacità di stimolare i livelli endogeni di OPN [5,13,14]. L'OPN si trova nella maggior parte dei tessuti e dei fluidi corporei dove esercita una varietà di funzioni come la biomineralizzazione e la modulazione immunitaria oltre a partecipare alla proliferazione cellulare, migrazione, adesione e opsonizzazione [8,10,15,16]. È noto che l'OPN regola l'equilibrio Th1/Th2, che nei neonati è sbilanciato verso una polarizzazione Th2 [17]. L'OPN possiede proprietà simili alle citochine e può stimolare l'immunità di tipo Th1 mediante induzione dell'espressione di IL-12 e inibizione della produzione di IL-10, la Th2citochina, nei macrofagi [18]. Inoltre, l'OPN può supportare la maturazione cerebrale, contribuendo potenzialmente al miglioramento delle funzioni cognitive nei bambini allattati al seno rispetto a quelli allattati artificialmente [19-21]. A sostegno di ciò, i cuccioli di topo alimentati con OPN hanno mostrato una migliore capacità di apprendimento e livelli di espressione più elevati delle proteine correlate alla mielinizzazione, tra cui la proteina di base della mielina e la glicoproteina associata alla mielina, e l'OPN ha anche migliorato la mielinizzazione in vitro [14,22,23]. Nei suini a termine, diverse regioni del cervello sono state interessate da un aumento del volume relativo a seguito dell'integrazione alimentare con latte bovino OPN, ma non sono stati osservati effetti sui parametri cognitivi [24].
Bambini pretermine (nascita<37 weeks="" of="" gestation)="" are="" particularly="" diet-sensitive="" due="" to="" their="" relatively="" immature="" gut,="" immune="" system,="" and="" brain.="" such="" infants="" are="" susceptible="" to="" developing="" both="" short-and="" long-term="" complications="" such="" as="" necrotizing="" enterocolitis="" (nec),="" feeding="" intolerance,="" infections,="" and="" impaired="" neurodevelopment="" [25-28].="" bovine="" milk="" opn="" supplementation="" has="" previously="" been="" shown="" to="" reduce="" nec="" severity="" in="" formula-fed="" preterm="" piglets="" [29],="" and="" other="" milk="" factors="" have="" proven="" to="" support="" brain="" structure="" and="" cognitive="" development,="" particularly="" in="" preterm="" newborns="" [30,31].="" on="" this="" background,="" we="" hypothesized="" that="" preterm="" newborns,="" fed="" a="" standard="" milk="" diet="" with="" relatively="" natural="" bioactivity,="" would="" benefit="" from="" further="" opn="" supplementation.="" following="" an="" initial="" in="" vitro="" demonstration="" of="" opn="" antimicrobial="" activity,="" we="" used="" diet-sensitive="" preterm="" pigs="" [32-34]to="" investigate="" if="" an="" opn-enriched="" bovine="" milk="" diet="" would="" improve="" gut,="" immunity,="" and="" brain="" development="" in="" the="" first="" three="" weeks="" after="" preterm="">
2. Materiali e metodi 2.1. Saggio antibatterico in vitro
In primo luogo, è stato utilizzato un test antibatterico [35] per valutare la bioattività diOPNquantificando la sua capacità di inibire la crescita o di uccidere lo Staphylococcus, cioè un comune patogeno Gram-positivo neonatale [36]. Lo stesso latte bovino integro non pastorizzato utilizzato come base per le diete enterali nello studio sui suini è stato scongelato e centrifugato consecutivamente a 500×g e 3000×8,4 gradi per 15 min, aspirando ogni volta lo strato acquoso per rimuovere il contenuto di grasso mentre minimizzando la perdita di proteine del latte [37]. A seguito del test di sterilità del latte bovino scremato, ilOPNpolvere (Lacprodan⑧ OPN-10, Arla Foods Ingredients, Viby, Danimarca) è stata disciolta a concentrazioni di 1,6 (la stessa quantità aggiunta il giorno 1 nello studio sui suini al latte OPN),2,8,5, 10 e 20 g /L, creando 6 diete di prova, compreso il latte bovino scremato non integrato, che sono state conservate in aliquote di 1 ml a -80 gradi fino all'analisi. I ceppi di coltura mid-log congelati [35] di S.epidermidis (WT1457 [38], gentilmente forniti dal Dr. Xiaoyang Wang, Università di Göteborg, Svezia) sono stati scongelati, centrifugati a 3200 × g e risospesi in soluzione fisiologica sterile prima dell'incubazione con le 6 diete di prova (oltre a un latte artificiale pronto per l'alimentazione pretermine, incluso come controllo negativo [1]) alla dose calcolata di 10 gradi e 106 UFC/mL per 2, 4,6 e 24 h a 37 gradi. Sono state determinate le dosi finali di inoculazione e la crescita batterica nelle diete di prova e negli alimenti per lattanti dopo diversi tempi di incubazione [35]. Sono stati eseguiti triplicati indipendenti del test antibatterico.
2.2. Animali e design sperimentale
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate e condotte in base a una licenza (licenza n. 2014-15-0201-00418) rilasciata dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali. Quarantotto suinetti (Danish Landracex Yorkshire Duroc) di due scrofe allevate commercialmente sono stati partoriti pretermine con taglio cesareo a circa il 90% di gestazione (termine completo: 117± 2 giorni). Dopo la rianimazione riuscita e mentre era ancora anestetizzato da anestetici materni, il posizionamento chirurgico di un catetere arterioso ombelicale a permanenza per facilitare la nutrizione parenterale (PN) e un sondino orogastrico per facilitare la nutrizione enterale (EN) è stato eseguito come precedentemente descritto 32]. Sei suinetti sono stati sottoposti a eutanasia subito dopo la nascita a causa della mancata rianimazione e sono stati di conseguenza esclusi dallo studio. In totale, quarantadue suinetti sono stati stratificati in base al sesso e al peso alla nascita e assegnati a uno dei due gruppi: un gruppo che ha ricevuto latte bovino crudo integrato con OPN(OPN, n{8}}) e un gruppo di controllo che ha ricevuto bovino crudo non integrato latte(CON, n=21)(Figura 1). Il plasma materno è stato infuso in 3 boli (totale di 25 ml/kg) tramite il catetere ombelicale entro le prime 24 ore per garantire l'immunizzazione passiva. I suini sono stati allevati individualmente per tutto il periodo di studio di 19 giorni. Dai giorni 1-5 sono stati allevati in incubatrici riscaldate ventilate (più ossigenazione durante le prime 24 h), e nei giorni 5 e 11 sono state ricollocate in gabbie più grandi. Tutti i ricercatori clinici sono stati accecati ai trattamenti dietetici durante il periodo sperimentale.
