Effetti neuroprotettivi dell'estratto di foglie di Glochidion Zeylanicum contro la tossicità indotta da H2O2/glutammato nelle cellule neuronali in coltura e la tossicità indotta da A in Caenorhabditis Elegans 2

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3.3. Effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM contro lo stress ossidativo indotto dal glutammato in cellule neuronali in coltura (HT22 e neuro{4}}a)

Per indagare se GZM agisce contro il danno ossidativo, è stato esaminato il livello di ROS intracellulare. L'evidenza della tossicità indotta dal glutammato nelle cellule HT22 e Neuro-2a è stata mostrata dall'aumento della produzione intracellulare di ROS (1.7-1.{5}}fold) (Figura 4a, b). La produzione indotta dal glutammato di ROS intracellulare è stata chiaramente ridotta dal co-trattamento con l'estratto di GZM (Figura 4a, b). Abbiamo ulteriormente studiato gli enzimi antiossidanti endogeni per supportare gli effetti protettivi dell'estratto di GZM sull'esposizione al glutammato. È stata misurata l'espressione di enzimi antiossidanti, tra cui glutatione-S-transferasi (GST), glutatione perossidasi (GPx), catalasi (CAT) e superossido dismutasi (SOD). Nel nostro studio precedente, è stato riportato che la più alta concentrazione di estratto di GZM (10 ug/mL) mostra una potente attività antiossidante in vitro e in vivo [11]. In accordo con il rapporto, la più alta concentrazione di estratto di GZM (10 ug/mL) ha mostrato una potente neuroprotezione nelle cellule HT22 e Neuro-2a (Figure 2-4). Inoltre, l'estratto GZM (10 ug/mL) ha aumentato l'espressione genica di enzimi antiossidanti, tra cui SOD1, SOD2, GPx, GST e GSTa2, sia nelle cellule HT22 che Neuro-2a, ad eccezione di CAT (Figura 4c, d ). I risultati indicano che l'estratto di GZM protegge dalla citotossicità indotta da glutammato/H2O2- mediante la soppressione della produzione intracellulare di ROS e l'induzione dell'espressione dell'enzima antiossidante.

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3.4. Effetti dell'estratto GZM sull'espressione dei percorsi SIRT1/Nrf2

Per determinare il meccanismo alla base degli effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM, abbiamo studiato i livelli di espressione di SIRTl e Nrf2. Abbiamo scoperto che i neuroni trattati con GZM aumentavano significativamente i livelli di proteine ​​SIRTl e Nrf2 (Figura 5a, b). Inoltre, il trattamento con GZM ha potenzialmente modulato i geni antiossidanti regolati della via di segnalazione SIRT1/Nrf2 NQO1, GCLM, EAAT3 e SIRT1 (Figura 5c, d). I risultati hanno indicato che l'estratto di GZM aumenta la via di segnalazione SIRT1/Nrf2 per promuovere le difese cellulari contro gli insulti tossici.

3.5.Effetti dell'estratto GZM sull'attività di crescita dei neuriti nelle cellule neuro-2a

Per studiare la differenziazione neuronale, le cellule Neuro{0}}a sono state utilizzate come rappresentanti[18]. In accordo con studi precedenti, la deprivazione sierica (DMEM integrato con l'1% di FBS) ha indotto una crescita dei neuriti in Neuro-2a [18]. Le cellule neuro-2a trattate con l'estratto di GZM hanno determinato il potenziamento della neuritogenesi. Le cellule Neuro-2a trattate con estratto GZM hanno aumentato la lunghezza dei neuriti (30,92 um) e il numero di cellule portatrici di neuriti (52,35 percento) rispetto al controllo (1 percento FBS) (lunghezza dei neuriti, 16,30 um; cuscinetto di neuriti cellule, 22,26 percento)(Figura 6a,bg).

