Percorsi molecolari legati alla promozione della longevità e al miglioramento cognitivo della Cistanche Tubulosa in Drosophila

per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Wei-Yong Lin et al

Astratto:

Sfondo:Il processo di invecchiamento, compresa la disfunzione fisica e il deterioramento della memoria correlato all'età (AMI), sono considerati correlati ai danni ossidativi cumulativi e alle vie di segnalazione dell'insulina/IGF-1. Scopo: il presente studio è stato quello di chiarire le condizioni in vivo effetti sul ritardo dell'invecchiamento e sul miglioramento dell'AMI e sui meccanismi molecolari sottostantiCistanche tubulose(CT), un'erba usata nella medicina tradizionale cinese per migliorare la funzione sessuale e curare la disfunzione renale

Metodi:Le mosche, trattate e non trattate con TC(Cistanche tubulosa), sono stati osservati per durata della vita, resistenza allo stress ossidativo con H2O2 o paraquat, test di fame, comportamenti cognitivi con T-labirinto e livelli di trascrizione dei geni bersaglio con RT-PCR quantitativa.

Risultati:Somministrazione di CT(Cistanche tubulosa)prolungata la durata media e massima della vita e una maggiore resistenza allo stress ossidativo nelle mosche. CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione ha anche migliorato la formazione della memoria nelle giovani mosche e ha soppresso l'invecchiamento dell'AMI. Diversi geni e vie di segnalazione, tra cui il target meccanicistico della rapamicina (mTOR) e le reti Notch, sono stati identificati come responsabili di questi effetti farmacologici e alterazioni nell'espressione genica dei recettori del glutammato.

Conclusione:I nostri risultati indicano che CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione può contribuire a rallentare i fenotipi dell'invecchiamento e alleviare il declino cognitivo-comportamentale nelle mosche, indicando la potenziale applicabilità per migliorare la salute umana e ridurre la suscettibilità ai disturbi legati all'età.

Parole chiave:Invecchiamento,Cistanche tubulose,Comportamento cognitivo, Herb

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introduzione

Con l'aumento della popolazione anziana in tutto il mondo, facilitare l'invecchiamento in buona salute e la longevità è un problema di salute pubblica sempre più cruciale per la scienza, la società e il campo dell'assistenza medica. Il processo di invecchiamento è stato proposto come controllato da meccanismi complessi, guidati da un'ampia interazione di fattori genetici e ambientali. A causa dei graduali danni a livello cellulare e tissutale, l'età è un fattore di rischio e altamente correlato con la suscettibilità a malattie croniche come il cancro, malattie cardiovascolari e neurodegenerative (Kenyon, 2005). L'invecchiamento riduce anche l'attività sinaptica, la nuova sintesi proteica e la funzione cognitiva. Questi cambiamenti funzionali contribuiscono alla compromissione della memoria legata all'età (AMI) (Burke and Barnes, 2010; Schimanski and Barnes, 2010). Pertanto, lo sviluppo di farmaci per ritardare la patologia legata all'età e l'invecchiamento cognitivo potrebbe essere vantaggioso per la qualità della vita umana. In questo studio, abbiamo utilizzato Drosophila melanogaster, che è un organismo ideale per studi sull'invecchiamento in vivo a causa della sua breve durata, per valutare l'efficacia del farmaco ed esplorare i meccanismi molecolari alla base del miglioramento dell'invecchiamento e dell'IMA.

Erbacistance, conosciuta anche con il nome cinese Rou CongRong, è una pianta parassitaria diffusa principalmente nei deserti della Cina nord-occidentale. Due specie di Cistanche, Cistanche deserticolaY. C. Ma eCistanchetubulosa(Schrenk) Wight sono inclusi nella Farmacopea cinese (edizione 2005) per i loro ingredienti chimici simili e attività farmacologiche. Il loro estratto di stelo è stato ampiamente utilizzato per migliaia di anni come rimedio tonico, principalmente per il trattamento di vari sintomi, tra cui funzione renale carente, impotenza, infertilità e per facilitare la catarsi, come descritto negli antichi libri di medicina cinese. Numerosi costituenti chimici, inclusi oli essenziali, glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi, lignani e saccaridi, sono stati isolati daCistanchespecie e due principali componenti PhG, acteoside e andechinacoside sono tipicamente selezionati come marcatori per la valutazione della qualità di Herba cistanche a causa delle loro significative azioni farmacologiche (Wang et al., 2012).