2.3. Nutrizione e alimentazione
La dieta enterale somministrata a tutti i suini era basata su latte bovino intatto non pastorizzato raccolto in due lotti da un allevamento locale di vacche del Jersey e conservato a -20 gradi . Il latte bovino è stato arricchito con minerali e vitamine (15 g/L Pediatric Seravit, Nutricia, Utrecht, Paesi Bassi) ed elettroliti (6 g/L Revolyte Nutrition, Gunnar Kjems ApS, Copenhagen, Danimarca). Questa base di latte serviva come dieta enterale completa per i suinetti del gruppo CON. Per i suini del gruppo OPN, la base di latte bovino è stata ulteriormente integrata con latte bovino OPN(Lacprodan⑧ OPN-10) ad un supplemento medianoOPNconcentrazione di 319 mg/L(IQR 272-445) per ottenere una dose aggiuntiva giornaliera fissa di OPN di 46 mg/(kg·giorno). La concentrazione rientra nell'intervallo di latte umano di OPN [4]. La concentrazione di OPN nel latte bovino raccolto era di 91 mg/L, misurata mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS, Alphalyse A/S, Odense, Danimarca). La dose supplementare di OPN è stata selezionata per rientrare nella fascia più alta della gamma del latte umano per garantire una ragionevole differenza rispetto alla dieta di controllo del latte bovino. Le preparazioni giornaliere delle diete enterali venivano fatte e conservate a 4 gradi fino al momento dell'uso (<24 h).="" pigs="" received="" gradually="" increasing="" volumes="" of="" en="" from="" 32="" ml/(kg.="" day)="" on="" day="" 1="" to="" 180ml/(kg:="" day)on="" day="" 15="" and="" until="" euthanasia.="" the="" enteral="" diets="" were="" given="" as="" boluses.="" during="" the="" daytime,="" the="" boluses="" were="" given="" every="" second="" hour,="" and="" during="" the="" night="" every="" third="" hour="" until="" day="" 9.="" thereafter,="" the="" feeding="" frequency="" was="" reduced="" to="" every="" third="" hour,="" day="" and="" night.="" the="" en="" was="" given="" through="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" until="" day="" 5="" when="" pigs="" were="" taught="" to="" drink="" from="" troughs.="" the="" pn="" was="" given="" as="" a="" continuous="" infusion="" in="" decreasing="" amounts="" from="" days="" 1-8="" (144-148="" ml/(kg.="" day))to="" counterbalance="" the="" small="" enteral="" volumes="" the="" piglets="" can="" cope="" with.="" the="" pn="" solution="" was="" a="" commercially="" available="" human="" parenteral="" nutrition="" product="" (kabiven,="" fresenius="" kabi,="" uppsala,="" sweden)="" adjusted="" to="" the="" requirements="" of="" piglets="" as="" previously="" described="" [32].="" after="" removal="" of="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" on="" day="" 11="" and="" onwards,="" all="" pigs="" had="" free="" access="" to="">
2.4. Valutazione clinica e raccolta dei tessuti
Durante tutto il periodo di studio, i suini sono stati monitorati da vicino (almeno ogni 3 ore) e i punteggi clinici sono stati assegnati due volte al giorno come descritto in precedenza [33]. Su indicazione clinica, sono stati avviati trattamenti rilevanti, ad es. la somministrazione di analgesici intramuscolari (meloxicam: Metacam, 5 mg/mL Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germania o butorfanolo: Torbugesic Vet, 10 mg/mL, Zoetis, Parsippany, NJ, USA). In caso di mancata risposta al trattamento, i suini venivano soppressi. I pesi corporei sono stati misurati ogni giorno e l'aumento di peso corporeo medio espresso come g/(kg.d), è stato calcolato secondo la formula:(peso all'eutanasia-peso alla nascita)/(peso corporeo medio × vita). Due volte al giorno, le feci sono state valutate come segue:1 (feci sode),2 (feci morbide/pastose),3 (feci cremose) e 4 (diarrea). Una soluzione di elettrolita orale (Revolution Nutrition) è stata somministrata tra le poppate in caso di diarrea per evitare la disidratazione. Antibiotici orali profilattici (metronidazolo: Flagyl, 40 mg/mL, Sanofi-Aventis, Parigi, Francia; amoxicillina, 500 mg, con acido clavulanico, 125 mg: Bioclavid, Sandoz GmbH, Copenaghen, Danimarca; gentamicina: Gentocin Vet, 4,35 mg/mL , Scanvet, Fredensborg, Danimarca) sono stati somministrati due volte al giorno da Days 8-10, in seguito alla rimozione del catetere arterioso ombelicale. La stessa combinazione di antibiotici per via orale è stata somministrata terapeuticamente, su indicazione. Il giorno 19, 60 minuti prima dell'eutanasia, ai suini è stato somministrato un ultimo bolo standardizzato delle rispettive diete. I suini sono stati anestetizzati con un'iniezione intramuscolare di zolazepam/tiletamina (Zoletil 50,25 mg/mL di zolazepam e 25 mg/mL di tiletamina, Virbac, Carros, Francia), ketamina (Ketaminol, 50 mg/mL, MSD Animal Health, Kenilworth, NJ , USA) e butorfanolo (Torbugesic Vet), e successivamente sono stati sottoposti a eutanasia con sodio pentobarbital (Euthanimal, 400 mg/mL, Scanvet) mediante iniezione intracardiaca. Immediatamente dopo l'eutanasia, gli organi interni sono stati sezionati e pesati, sia interi organi che specifiche regioni dell'organo (p. es., stomaco pieno/vuoto, intestino tenue, colon, cervello intero, regioni del cervello, fegato, milza, reni, polmoni e cuore). La frazione di acqua cerebrale è stata stimata pesando l'emisfero cerebrale sinistro prima e dopo la disidratazione per 14 giorni a 50 gradi. Ciascuna delle cinque regioni gastrointestinali (stomaco, intestino tenue prossimale (Prox), intestino tenue medio (Mid), intestino tenue distale (Dist) e colon) è stata valutata macroscopicamente e assegnata a un punteggio NEC [39]. Campioni di tessuto da ciascuna regione gastrointestinale sono stati raccolti e congelati in azoto liquido o fissati in formaldeide al 4% e conservati a -80 gradi fino a ulteriori analisi. Il disegno e i risultati dello studio sono mostrati nella Figura 1.