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Per garantire ulteriormente il verificarsi di attività di crescita dei neuriti, l'espressione dei marcatori di crescita dei neuriti, la proteina 43 associata alla crescita (GAP-43) [19] e Teneurin-4 (Ten-4) [20] sono stati determinati. L'estratto GZM ha sovraregolato in modo significativo GAP-43 e Ten-4 un'espressione sia a livello di mRNA che di proteine ​​nelle cellule Neuro-2a rispetto al controllo DMSO (1% FBS )(Figura 6c-f) suggerendo l'effetto di neuritogenesi dell'estratto di GZM.

3.6. Effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM contro la paralisi indotta da A in C.elegans

Al fine di esaminare ulteriormente gli effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM in vivo, sono stati utilizzati ceppi transgenici di C. elegans che esprimono A. Per prima cosa abbiamo studiato gli effetti dell'estratto di GZM contro la paralisi indotta da A sui vermi transgenici CL4176 e CL2006. Nel nostro studio precedente, l'estratto di GZM ha mostrato resistenza allo stress ossidativo e proprietà di estensione della durata della vita in C. elegans alla concentrazione non tossica （1-5 ug/mL）【11】. Il ceppo di controllo CL802 (non esprimente A) non ha mostrato paralisi, nonostante il trattamento (dati non mostrati) alla concentrazione testata (1-5 ug/mL).cistanche wirkungAbbiamo scoperto che i vermi CL4176 trattati con estratto GZM avevano mostrato un ritardo nel PT50 (tempo impiegato per la paralisi del 50 percento dei nematodi) rispetto al controllo DMSO (Figura 7a) (Tabella S1, Materiali supplementari). Allo stesso modo, l'estratto GZM ha anche mostrato un ritardo nella paralisi indotta da A dei vermi transgenici CL2006 durante l'età adulta (Figura 7b). I risultati suggeriscono che l'estratto di GZM protegge C.elegans dai danni indotti da A.

3.7. Effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM contro i difetti indotti da A nel comportamento chemiotassico in C.elegans

Per supportare gli effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM in C.elegans, è stato condotto un test di chemiotassi con vermi transgenici CL2122 e CL2355. È stato scoperto che i vermi transgenici CL235 esprimono A 1-42 nelle cellule neuronali, il che ha provocato difetti nella sensibilità alla chemiotassi 【21】. Poiché l'estratto GZM alla concentrazione 1-5 ug/mL ha ritardato la paralisi nei vermi transgenici CL4176, l'estratto GZM da 5 ug/mL è stato scelto per tutti gli esperimenti successivi. Per determinare il potenziale effetto dell'estratto di GZM sul comportamento della chemiotassi, abbiamo usato il diacetile come attrattivo. I risultati sono espressi come l'indice di chemiotassi rispetto a quello del controllo non trattato. Innanzitutto, abbiamo scoperto che il trattamento dell'estratto GZM non ha influito sul comportamento di chemiotassi del mutante CL2122 (ceppo di controllo transgenico) (Figura 7d). I vermi CL2355 trattati con estratto GZM hanno mostrato una risposta chemiosensoriale significativamente migliorata all'attrattivo (diacetile) rispetto al controllo non trattato (Figura 7c), indicando che l'estratto GZM ha il potenziale per migliorare il comportamento chemiotassico in C.elegans contro A .bioflavonoidi degli agrumiPresi insieme, l'effetto dell'estratto GZM sul comportamento A-dipendente di C. elegans può fornire l'opportunità di decifrare la neuroprotezione contro l'AD mediata dall'estratto GZM.