Cistanche tubuloseGli estratti (CT) possiedono varie funzioni biologiche che includono la modulazione dell'attività immunitaria, il miglioramento della funzione sessuale, la promozione della crescita dei capelli e altri benefici su antiossidante, epatoprotezione, attività antiosteoporosi e antitumorale (Li et al., 2016; Seok et al., 2015 ; Wang et al., 2012). Inoltre, uno studio in vitro, ha rivelato che Herbacistancel'estratto può proteggere i neuroni simili alla dopamina dal danno ossidativo indotto da H2O2- e aumentare significativamente i livelli del fattore di crescita nervoso e del fattore neurotrofico derivato dal cervello (Lin et al., 2013). L'echinacoside ha impedito la morte del neurone della dopamina nel modello murino della malattia di Parkinson con lesioni MPTP (Zhao et al., 2010). Inoltre, CT(Cistanche tubulosa)estratto ha migliorato la disfunzione cognitiva attraverso la diminuzione della deposizione di amiloide e l'aumento dei livelli di acetilcolina e dopamina in un modello di ratto della malattia di Alzheimer (AD) (Wu et al., 2014). Sebbene l'effetto terapeutico di Herbacistanceè ancora necessario confermare uno studio clinico di piccole dimensioni, non controllato con placebo, sulla TC(Cistanche tubulosa)estratti di glicoside hanno mostrato che il farmaco ha il potenziale per trattare pazienti con AD da lieve a moderato e presenta reazioni avverse relativamente lievi, anche dopo somministrazione a lungo termine (Guo et al., 2013). Questi dati suggeriscono che gli estratti di glicoside in Herbacistancehanno effetti neuroprotettivi e anti-demenza. Nonostante i vari vantaggi della TC(Cistanche tubulosa), i suoi meccanismi molecolari e gli effetti sul ritardo dell'invecchiamento e sul miglioramento dell'IMA non sono stati chiariti. In questo studio, gli effetti della CT(Cistanche tubulosa)su una significativa estensione della durata della vita sono stati esaminati il ​​miglioramento della resistenza allo stress ambientale e la soppressione della disfunzione cognitiva legata all'età per determinare la possibile utilità clinica della TC(Cistanche tubulosa)nel rallentare il processo di invecchiamento.

Materiali e metodo

Erboristeria

L'identificazione dell'origine diCistanche tubulose(Schrenk) Wight(Orobanchaceae) (CT) è stato verificato nel Ko Da PharmaceuticalCo. Ltd. (Taoyuan, Taiwan), dove sono stati conservati campioni di voucher (10.603.205) e viene prodotta la medicina erboristica concentrata CT. In breve, lo stelo carnoso essiccato di CT è stato estratto in 12- acqua bollita per 1 h seguita da filtrazione. I filtrati sono stati raccolti e sottoposti a vuoto e concentrazione a pressione ridotta per 1 ora per ottenere estratti. Gli estratti CT sono stati miscelati con amido in rapporto 1:1 (p/p) e sottoposti a granulazione spray per ottenere polvere CT.

Manutenzione delle scorte di volo e misurazione della durata della vita

La coda di topo wild-type utilizzata in questo studio era della CantonS, ottenuta dal Bloomington Drosophila Stock Center. Le mosche sono state allevate e mantenute in terreni standard di farina di mais a 25 gradi con un'umidità relativa del 50–60% in un ciclo di luce-buio di 12-h. Le mosche adulte emergenti sono state raccolte entro 24 ore e separate per sesso. Dall'inizio dell'età adulta, le mosche sono state integrate con CT. CT(Cistanche tubulosa)la polvere è stata disciolta in acqua e aggiunta al mezzo di farina di mais a concentrazioni di 5,4,10,8 e 21,6 mg/ml, che erano proporzionali alla dose giornaliera efficace per la somministrazione orale umana. In un'analisi della durata della vita, da venti a trenta mosche sono state allevate in una fiala di cibo con o senza TC(Cistanche tubulosa); almeno 250 mosche sono state condotte per ogni trattamento. Le fiale di cibo sono state sostituite ogni 3 o 4 giorni e in quel momento sono state contate le mosche morte

Saggi di resistenza allo stress

Sono state raccolte mosche adulte e quindi pretrattate con una dieta di controllo senza TC(Cistanche tubulosa)e diete sperimentali integrate con 5,4, 10.8 e 21,6 mg/ml di CT per 20 giorni a 25 gradi . Per l'analisi della fame, le mosche sono state conservate in fiale solo con carta bagnata e hanno valutato la loro resistenza contro lo stress ossidativo indotto dalla fame. Per i test di stress ossidativo, le mosche sono state trasferite in fiale prive di cibo contenenti una carta da filtro con perossido di idrogeno (H2O2) (Sigma Aldrich) in una soluzione di glucosio al 5% per misurare la resistenza delle mosche contro il radicale idrossile indotto da H2O2- (OH −) stress. Allo stesso modo, le mosche sono state trasferite in fiale contenenti una carta da filtro saturata con paraquat 10 mM (Sigma-Aldrich), che genera anioni superossido (O2 −) che causano danni ossidativi agli animali. Le mosche sono state valutate per mortalità almeno tre volte al giorno fino a quando non erano morte tutte. Sono state eseguite almeno 250 mosche per trattamento. Per l'arrampicata, per esempio, le mosche esposte al paraquat per 0 e 16 ore sono state poste in una fiala di plastica e picchiettate delicatamente sul fondo. Il numero di mosche in cima alla fiala è stato contato dopo 18 secondi di salita.