2.5. Attività degli enzimi della struttura della mucosa intestinale e del bordo della spazzola
La struttura della mucosa nell'intestino tenue è stata valutata misurando l'altezza dei villi e la profondità della cripta di fette istologiche di tessuti Prox, Mid e Dist fissati in paraformaldeide e colorati con ematossilina ed eosina come descritto in precedenza [40]. La colorazione immunoistochimica per Ki-67 dei replicati delle sezioni Prox, Mid e Dist è stata utilizzata per valutare la proliferazione degli enterociti nella mucosa dell'intestino tenue come descritto in precedenza [41]. Quattro immagini di ciascuna replica sono state ottenute in modo sistematico e casuale utilizzando un microscopio ottico (Ortho-plane, Leitz, Germania), collegato a una fotocamera e un obiettivo 10×. L'analisi dell'immagine è stata eseguita utilizzando Fiji: Image](NIH Image, Bethesda, Maryland) e l'area totale dei nuclei colorati con Ki-67-positiva è stata calcolata come una frazione dell'area totale dei nuclei. L'attività di 6 enzimi del bordo del pennello (maltasi, sucrasi, lattasi, aminopeptidasi N (ABN), aminopeptidasi A (APA) e dipeptidil peptidasi IV (DPPIV)) è stata determinata negli omogenati del tessuto centrale mediante spettrofotometria [42].
2.6.Biochimica del sangue, ematologia e immunità sistemica
I campioni di sangue per i parametri biochimici ed ematologici sono stati analizzati il giorno 1 dal cordone ombelicale durante il taglio cesareo, il giorno 8 da cateteri arteriosi ombelicali pervi, o in alternativa dalla vena giugulare, e il giorno 19 da puntura cardiaca durante l'eutanasia. Il plasma per la biochimica ottenuto da un vacutainer di sangue eparinizzato (BDDiagnostics, Oxford, Regno Unito) seguito da centrifugazione (2500 × g, 4 gradi per 10 minuti) è stato analizzato utilizzando il sistema chimico ADVIA 1800 (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Germania). Il sangue intero per l'ematologia e la conta delle cellule immunitarie ottenute da un vacutainer del sangue rivestito di EDTA (BD Diagnostics), sono stati analizzati utilizzando il sistema ematologico ADVIA 2120i (Siemens Healthcare GmbH).
Saggi sistemici relativi all'immunità per studiare i sottogruppi di cellule T del sangue, la funzione della fagocitosi dei neutrofili e le competenze immunitarie mediante stimolazione del recettore Toll-like (TLR) del sangue ex vivo sono stati eseguiti su campioni di sangue intero raccolti in un vacutainer di sangue eparinizzato (BD Diagnostics) su due giorni; Giorno 8 da cateteri arteriosi ombelicali o in alternativa dalla vena giugulare e Giorno 19 dalla vena giugulare. La caratterizzazione del sottogruppo di cellule T del sangue è stata misurata come descritto in precedenza [43]. In breve, gli eritrociti sono stati lisati utilizzando 1 X BD FACS Lysing solution (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) e i leucociti sono stati incubati con tampone di fissazione/permeabilizzazione (Invitrogen, Carlsbad, California) per 30 minuti a 4 gradi al buio. Dopo il lavaggio con tampone di permeabilizzazione (Invitrogen), le cellule sono state bloccate con siero suino (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) per 15 min 4 gradi al buio e successivamente colorate con quattro anticorpi monoclonali fluorescenti; PE-Cy7-anticorpo di topo anti-maiale CD3 coniugato (clone BB23-8E6-8C8, BD Biosciences), anticorpo di topo anti-maiale CD4 coniugato con FITC (clone MIL17, Bio- Rad Laboratories, Hercules, California), anticorpo anti-maiale CD8 di topo coniugato con PE (clone MIL12, Bio-Rad Laboratories) e anticorpo FOXP3 anti-topo di ratto coniugato con APC (clone JFK-16s, ThermoFisher Scientific). I campioni sono stati analizzati utilizzando un citometro a flusso BD Accuri C6 (BDBiosciences) e popolazioni di cellule T (CD3 più linfociti), cellule T citotossiche (CD3 più CD4- CD8 più linfociti), cellule T helper ( Sono stati identificati CD3 più CD4 più CD8-linfociti) e linfociti T regolatori (CD3 più CD4 più FoxP3 più linfociti). La funzione fagocitica dei neutrofili del sangue è stata analizzata mediante citometria a flusso utilizzando pHrodo Red Escherichia coli(560/585 nm)Kit di fagocitosi di bioparticelle per citometria a flusso (ThermoFisher Scientific)34]. Il tasso fagocitario è stato indicato dalla percentuale di neutrofili che esercitano la fagocitosi nella popolazione neutrofila (pHrodo plus) e la capacità fagocitica dei neutrofili è stata indicata dall'intensità fluorescente mediana (MFI). Per valutare la risposta infiammatoria sistemica a un Gram- sfida batterica negativa, 294 μL di sangue pieno sono stati incubati con un agonista TLR4 （lipopolisaccaride (LPS), E.coli O127: B8, Sigma Aldrich, St.Louis, MI, USA) per 5 ore a 37 gradi, 5% di CO. Il sangue stimolato e non stimolato è stato quindi centrifugato a 2000 × g, 4 gradi per 10 minuti e i surnatanti plasmatici sono stati analizzati per il fattore di necrosi tumorale (TNF) e l'interleuchina (IL)-10 mediante ELISA (Kit di coppia specifici per suini, ricerca e sviluppo Systems, Abingdon, Regno Unito), seguendo le linee guida del produttore. I campioni di plasma sono stati diluiti 2-2,5 volte prima dell'analisi. Per il calcolo dei livelli e dei rapporti medi di citochine sono stati inclusi solo campioni con livelli di assorbimento delle citochine entro l'intervallo standard. Tuttavia, ai campioni con livelli di assorbanza delle citochine inferiori allo standard più basso ma superiori al bianco è stato assegnato un valore arbitrario della metà del livello più basso rilevato nella piastra e inclusi nell'analisi statistica.
2.7. Sviluppo motorio precoce, comportamento e cognizione
Il tempo per alzarsi e camminare per la prima volta dopo la nascita è stato misurato come stime dell'acquisizione delle abilità motorie di base. Le telecamere a infrarossi sensibili al movimento installate sopra ogni gabbia domestica registravano continuamente l'attività motoria dei suini dal giorno 1 alle 21:00 quando i suini si erano completamente ripresi dagli anestetici materni fino al giorno 11[33]. La proporzione media del tempo di attività durante un'ora è stata calcolata dalle registrazioni di 12-intervalli di ore durante il giorno (dalle 9:00 alle 21:00) e le ore notturne (dalle 9:{12 }} pm to 9:00 am). Il comportamento esplorativo di ciascun suino è stato valutato il giorno 9 in un'arena a campo aperto (1,2 m×1,2 m) con una videocamera che registrava a volo d'uccello durante un {{ 20}}periodo di registrazione minimo con maiali in ordine casuale. Ai maiali è stato assegnato un punteggio complessivo in tempo reale da due osservatori in cieco sulla base di quattro parametri oggettivi: contatto con il pavimento, contatto con il muro, tentativi di fuga e un certo numero di andature. I video acquisiti sono stati successivamente analizzati utilizzando EthoVision XT10 (Noldus Information Technology, Wageningen, Paesi Bassi). I risultati sono stati la distanza totale percorsa e la velocità calcolata per ciascun maiale. Dopo un adeguato sviluppo visivo e un periodo di assuefazione, la cognizione spaziale di ciascun suino è stata valutata in un ordine randomizzato durante i giorni 12-18, utilizzando il test cognitivo spaziale T-labirinto standardizzato [44]. L'apprendimento e la memoria dipendenti dall'ippocampo sono stati testati durante 1-2 acquisizioni al giorno, ciascuna composta da 10 prove. Sono stati applicati segnali visivi extra-labirintici per consentire ai maiali di navigare per individuare una ricompensa fissa per il latte. Sono state utilizzate posizioni di partenza alternate dei maiali per evitare meccanismi di risposta egocentrici e il latte è stato collocato in entrambi i bracci di ricompensa. Per mascherare i segnali olfattivi, il latte era però accessibile solo in una delle braccia. Il numero di scelte corrette per acquisizione è stato registrato durante una fase standard (Acquisizioni 1-6, Giorni 12-17) e una fase di inversione (Acquisizioni 7-9, Giorni 17-18). Nella fase di inversione, la ricompensa del latte è stata modificata nel braccio opposto. Un minimo dell'80 per cento di scelte corrette (8 scelte corrette su 10 prove) sono state definite come criterio di apprendimento [30].
2.8. Analisi statistica
Il software statistico R (versione 3.6.0) è stato utilizzato per tutte le analisi statistiche. Per il test antibatterico, le differenze nella crescita di S. tra le 6 diete di prova e il latte artificiale in 2-24 h di incubazione, sono state analizzate utilizzando un modello lineare a effetti misti (funzione Ime) con dose di inoculazione, tempo e dieta di prova /formula come effetti fissi (compresa l'interazione tra gli ultimi due) e il periodo sperimentale come effetto casuale, seguito da confronti a coppie in ogni momento (ls significa pacchetto). Le misurazioni ripetute continue dello studio sui suini (ovvero, peso corporeo, attività della gabbia domestica, scelte corrette nel test cognitivo spaziale T-labirinto e parametri intestinali piccoli misurati in diverse regioni) sono state analizzate utilizzando un modello lineare a effetti misti (funzione me) inclusa la struttura di correlazione appropriata e il maiale come effetto casuale. Il pacchetto ha facilitato i successivi confronti all'interno di ciascuna regione dell'intestino tenue. È stato utilizzato un modello di rischio proporzionale di Cox (funzione) per i dati temporali continui dell'evento (cioè l'acquisizione delle abilità motorie di base e la prima volta che si presenta con diarrea). Tutti gli altri dati continui sono stati analizzati utilizzando un modello di regressione lineare multipla (funzione lm). La correzione Holm è stata applicata a tutti i dati biochimici del sangue per correggere i test di confronto multiplo e controllare il tasso di errore familiare. I dati discreti del tempo all'evento (cioè la percentuale di maiali che hanno raggiunto il criterio di apprendimento del labirinto a T) sono stati analizzati utilizzando un modello di regressione lineare multipla generalizzato (funzione) con una risposta binomiale e un collegamento log-log complementare. Sesso, figliata e peso alla nascita sono stati identificati come potenziali fattori confondenti biologicamente rilevanti prima dello studio e quindi inclusi come effetti fissi in tutti i modelli sopra menzionati. Inoltre, per tutti i parametri ematochimici ed ematologici del sangue, i livelli basali misurati il giorno 1 prima della randomizzazione di gruppo sono stati inclusi come effetti fissi nei corrispondenti modelli di regressione lineare multipla. La convalida del modello dei modelli di regressione lineare è stata eseguita mediante visualizzazioni grafiche della normalità e dell'omoscedasticità dei residui e dei valori adattati e, se necessario, sono state eseguite trasformazioni dei dati (log o sqrt) per soddisfare queste ipotesi. Per le variabili che non potevano essere conformi a una distribuzione normale, è stato applicato il test di Mann-Whitney non parametrico. I modelli di regressione con variabili di risposta categoriali sono stati convalidati investigando i residui cumulati utilizzando il test di bontà dell'adattamento (del pacchetto). Salvo diversa indicazione, i dati grezzi sono presentati come medie ± DS e valori p<0.05 are="" considered="" statistically="">
3. Risultati
3.1. Saggio antibatterico in vitro