Valutazione della fecondità

Sia i maschi che le femmine vergini hanno alimentato 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)per 20 giorni servito come gruppi sperimentali. Dieci femmine sperimentali sono state accoppiate con un numero uguale di maschi vergini, che avevano 9-un giorno e non avevano ricevuto la TC. Allo stesso modo, i maschi sperimentali sono stati accoppiati con femmine vergini nelle stesse condizioni. Le mosche femmine accoppiate sono state quindi trasferite in una nuova fiala per la deposizione delle uova per 24 ore e le uova totali deposte nelle fiale sono state contate manualmente. L'indice di fecondità è stato calcolato come la produzione media giornaliera di uova per femmina. Sono state eseguite almeno cinque fiale per trattamento e un totale di mosche n=50-80.

Apprendimento associativo olfattivo e memoria

Le mosche sono state raccolte dopo l'eclosione e pretrattate con 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)servito come gruppi sperimentali e le mosche di controllo non avevano ricevuto CT(Cistanche tubulosa)per 5 e 20 giorni a 25 gradi . Una singola prova di addestramento è stata eseguita secondo uno studio precedente (Dubnau et al., 2001). In breve, circa 100 mosche sono state esposte in sequenza a due odori, 3-ottanolo (OCT, Sigma-Aldrich) o4- metilcicloesanolo (MCH, Sigma-Aldrich). Le mosche esposte al primo odore (stimolo condizionato, CS plus ) sono state accoppiate a scosse elettriche da 80 V e quindi hanno ricevuto un secondo odore (CS-) senza scosse. La capacità di apprendimento è stata determinata immediatamente dopo l'allenamento e le abilità di 3- e {{ 12}}h memory ha condotto la procedura di post-allenamento dei test rispettivamente per 3 e 24 h. Per eseguire il test, le mosche addestrate sono state intrappolate nel punto prescelto di un labirinto a T in cui sono state esposte simultaneamente a OCT e MCH. È stato calcolato un indice di prestazione (PI) per rappresentare l'eliminazione degli odori condizionati. Un PI di zero indicava una distribuzione 50:50 e un PI di 100 mostrava una distribuzione 0:100 lontano dall'odore CS plus.

Misurazioni dei livelli di trascrizione tramite PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)

Le mosche sono state raccolte dopo l'eclosione e pretrattate con 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)per 20 giorni a 25 gradi sono serviti come gruppi sperimentali e le mosche di controllo non avevano ricevuto CT. L'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit RNeasy Mini (Qiagen) e il cDNA è stato sintetizzato dall'RNA totale attraverso una reazione di trascrizione inversa utilizzando una trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità (Thermo Fisher Scientific). I livelli di trascrizione dei geni bersaglio sono stati quantificati attraverso la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (Applied Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR System) utilizzando FastStart SYBR Green Master (Roche) secondo le istruzioni del produttore. Le abbondanze relative del trascritto sono state normalizzate utilizzando il metodo della soglia del ciclo comparativo con un gene di pulizia, RpLP0, come standard interno. Le differenze di espressione relativa nei geni target dei gruppi sperimentali sono state normalizzate a quelle di un gruppo di controllo e presentate come un cambiamento di piega. I primer per i geni bersaglio sono elencati nella tabella supplementare 1.

Costruzione e analisi della rete

Per analizzare l'interpretazione funzionale e i processi biologici mediati dai geni differenzialmente espressi che abbiamo identificato, il Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) è stato utilizzato per annotare e analizzare l'arricchimento della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) pathway e Gene Ontologia per questi geni (Jiao et al., 2012). Per analizzare le interazioni dirette e indirette di geni differenzialmente espressi, l'elenco dei geni è stato anche caricato nel Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) per recuperare le informazioni sull'interazione e generare reti di interazione proteica (Franceschini et al., 2013).

analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche indipendenti e le analisi statistiche sono state eseguite con il software SigmaStat v3.5 (Systat Software, Inc., IL). I dati per l'estensione della durata della vita e le sfide dello stress ossidativo sono stati eseguiti con un numero totale di mosche compreso tra 250 e 350 e il test del log-rank è stato valutato per diverse analisi. I confronti di gruppo per la valutazione della fecondità e il test cognitivo sono stati valutati mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test post-hoc di Dunnett. Altri confronti sperimentali sono stati effettuati eseguendo un test t di Student rispetto al gruppo di controllo. I dati sono rappresentati come media ± SEM ed è stato considerato significativo un valore p <>

Risultati

L'integrazione con CT (Cistanche Tubulosa) aumenta la durata della vita delle mosche

Per esaminare se CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione può prolungare la durata della vita delle mosche, le mosche sono state integrate con 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di CT immediatamente dopo l'eclosione a 25 gradi durante le procedure sperimentali. I nostri dati indicavano che CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione può prolungare la durata della vita di mosche sia maschi che femmine. Come mostrato in Fig. 1A, la durata della vita delle mosche maschi è stata prolungata di tutte le dosi di CT(Cistanche tubulosa). La durata media della vita dei gruppi integrati con 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di CT è aumentata significativamente rispettivamente del 18,9%, 10,3% e 9,9%. CT(Cistanche tubulosa)ha anche aumentato significativamente la durata massima della vita di tutti i gruppi CT rispetto al gruppo di controllo da 88 a 102, 98 e 102 giorni dopo il trattamento con 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa), rispettivamente. Nelle femmine, CT(Cistanche tubulosa)ha aumentato significativamente la durata media della vita dei gruppi CT rispetto al gruppo di controllo (Fig. 1B). La durata media della vita è aumentata fino al 18,8 percento con 5,4 mg/ml di TC(Cistanche tubulosa)e 5,5% e 6,7% con 10,8 e 21,6 mg/ml di CT, rispettivamente. Abbiamo anche osservato che la durata massima della vita è stata significativamente estesa da 91 giorni (controlli) a 109, 98 e 102 giorni dopo il trattamento con 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di TC(Cistanche tubulosa), rispettivamente; l'entità massima dell'aumento della durata massima della vita è stata del 19,8 percento a 5,4 mg/ml di TC(Cistanche tubulosa). I nostri risultati suggeriscono cheCT(Cistanche tubulosa)l'integrazione dietetica estende significativamente la durata della vita di mosche sia maschi che femmine. La curcumina (10 μM) è stata utilizzata come controllo positivo ed efficace nell'estensione della durata della vita, come mostrato nella Figura 1 supplementare.

L'integrazione con CT aumenta la resistenza alla fame e allo stress ossidativo

L'estensione della durata della vita è spesso associata a una maggiore resistenza allo stress ossidativo durante il processo di invecchiamento. Abbiamo valutato seCT(Cistanche tubulosa)l'integrazione aumenta la resistenza allo stress ossidativo. I mosche maschi e femmine sono stati pretrattati con diverse dosi di CT(Cistanche tubulosa)per 20 giorni e valutati per la loro sopravvivenza dopo la fame (Fig. 2A). Il tempo medio di sopravvivenza e la durata massima della vita di entrambi i sessi, rispetto a quelli del gruppo di controllo, hanno mostrato aumenti significativi nei gruppi 5,4 e 10,8 mg/ml CT ma non nel21 .6 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)gruppo. Le mosche pretrattate sono state anche valutate per la loro sopravvivenza dopo le sfide con H2O2 e paraquat, che producono specie reattive dell'ossigeno (ROS) per innescare la senescenza cellulare e la morte cellulare. Abbiamo scoperto che CT(Cistanche tubulosa)ha protetto sia le mosche maschi che femmine dalla tossicità dell'H2O2 e ha esteso la loro durata media e massima della vita (Fig. 2B, p <0.01 e 0,001, a 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa), rispettivamente). È stata anche osservata una tendenza simile che mostra una maggiore resistenza alla sfida del paraquat. Maschio nutrito con mosche con tutte le dosi di CT e femmine, in particolare quelle integrate con 5,4 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa) (Cistanche tubulosa), è sopravvissuto più a lungo dei controlli (Fig. 3A, p < 0.001).="" per="" quanto="" riguarda="" la="" capacità="" di="" arrampicarsi,="" sia="" i="" maschi="" che="" le="" femmine="" hanno="" somministrato="" 10,8="" mg/ml="" di="">(Cistanche tubulosa)ha mostrato una disfunzione locomotoria indotta da paraquat attenuata a 16 ore dopo il paraquatchallenge (Fig. 3B, tutto p < 0.05).="" questi="" risultati="" rivelano="" che="" l'integrazione="" con="" ct="" migliora="" la="" resistenza="" ad="" alcuni="" stress="" ossidativi,="" suggerendo="" che="">(Cistanche tubulosa)-l'estensione della durata della vita indotta è associata a una maggiore difesa antiossidante.