Gli effetti del latte bovino scremato integrato con OPN a diverse concentrazioni, sulla crescita e la vitalità di S., sono stati valutati e confrontati con il latte artificiale. Dopo 4, 6 e 24 h di incubazione con il latte artificiale, la concentrazione di S. è aumentata di circa 10,50 e 1 × 10 più volte, rispettivamente, per entrambe le dosi di inoculazione (10) e 10 gradi FU ). Non c'erano differenze tra le 6 diete di prova e la formula prima delle 4 ore di incubazione con la dose di inoculazione di 105 CFU (Figura 2). Tuttavia, un apparente effetto battericida delle diete di prova a base di latte bovino era evidente rispetto al latte artificiale, poiché la concentrazione di S. è rimasta statica in questi durante 1-4 h di incubazione. A 4 ore di incubazione, dopo la stessa dose di inoculazione, la conta batterica era inferiore in tutte e 6 le diete di prova rispetto alla formula (circa 10 volte, p <0,01). la="" supplementazione="" di="" opn="" ha="" esercitato="" effetti="" batteriostatici="" a="" lungo="" termine="" dose-dipendenti="" contro="" s.="" poiché="" la="" conta="" batterica="" dopo="" 6="" h="" di="" incubazione="" era="" significativamente="" più="" bassa="" nelle="" diete="" di="" prova="" contenenti="" le="" 4="" dosi="" più="" alte="" di="" opn=""><0.05,10>dose di inoculazione). Solo il latte bovino scremato non integrato ha perso momentaneamente la sua capacità di prevenire la crescita di batteri se incubato per 6 ore (dose di inoculazione 105 UFC). A 24 ore di incubazione, la conta batterica era inferiore in tutte e 6 le diete di prova rispetto alla formula (pag<001, 105="" cfu="" inoculation="" dose).="" all="" 6="" test="" diets="" exerted="" bacterial="" inhibitory="" effects="" (initially="" bactericidal)="" against="" s.,="" inoculated="" at="" 10°cfu,="" at="" all="" tested="" time=""><2 h="" of="" incubation=""><0.07,>2 h di incubazione p<>
3.2. Risultati clinici e di crescita
Sette suini (5/21 OPN rispetto a 2/21 CON, p=0.4) dei 42 suini sono stati soppressi/morti a causa di complicazioni legate all'immaturità/iatrogene all'inizio dell'esperimento (
3.3. Struttura e funzione dell'intestino
L'altezza del villo e la profondità della cripta, valutate nelle parti prossimale, media e distale dell'intestino tenue erano simili tra i due gruppi (Tabella 2). Rispetto a CON, è stato misurato in OPN(p) un rapporto villo-cripta complessivamente più alto nelle tre regioni del piccolo intestino<0.05, figure="" 4a).="" similar="" amounts="" of="" proliferative="" enterocytes="" were="" observed="" between="" the="" two="" groups,="" indicated="" by="" the="" same="" relative="" area="" of="" ki-67="" positive="" stained="" nuclei="" in="" the="" three="" small="" intestinal="" regions="" (figure="" 4b,="" c).="" further,="" the="" gastric="" emptying="" ability="" indicated="" by="" the="" gastric="" content="" weights="" at="" euthanasia="" as="" well="" as="" the="" activity="" of="" lactase,="" maltase,="" sucrase,="" apa,="" abn,="" and="" dppiv="" measured="" in="" the="" middle="" part="" of="" the="" small="" intestine="" were="" comparable="" between="" the="" groups="" (table="">
3.4. Biochimica del sangue, ematologia e immunità sistemica
I campioni di sangue del cordone ombelicale hanno rivelato una maggiore conta totale di leucociti e basofili il giorno 1 (pag<0.05)of pigs="" later="" assigned="" the="" opngroup="" relative="" to="" pigs="" assigned="" the="" con="" group.="" no="" other="" immune="" cell="" counts,="" blood="" biochemistry,="" or="" hematology="" variables="" differed="" between="" the="" two="" groups="" prior="" to="" receiving="" their="" specific="" dietary="" interventions(data="" not="" shown).="" blood="" biochemistry="" variables="" measured="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" differ="" between="" groups(table="" s1,="" supplementary="" materials),="" and="" accompanied="" hematology="" parameters="" and="" immune="" cell="" counts="" are="" presented="" in="" table="" 3.="" compared="" with="" con="" pigs,="" opn="" pigs="" had="" a="" higher="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" on="" day=""><0.05, figure="" 5a,="" b).="" the="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" increased="" from="" day="" 8="" to="" day="" 19,="" with="" no="" final="" differences="" between="" the="" groups(figure="" 5a,="" b).="" the="" remaining="" immune="" cell="" counts="" and="" nonimmune-related="" hematological="" parameters="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" pigs="" (table="" 3).="" innate="" and="" adaptive="" immune="" parameters="" were="" evaluated="" on="" days8="" and="" 19.="" on="" day="" 8,="" the="" blood="" neutrophil="" phagocytic="" rate="" and="" capacity="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" (table="" 3).="" conversely,="" on="" day="" 19="" they="" had="" a="" higher="" frequency="" of="" neutrophils="" exerting="" phagocytosis="" compared="" with=""><0.05). the="" phagocytic="" capacity="" was="" though="" not="" different="" between="" groups="" (figure="" 5c,="" d).="" the="" t-cell="" subset="" characterization="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" reveal="" any="" differences="" between="" t="" helper="" cells,="" cytotoxic="" t="" cells,="" and="" regulatory="" t="" cells="" in="" the="" two="" groups="" (table="" 3).="" a="" representative="" facs="" gating="" is="" shown="" in="" figure="" s1,="" supplementary="" materials.="" the="" tlr4-mediated="" il10="" and="" tnf-α="" cytokine="" production="" of="" full="" blood="" from="" days="" 8="" and="" 19="" was="" evaluated.="" tnf-α="" and="" il10="" were="" detected="" at="" similar="" levels="" between="" opn="" and="" con="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 8="" and="" there="" were="" no="" group="" differences="" in="" the="" response="" to="" lps="" stimulation="" indicated="" by="" a="" similar="" tnf-α/il10="" ratio(table="" s2,="" supplementary="" materials).="" tnf-α="" was="" not="" detectable="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 19="" from="" either="" group.="" however,="" both="" groups="" responded="" equally="" to="" lps="" stimulation,="" indicated="" by="" similar="" tnf-α="" and="" il-10="" plasma="" levels="" (table="" s2,="" supplementary="">
3.5. Risultato strutturale e funzionale del cervello