Effetti della TC (Cistanche Tubulosa) sulla capacità riproduttiva

Poiché la teoria dell'invecchiamento indica che il processo di invecchiamento influisce negativamente sulla riproduzione, abbiamo esaminato se la TC(Cistanche tubulosa)ha influenzato l'idoneità riproduttiva analizzando la capacità di deposizione delle uova delle mosche adulte. Le mosche adulte sono state raccolte dopo l'eclosione, separate per sesso e sono state somministrate 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)per 20 giorni. Mosche vergini maschi o femmine somministrate CT(Cistanche tubulosa)sono stati accoppiati con 9-mosche di un giorno senza TC(Cistanche tubulosa). Abbiamo osservato aumenti dose-dipendenti nel numero giornaliero di uova deposte per femmina, vale a dire il 30,3% e il 57,2% di mosche non anziane trattate con 5,4 e 10,8 mg/ml di TC(Cistanche tubulosa), rispettivamente, rispetto ai controlli (Fig. 4, p < 0.05).="" questi="" dati="" suggeriscono="">(Cistanche tubulosa)l'integrazione potrebbe facilitare la capacità riproduttiva delle femmine non anziane, ma probabilmente non lo fa nei maschi anziani.

L'integrazione con TC (Cistanche Tubulosa) migliora le capacità cognitive

Abbiamo determinato se CT(Cistanche tubulosa)la supplementazione ha effetti benefici sull'apprendimento e sulle capacità di memoria, è stato condotto un unico ciclo di training olfattivo-associativo. Valutiamo le prestazioni di apprendimento così come la memoria 3- e 24-h, che è stata considerata rispettivamente la memoria a medio termine e la memoria a lungo termine. In primo luogo, le mosche sono state integrate con varie dosi di CT(Cistanche tubulosa)per 5 giorni. La capacità di apprendimento era simile sia nel gruppo CT che nel gruppo di controllo (Fig. 5A). Per quanto riguarda la memoria 3-h, la TC da 10,8 mg/ml(Cistanche tubulosa)il gruppo tendeva ad avere un indice di prestazione (PI) più elevato rispetto ai controlli (Fig. 5B, 51,5 ± 3,2 contro 42,6 ± 2,1), sebbene non vi siano differenze significative. Inoltre, 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)ha migliorato significativamente la memoria {0}}h delle mosche rispetto ai controlli (Fig. 5C, PI=41.6 ± 3,6 e 45,9 ± 3.0 rispetto a 29,6 ± 2,9, rispettivamente , p < 0.05="" e="" 0.01).="" questi="" risultati="" hanno="" indicato="" che="" la="" ctsupplementazione="" migliora="" la="" formazione="" della="" memoria="" nelle="" giovani="" mosche.="" in="" secondo="" luogo,="" mentre="">(Cistanche tubulosa)l'integrazione ha aumentato la longevità e la resistenza ossidativa delle mosche, abbiamo inoltre determinato se l'integrazione potrebbe anche migliorare il comportamento cognitivo nelle mosche invecchiate. Alle mosche è stato somministrato cibo standard con o senza 5,4, 10,8 e 21,6 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)per 20 giorni per imitare l'invecchiamento; le mosche integrate con queste dosi di CT(Cistanche tubulosa)aveva PI di apprendimento significativamente più alti (67,6 ± 1,9, 72,5 ± 0.5 e 75,2 ± 1,3, rispettivamente) rispetto ai controlli (58.0 ± 2.0; Fig. 5D , p < 0.001), suggerendo che CT(Cistanche tubulosa)ha un effetto benefico nel ritardare il declino dell'apprendimento legato all'età. Risultati simili hanno anche rivelato che la TC da 5,4 mg/ml(Cistanche tubulosa)gruppo ha avuto una conservazione della memoria più efficiente in {{0}} h (Fig. 5E, 47,5 ± 1,9 rispetto al controllo37.{{10}} ± 2,9, p < 0,05)="" e="" 24-="" h="" test="" di="" memoria="" (fig.="" 5f,="" 31,8="" ±="" 3,8="" rispetto="" al="" controllo="" 19,3="" ±="" 2,4,="" p=""><0,01). questi="" risultati="" indicano="" che="">(Cistanche tubulosa)l'integrazione non solo migliora la formazione della memoria nelle giovani mosche, ma ritarda anche il deterioramento del comportamento cognitivo e mantiene un apprendimento e una capacità di memoria più efficienti con l'età.

Percorsi molecolari legati alla promozione della longevità e al miglioramento cognitivo dell'integrazione con TC

CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione sopprime l'AMI e prolunga la durata della vita. Pertanto, abbiamo ragionato sul fatto che i geni correlati all'AMI e alla longevità potrebbero essere determinati valutando l'espressione differenziale tra il controllo e i gruppi CT da 5,4 e 10,8 mg/ml tramite qPCR. I cambiamenti nell'espressione genica delle mosche trattate con CT sono stati confrontati con quelli del gruppo di controllo mostrati in Fig. 6A. L'espressione sovraregolata di diversi geni bersaglio, inclusi Sirt6, Sir2, Sod, p38b e Sirt2, potrebbe essere coinvolta nel processo di invecchiamento. Anche i livelli di trascrizione di S6k, raptor, Psn, Rpd3 e N sono aumentati, suggerendo che la TC(Cistanche tubulosa)l'integrazione cambia la trasduzione del segnale dei percorsi themTOR e Notch. Inoltre, l'integrazione con CT ha influenzato in modo significativo l'espressione dell'mRNA di Nmdar1, Nmdar2 e SkpA. Per evidenziare le interazioni proteiche rilevanti per CT che prolungano la durata della vita e migliorano l'apprendimento e la memoria, è stata creata una rete di interazione proteica basata sulla letteratura di geni schermati con qPCR (Fig. 6B). Ogni nodo rappresenta una proteina, mentre ogni edgedenota un'interazione basata sulla letteratura. I nodi sono raggruppati in base al percorso KEGG e al processo biologico dell'ontologia genica (GOBP). Come mostrato in Fig. 6B, l'interazione neuroattiva ligando-recettore GOBP, che influenza l'apprendimento e la memoria, e un altro GOBP dell'invecchiamento, che è correlato alla durata della vita, sono entrambi collegati alla via di segnalazione di Notch. Inoltre, il GOBP dell'invecchiamento è influenzato dalla via di segnalazione mTOR. Il significato della sovraespressione genica indotta da CT su questi GOBP e percorsi è descritto nella sezione Discussione.

Fig. 6. Analisi di rete di geni differenzialmente espressi. Mosche pretrattate con 5,4 e 10,8 mg/ml di CT(Cistanche tubulosa)e le diete di controllo a 25 gradi per 20 giorni sono state raccolte per quantificare l'espressione genica differenziale. (A) I livelli di trascrizione relativi dei geni target ai controlli sono stati quantificati tramite qPCR. n=4 per ogni gruppo. (B) Geni sovraregolati coinvolti nella trasduzione del segnale cellulare e nella loro rete di interazione. I nodi rappresentano i geni. I geni con sovraespressione sono cerchiati in verde. Gli spigoli rappresentano le interazioni tra i prodotti genici. I tipi di interazione sono indicati da diversi colori nella figura. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore in questa legenda della figura, si rimanda il lettore alla versione web di questo articolo.)

Discussione

Uno squilibrio tra la generazione e l'eliminazione dei radicali liberi da parte dei sistemi di difesa antiossidanti endogeni può causare danni ossidativi ai tessuti con l'età; pertanto, si ipotizza che i radicali liberi svolgano un ruolo fondamentale nella senescenza (Dato et al., 2013). Qui, abbiamo mostrato che CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione nelle mosche prolunga la durata della vita e si traduce in un'elevata tolleranza al danno ossidativo causato da H2O2 e paraquat in entrambi i sessi. Gli studi, correlati con CT(Cistanche tubulosa)andantiaging, sono meno esplorati, ma estratti da C. deserticola, possono prolungare la durata della vita nei topi 8 (SAM-P8) inclini alla senescenza accelerati (Zhang et al., 2014) ed echinacoside, uno dei principali composti esistenti nella TC , ha effetti benefici sull'estensione della durata della vita e sulla tolleranza allo stress in C. elegans (Wang et al., 2015).

Recenti studi sugli animali hanno dimostrato che l'echinacoside ha effetti protettivi contro la tossicità testicolare indotta dal bisfenolo A e migliora la biosintesi del testosterone mediante l'induzione di enzimi steroidei testicolari, inclusi CYP11A1, 3 -HSD e CYP17A1 (Jiang et al., 2016). CT(Cistanche tubulosa)l'estratto di etanolo promuove anche la vitalità e la qualità dello sperma nei ratti (Wang et al., 2016). Sebbene la correlazione tra CT(Cistanche tubulosa)e l'estrogeno deve ancora esplorare, uno studio ha riportato che l'echinacoside aumenta significativamente l'espressione dei recettori degli estrogeni, in modo simile al gruppo trattato con estradiolo nei ratti ovariectomizzati (Li et al., 2013). Poiché la capacità riproduttiva è correlata negativamente con l'età (Kenyon, 2005), abbiamo esaminato se la TC ha benefici nelle mosche invecchiate. Idoneità riproduttiva influenzata dalla TC(Cistanche tubulosa)è stato osservato solo nelle femmine, suggerendo che le femmine potrebbero essere più reattive alla TC(Cistanche tubulosa)integrazione. Questi risultati rivelano che la TC potrebbe possedere un effetto simile agli ormoni sessuali e ritardare la senescenza riproduttiva, coerentemente con l'uso clinico della TC(Cistanche tubulosa)per il trattamento delle disfunzioni sessuali nell'uomo.