I risultati strutturali correlati al cervello, inclusi i valori assoluti e relativi del peso cerebrale totale, i pesi cerebrali regionali e il contenuto di acqua cerebrale erano simili tra i gruppi OPN e CON (Tabella 4). Non sono state osservate differenze nello sviluppo motorio iniziale, poiché il tempo per alzarsi in piedi, la prima camminata e la prima assunzione volontaria di un bolo di latte completo, nonché la proporzione del tempo attivo nelle gabbie domestiche sono stati misurati da telecamere sensibili al movimento di Days { {3}}, erano simili tra OPN e CON (Figura 6A-D). Il comportamento esplorativo del maiale valutato nell'arena in campo aperto il giorno 9 era comparabile tra i due gruppi, poiché il punteggio complessivo, la distanza totale percorsa e la velocità erano simili (Tabella 4). Inoltre, una prestazione cognitiva simile è stata osservata durante la fase standard e di inversione nel test cognitivo spaziale T-labirinto eseguito su 9 acquisizioni dai giorni 12-a 18 (Figura 7A, B). La proporzione media di scelte corrette nel tempo è aumentata per entrambi i gruppi in entrambe le fasi (Figura 7A). Nella fase standard, sia OPN che CON hanno raggiunto il criterio di apprendimento predefinito sull'acquisizione 5 (scelte corrette dell'80%, Figura 7A). Tutti i suini hanno raggiunto il criterio di apprendimento e non c'era differenza nel tempo impiegato per raggiungere il criterio di apprendimento (Figura 7B).
4. Discussione
Gli effetti multifunzionali dell'OPN, in particolare in termini di attività proliferativa, immunoregolatoria e antibatterica, ma potenzialmente anche nel supportare lo sviluppo cerebrale, possono aiutare a migliorare la salute e lo sviluppo degli organi di neonati e bambini sensibili. Gli elevati livelli di OPN nel latte materno precoce e le corrispondenti concentrazioni plasmatiche di OPN infantile raccomandano un apporto sufficiente di OPN nell'immediato periodo neonatale quando i bambini vengono nutriti con latte umano [5]. Al contrario, la minore concentrazione di OPN nel latte bovino e negli alimenti per lattanti 4 offre una finestra di opportunità per aumentare il contenuto di OPN nelle formule del latte e l'integrazione con OPN può aiutare a ridurre le differenze di sviluppo esistenti tra il latte artificiale e quello materno bambini allattati [2,3]. In questo studio, abbiamo dimostrato che l'integrazione di OPN a una dieta a base di latte bovino con contenuto basale di OPN era ben tollerata, ma sono stati osservati solo piccoli miglioramenti nella struttura intestinale e nell'immunità sistemica e non sono stati osservati ulteriori effetti sulla struttura e sulla funzione del cervello. La base di latte bovino è stata selezionata per garantire una dieta di base bioattiva rilevante rispetto a una formula di latte, che oltre al contenuto inferiore di OPN ha anche una ridotta bioattività. Il latte OPN è riconosciuto come un'importante proteina del siero di latte biologicamente attiva, principalmente per la sua capacità di modulare l'immunità e stimolare la proliferazione cellulare [18,45]. La capacità dell'OPN di formare complessi con la lattoferrina caricata positivamente presente nel latte può aggiungere ulteriori proprietà funzionali nel contribuire alla difesa contro i patogeni nell'intestino del bambino [10]. Il complesso OPN-lattoferrina si trova nel latte umano e bovino, ma può anche essere formato dalle singole proteine [10]. Per documentare il potenziale bioattivo dell'OPN in una dieta a base di latte bovino, abbiamo inizialmente testato la capacità antibatterica in vitro dell'OPN del latte bovino aggiunto in diverse concentrazioni al latte Jersey scremato sterile. I nostri risultati mostrano che le diete a base di latte integrate con OPN esercitano capacità antibatteriche sia a breve che a lungo termine in modo dose-dipendente inibendo la crescita di S.epidermidis, un comune patogeno neonatale che causa sepsi a esordio tardivo in seguito a traslocazione intestinale [46,47 ]. Ciò offre l'opportunità di stimolare lo sviluppo intestinale mediante l'integrazione di OPN nella dieta del latte neonatale. I livelli ottimali di OPN dietetici nelle diete a base di latte non sono chiari e la variabilità del contenuto di OPN nel latte umano è ampia, sia tra le madri che tra i paesi, e durante il periodo di allattamento [7. Precedenti studi sugli animali hanno studiato prevalentemente gli effetti dell'aggiunta di OPN a una dieta di controllo senza OPN, a livelli paragonabili al contenuto medio di latte umano [14,22,24]. In questo studio preclinico sui suini, ci siamo concentrati sull'aspetto clinico rilevante dell'aggiunta di più OPN a una dieta con un livello basale di OPN per raggiungere livelli elevati di latte umano. La supplementazione di OPN in questo studio ha aumentato la dose giornaliera di OPN a una dose che rappresenta l'assunzione nei bambini da madri con una concentrazione di latte OPN relativamente alta e ben oltre quella che normalmente si riceve dal latte artificiale[4]. Il contenuto di OPN nel latte Jersey raccolto si è rivelato avere un contenuto di OPN più elevato rispetto a quanto precedentemente misurato nel latte bovino. È importante notare che il metodo LC-MS/MS utilizzato è diverso dal metodo ELISA utilizzato in studi precedenti [48]. La mancanza di effetti cognitivi nel presente studio potrebbe risiedere nel fatto che i suini di controllo ricevono già OPN in concentrazioni di 91 mg/L, come intrinsecamente presente nel latte Jersey, e l'integrazione aggiuntiva di OPN non offre vantaggi aggiuntivi. Abbiamo scoperto che l'integrazione del latte bovino con OPN era ben tollerata e conferiva effetti minori sull'intestino e sulla maturazione immunitaria, mentre i parametri strutturali e funzionali del cervello erano invariati. Entrambi i suini OPN e CON hanno mostrato tassi di crescita paragonabili o superiori a quelli normalmente osservati nei suinetti pretermine in studi simili con diete a base di latte bovino [49-51]. I tassi di crescita e lo stato clinico relativamente buono con un punteggio NEC basso raggiunto in questi suini pretermine, hanno fornito condizioni ottimali per documentare gli effetti dietetici sui cambiamenti nelle funzioni degli organi e sullo sviluppo cognitivo cerebrale nei neonati sensibili.