L'acteoside può chiarire gli effetti protettivi per ridurre l'apoptosi neuronale e la perdita di memoria in un modello murino senescente indotto da una combinazione di D-galattosio e AlCl3, suggerendo che la TC potrebbe avere il potenziale per avere proprietà neuroprotettive e di potenziamento della memoria (Gao et al., 2015; Peng et al., 2015). I nostri dati hanno indicato che la formazione della memoria è migliorata nelle giovani mosche integrate con CT. Pertanto, abbiamo valutato se CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione è benefica per la ritenzione di memoria durante l'invecchiamento perché è noto che le funzioni cognitive diminuiscono durante il normale invecchiamento. I nostri risultati hanno rivelato che diversi tipi di AMI, tra cui l'apprendimento, la 3- e la 24- memoria, possono essere migliorati dalla TC(Cistanche tubulosa)integrazione per 20 giorni. Secondo i suddetti risultati, CT(Cistanche tubulosa)l'integrazione può avere effetti benefici sulla longevità e sul miglioramento della formazione della memoria, oltre a ritardare sufficientemente l'AMI.

L'utilizzo di modelli animali facilita l'identificazione dei potenziali meccanismi e la dipendenza dal percorso della TC(Cistanche tubulosa)per rallentare l'invecchiamento cerebrale e posticipare l'AMI a livello cellulare. Ci siamo concentrati sui meccanismi molecolari alla base dell'invecchiamento, della trasmissione neuronale e dello stress ossidativo e abbiamo ragionato sul fatto che i geni correlati all'AMI e alla longevità potrebbero essere identificati esaminando l'espressione differenziale tra i gruppi di controllo e CT tramite qPCR. La via di segnalazione Notch è altamente conservata tra le specie dalla Drosophila all'uomo; si esprime nel sistema nervoso centrale adulto per la plasticità neurale e regola la differenziazione neurale insieme al suo inibitore durante lo sviluppo (Presente et al., 2001). I topi portatori di una mutazione eterozigote di Notch sono carenti nell'apprendimento spaziale e nella memoria (Costa et al., 2003). La presenilina (Psn) è necessaria per attivare la scissione di Notch nel dominio intracellulare di Notch e il knockout di Psn provoca la compromissione della plasticità sinaptica e della formazione della memoria (Saura et al., 2004). I nostri dati hanno rivelato una sovraregolazione dose-dipendente di Notch e Psn nella TC(Cistanche tubulosa)mosche integrate, con un livello di espressione invariato di intorpidimento, che implica la via di segnalazione Notch come potente meccanismo di miglioramento della memoria mediante integrazione di CT. Oltre alla segnalazione di Notch, il recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR), il canale ionico guidato dal glutammato e dalla D-serina nei neuroni, controlla la plasticità sinaptica e la funzione di memoria (Furukawa et al., 2005). Il genoma della Drosophila contiene due Le subunità NMDAR, Nmdar1 eNmdar2, ed entrambe sono cruciali nella funzione di memoria. Il knockdown di Nmdar1 nella Drosophila compromette l'apprendimento e la memoria (Xia et al., 2005), mentre la sovraespressione di Nmdar2 nei topi migliora l'apprendimento e la memoria (Tang et al., 2001). I nostri dati hanno mostrato un aumento dose-dipendente della sovraregolazione di Nmdar1 e Nmdar2 nelle mosche integrate con CT, suggerendo un altro potenziale meccanismo di miglioramento della memoria mediante CT(Cistanche tubulosa)integrazione.

La classe O del percorso del fattore di trascrizione forkhead box (FoxO) è conservata tra le specie ed è critica nel metabolismo, nella tolleranza allo stress e nell'estensione della durata della vita (Lehtinen et al.,2006). Le modifiche post-traduzionali, tra cui fosforilazione, acetilazione e ubiquitilazione, regolano l'attività di FoxOs (van der Horst and Burgering, 2007). Il regolatore dell'informazione silenziosa 2 (Sir2; l'omologo nei mammiferi è noto come SIRT1) regola l'attività di FoxO attraverso la deacetilazione e influenza la durata della vita degli animali correlata al percorso del fattore di crescita simile all'insulina (IGF) (Lemieux et al., 2005). Sirt6 defosforila FoxO per causare l'estensione della durata della vita nei topi maschi (Kanfi et al., 2012). I nostri dati hanno rivelato la sovraregolazione di Sir2 e Sirt6 nelle mosche integrate con CT, il che implica che la regolazione FoxO da parte delle camicie potrebbe essere un potente meccanismo dell'estensione della durata della vita da parte della TC(Cistanche tubulosa)integrazione. I radicali liberi prodotti durante i processi metabolici causano danni al DNA e alle proteine, riducendo così la durata della vita. Sir2 è anche un gene di risposta allo stress ossidativo (Whitaker et al., 2013) e la superossido dismutasi (SOD) sovraespressa, che converte O2− in H2O2 e infine in H2O utilizzando catalasi e glutatione perossidasi, è stato segnalato per prolungare la durata della vita nelle mosche ( Le Bourg, 2001). I nostri dati hanno rivelato una sovraregolazione dose-dipendente di Sod e Sir2 nelle mosche integrate con CT, suggerendo che le vie antiossidanti possono essere un potente meccanismo dell'estensione della durata della vita da parte della CT(Cistanche tubulosa)integrazione.

Un altro percorso chiave nell'invecchiamento è regolato dai complessi mTOR mTORC1 e mTORC2, che promuovono entrambi l'invecchiamento dell'organismo in modo conservativo evolutivo. I segnali del recettore dell'insulina attivano mTORC1 attraverso la via fosfoinositide3-chinasi-Akt per promuovere la sintesi proteica e l'infiammazione e per inibire l'autofagia e la glicolisi utilizzando proteine ​​a valle distinte (Johnson et al., 2013). La sintesi proteica è attivata dalla proteina ribosomiale S6 chinasi (S6K), che forma un circuito di feedback negativo per inibire la segnalazione del recettore dell'insulina (Hands et al., 2009). Un bersaglio inibitorio di mTORC1 è la proteina simile della Drosophila (sima), il cui omologo nei mammiferi è noto come fattore 1 alfa inducibile dall'ipossia (HIF1). HIF1 svolge un ruolo protettivo contro i danni dipendenti dall'età ai vasi sanguigni e ai motoneuroni (Oosthuyse et al., 2001; Rivard et al., 2000). I nostri dati hanno rivelato un livello di espressione invariato delle subunità complesse mTOR, tra cui Tor, rictor e raptor, mentre CT(Cistanche tubulosa)integrazione dose-dipendente di S6K e sima sovraregolati, implicando un ruolo protettivo della TC(Cistanche tubulosa)contro l'attività di mTOR.

Conclusioni

Nonostante siano stati identificati alcuni percorsi implicati, la longevità e l'elevata intelligenza hanno contribuito alla TC(Cistanche tubulosa)l'intervento può essere un tratto apoligenico influenzato dall'interazione di più geni e anche altri fattori genetici che non abbiamo chiarito possono modulare il processo di invecchiamento. Per gli anziani, il mantenimento della forma fisica e delle capacità cognitive desiderabili al fine di posticipare o prevenire la demenza e le malattie croniche dovrebbe essere un'acquisizione cruciale dagli studi sull'invecchiamento. Perché CT(Cistanche tubulosa), noto come il "ginseng del deserto", ha un marcato effetto curativo sul rafforzamento dello yang renale, che nutre tutti gli organi e reintegra l'essenza vitale nella medicina tradizionale cinese, riteniamo che il nostro studio fornisca prove a sostegno del trattamento clinico della TC(Cistanche tubulosa)e potrebbe fornire informazioni preziose per lo sviluppo di nuovi farmaci o additivi alimentari non solo per ritardare l'invecchiamento e le malattie legate all'età, ma anche per migliorare la qualità della vita umana.

Conflitto d'interesse

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla China Medical University(CMU103-S-25); China Medical University Hospital (DMR-101-065,DMR-103-099); il Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (NSC 102-2632-B-039-001-MY3, MOST 104-2632-B-039-002) ​​e in parte dal Centro di ricerca e sperimentazione clinica del Ministero della salute e del benessere di Taiwan di eccellenza (MOHW105-TDU-B-212-133019).

Materiali supplementari

Il materiale supplementare associato a questo articolo è reperibile, nella versione online, all'indirizzo doi:10.1016/j.phymed.2017.01.006.

Da: 'Percorsi molecolari legati alla promozione della longevità e al miglioramento cognitivo diCistanche tubulosein Drosophila' diWei-Yong Lin et al

--W.-Y. Lin et al. / Fitomedicina 26 (2017) 37–44

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