Esiste un'elevata somiglianza tra le sequenze OPN umane, bovine e suini [52] e la natura onnipresente dell'OPN è ben consolidata nei suini. L'OPN è espresso da una varietà di tessuti suini sani con la maggiore abbondanza nel tessuto ileale [53], ma le concentrazioni di latte suino sono sconosciute. In precedenza abbiamo mostrato minori effetti benefici sull'intestino di una formula arricchita con OPN nei suinetti pretermine in relazione al recupero dall'infiammazione prenatale [43]. Nel complesso, questo sottolinea l'uso del suinetto come modello preclinico per studiare gli effetti dell'integrazione alimentare di OPN. Rispetto a CON, i maiali OPN avevano un rapporto villo-cripta più elevato nell'intestino tenue. Una differenza morfologica simile è stata riportata sulla base di campioni duodenali di 10-cuccioli di topo di un giorno allattati da madri wild-type o madri knock-out OPN integrate con latte bovino OPN rispetto a cuccioli di topo che non hanno ricevuto alcuna OPN[22]. Precedenti studi sui suini pretermine hanno correlato l'aumento dell'altezza dei villi con una maggiore capacità di assorbimento dei nutrienti di, ad esempio, il galattosio [51,54], che può essere fondamentale per garantire una crescita ottimale. Utilizzando la linea cellulare suina IPEC-J2 abbiamo precedentemente dimostrato in vitro la capacità dell'OPN di aumentare la proliferazione cellulare in modo dose-dipendente [43]. Il miglioramento della struttura della mucosa intestinale grossolana osservata tra i suini OPN nel presente studio non può essere spiegato da un aumento degli enterociti proliferativi basato sulla colorazione Ki-67 nell'intestino tenue e non ha comportato modifiche delle attività degli enzimi digestivi. I risultati precedenti nelle scimmie rhesus neonate alimentate con OPN hanno mostrato che i cambiamenti intestinali con i profili di espressione genica del digiuno sono più simili alle controparti allattate al seno [12]. La stessa traiettoria di sviluppo per quanto riguarda la conta delle cellule immunitarie è stata osservata nei suini OPN e CON. Tutte le cellule immunitarie, eccetto la conta dei basofili e degli eosinofili, con livelli altrettanto bassi nei suinetti a termine [34], sono aumentate di numero dal giorno 8 al giorno 19, indicando una maggiore capacità di entrambi i gruppi di attivare una risposta immunitaria sufficiente a un potenziale patogeno. I livelli circolanti di monociti e linfociti dei suini OPN al giorno 8 erano più alti rispetto ai suini CON ma non al giorno 19. Poiché le condizioni cliniche erano simili tra i suini in entrambi i gruppi e i punteggi NEC erano bassi, i livelli di monociti e linfociti sono probabilmente principalmente correlati al trattamento effetti e suggeriscono uno sviluppo immunitario accelerato nei suini OPN. Una percentuale maggiore di monociti circolanti è stata osservata anche in uno studio randomizzato controllato su bambini di sei mesi che ricevevano formule con aggiunta di latte bovino OPN a concentrazioni di 65 mg/L e 135 mg/L, rispetto ai controlli allattati al seno [55]. L'OPN è in grado di interagire con le cellule immunitarie attraverso il suo recettore e di agire come agente chemiotattico per i monociti attivati da IL-1-, che possono essere fisiologicamente rilevanti durante l'infiammazione [16]. L'OPN può inoltre svolgere un ruolo nell'immunità innata mediando la fagocitosi attraverso il recettore dell'integrina, ox 2, espresso sulla superficie dei monociti [16]. Restano da indagare ulteriori studi sul ruolo dell'OPN sulla funzione dei monociti e su come questo si traduca in un beneficio per i bambini allattati artificialmente.
Una caratterizzazione di sottogruppi di cellule T è stata eseguita nei giorni 8 e 19 per descrivere ulteriormente la popolazione di linfociti, ma non ha rivelato differenze nelle frazioni di sottogruppi tra i due gruppi in questo periodo neonatale immediato. I bambini che hanno ricevuto latte artificiale integrato con OPN (65 o 130 mg/L), hanno mostrato una percentuale maggiore di cellule T nei primi sei mesi di vita rispetto a quella alimentata con latte artificiale [55]. Questa risposta potrebbe non svilupparsi già nelle prime settimane di vita, oppure il livello relativamente alto di OPN nel nostro latte bovino di base (91 mg/L) potrebbe limitare ulteriori cambiamenti. Il numero di cellule T, cellule T helper e cellule T citotossiche non differiva tra OPN e CON, e quindi non può spiegare le differenze nei linfociti circolanti tra i due gruppi al giorno 8. In questo studio, abbiamo colorato per CD3, CD4, CD8 e Foxp3, e resta da indagare se il numero di linfociti più elevato potrebbe essere originato da un numero di cellule B più elevato o da un numero maggiore di cellule natural killer. La maturazione dell'immunità sistemica dopo la nascita include uno spostamento dell'equilibrio Th1/Th2, dove la difesa contro le infezioni batteriche richiede un'inclinazione di Th1 [17]. L'OPN è un potente chemioattrattivo con proprietà simili alle citochine ed è noto per regolare l'equilibrio Th1/Th2 [18]. In questo studio, l'equilibrio Th1/Th2 subito dopo la nascita non è stato modulato dalla dieta indicata da un rapporto TNF-/IL10 simile al giorno 8. Poiché i livelli di TNF-o non sono stati rilevati nei campioni plasmatici non stimolati del giorno 19, il TNF-/IL10 non è stato possibile calcolare il rapporto a questo punto. Recentemente, studi che utilizzano modelli animali [14,22,24] hanno studiato il ruolo dell'OPN del latte nel neurosviluppo durante l'infanzia. Utilizzando un modello murino knockout OPN, è stato dimostrato che il latte con livelli di OPN simili al latte umano migliora lo sviluppo delle capacità motorie e delle capacità di memoria dipendenti dall'ippocampo nei cuccioli di topo 30-di un giorno rispetto ai controlli dietetici carenti di OPN. Questi esiti cerebrali funzionali dell'OPN correlata al latte alimentare sono stati collegati a livelli aumentati di OPN cerebrale endogena e una maggiore proliferazione e differenziazione dell'antigene nervoso/gliale due cellule in oligodendrociti che portano a una maggiore espressione delle proteine correlate alla mielina. In una configurazione sperimentale simile, i cuccioli di topo selvatico allattati da madri knockout OPN e a cui è stato somministrato latte bovino supplementare OPN (12 ug/g) hanno mostrato una maggiore capacità di memoria rispetto ai controlli non integrati [22]. Collettivamente, questi risultati indicano che l'OPN del latte svolge un ruolo importante nello sviluppo neurocognitivo e che l'OPN del latte bovino può esercitare tali effetti benefici su tutte le specie. Abbiamo riscontrato uno sviluppo simile nell'acquisizione delle abilità motorie di base, nell'attività in gabbia e nel comportamento esplorativo nell'arena in campo aperto tra i gruppi. Le prestazioni di gruppo nel test spaziale del labirinto a T hanno ulteriormente indicato un apprendimento e una memoria dipendenti dall'ippocampo simili e quindi abilità cognitive. I nostri risultati sono in accordo con uno studio condotto di recente che ha confrontato suinetti a termine di due giorni che ricevevano una dieta formula a base di proteine di soia senza OPN o integrata con 250 mg/L di latte bovino OPN [24]. Solo differenze comportamentali limitate erano evidenti tra i due gruppi valutati durante un nuovo compito di riconoscimento degli oggetti eseguito il giorno 30 postnatale. Ciò implica che almeno nei suini sani e nati a termine, l'integrazione di latte OPN non migliora ulteriormente lo sviluppo correlato al cervello come misurato da riconoscimento di nuovi oggetti. Simile al test del labirinto a T spaziale [44], il nuovo compito di riconoscimento degli oggetti è considerato dipendente dall'ippocampo, e quindi questi test comportamentali potrebbero essere più sensibili più vicino al tempo dei tassi di crescita massimi dell'ippocampo, che a termine si verificano suini maschi e femmine rispettivamente alle Settimane 8 e 3 circa postnatali [56]. Non è noto se miglioramenti cognitivi a lungo termine in seguito all'integrazione di OPN nel latte nella prima infanzia, come dimostrato negli studi sui modelli murini [14,22], potrebbero essere stati documentati nei suini in momenti successivi.
Per quanto riguarda lo sviluppo strutturale del cervello, è stato precedentemente documentato attraverso la risonanza magnetica che l'integrazione alimentare di OPN ha aumentato il numero di volumi regionali del cervello dopo la normalizzazione dei volumi cerebrali totali [24]. In questo studio, non abbiamo trovato differenze indotte dalla dieta nei pesi regionali del cervello, né pesi assoluti né relativi ai pesi cerebrali totali. Pertanto, non abbiamo eseguito analisi più approfondite come la misurazione dei livelli di espressione genica delle proteine correlate alla mielina, ad esempio la proteina basica della mielina e la glicoproteina associata alla mielina [14,23]. È stato precedentemente documentato che l'OPN esogena ha proprietà neuroprotettive attenuando la neuroinfiammazione indotta dall'emorragia intracerebrale portando a punteggi neurologici migliorati [57I. Sono necessarie ulteriori ricerche per indagare se l'OPN del latte è in grado di conferire effetti strutturali e funzionali benefici al cervello durante condizioni infiammatorie sistemiche, spesso vissute dai neonati pretermine [26]. Ciò non rientrava nell'ambito del presente studio.
5. Conclusioni
In un modello di maiale pretermine di neonati sensibili, abbiamo dimostrato che una dieta a base di latte bovino bioattivo integrata con latte bovino aggiuntivo OPN è ben tollerata e ha indotto miglioramenti minori nella struttura intestinale e nell'immunità sistemica, senza ulteriori effetti sullo sviluppo strutturale o funzionale del cervello. L'integrazione con OPN al di sopra di quanto ricevuto dal latte bovino basale, raggiungendo così livelli nella fascia fisiologica superiore di ciò che i bambini ricevono naturalmente dal latte umano, può quindi avere effetti limitati sull'intestino, sull'immunità e sullo sviluppo del cervello nei neonati sensibili nell'immediato periodo neonatale . Restano da determinare maggiori informazioni sui benefici dell'integrazione con latte OPN di alimenti per lattanti a base di latte bovino per stimolare lo sviluppo di neonati compromessi.