4. Discussione

La malattia di Alzheimer (AD) è una condizione neurodegenerativa che si riscontra prevalentemente nelle popolazioni anziane di tutto il mondo [1]. Al momento, non esiste un trattamento soddisfacente per l'ampia gamma di condizioni patologiche associate all'AD. Lo stress ossidativo è strettamente correlato a malattie neurodegenerative, in particolare AD [3].benefici del cynomoriumI prodotti naturali contenenti potenti antiossidanti possono essere utilizzati come trattamenti alternativi o per la prevenzione di malattie neurodegenerative. Nel presente studio, abbiamo esplorato gli effetti dell'estratto di GZM sulla neurodegenerazione. Questo è il primo rapporto che descrive gli effetti neuroprotettivi dell'estratto di foglie GZ in vitro (cellule neuronali in coltura HT22 e Neuro-2a) e in vivo (C.elegans).

La tossicità neuronale indotta da stress ossidativo è considerata uno dei principali fattori alleati allo sviluppo di malattie neurodegenerative, inclusa l'AD [3]. Alti livelli di glutammato attivano la produzione di ROS, portando a neurotossicità, danno cellulare neuronale e, infine, morte cellulare neuronale [4,6]. Inoltre, il perossido di idrogeno (H2O2) è un mediatore essenziale comune dello stress ossidativo nelle cellule neuronali [22]. Pertanto, in questo studio sono stati utilizzati glutammato e H2O2 come agenti neurotossici per indurre la morte delle cellule neuronali. Per studiare l'effetto neuroprotettivo contro la tossicità del glutammato, sono state impiegate cellule HT22 neuronali ippocampali di topo prive dei recettori ionotropici del glutammato [6]. Inoltre, le cellule del neuroblastoma murino Neuro-2a sono ampiamente utilizzate come rappresentanti nello studio della crescita dei neuriti e della differenziazione neuronale [23]. In primo luogo, gli effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM contro la tossicità indotta da H-Oz/glutammato sono stati determinati utilizzando HT22 e cellule Neuro-2a. Abbiamo scoperto che l'estratto GZM esercitava un potente effetto neuroprotettivo contro la citotossicità indotta da glutammato/H2O2-nelle cellule HT22 e Neuro-2a.

Lo stress ossidativo all'esposizione al glutammato può essere motivo di degradazione strutturale, danno al DNA e disfunzione dei mitocondri, che svolgono ruoli importanti nella morte delle cellule neuronali [6]. Nel nostro studio, la vitalità delle cellule trattate con il solo glutammato era notevolmente bassa (circa il 50 percento in meno) rispetto a quella delle cellule di controllo non trattate. Inoltre, è stato rilevato un notevole aumento del livello di ROS intracellulare nelle cellule HT22 (1.7-volte) e Neuro{5}}a (1,9 volte) dopo il trattamento con glutammato rispetto a quello del controllo non trattato. Di conseguenza, la citotossicità indotta dal glutammato nelle cellule neuronali (HT22 e Neuro{10}}a) è risultata effettivamente alleata con un aumento dei ROS intracellulari a conferma dei precedenti rapporti[24]. Gli enzimi antiossidanti endogeni, CAT, SOD, GST e GPx svolgono ruoli essenziali nella neuroprotezione prevenendo il danno cellulare mediato da ROS [25-27] Abbiamo scoperto che l'estratto GZM può contrastare la citotossicità indotta da H-Oz/glutammato sopprimendo intracellulare Produzione di ROS e aumento dell'espressione di geni antiossidanti corrispondenti al precedente rapporto, in cui gli estratti di GZ stimolavano l'espressione di Sod-3 e Gst-4 in C.elegans [11].

Il fattore di trascrizione NRF2 (fattore nucleare eritroide 2-fattore correlato 2) è il principale meccanismo cellulare di risposta allo stress ossidativo e al danno cellulare [28-31]. La via di segnalazione SIRT1/Nrf2 è un'importante via di segnalazione per bilanciare lo stress ossidativo, che è attivamente coinvolto in varie malattie neurodegenerative [25,26]. SIRT1 gestisce i fattori di trascrizione, comprensivi di Nrf2, che funge da regolatore principale del sistema di difesa antiossidante. Nrf2 si lega all'elemento di risposta antiossidante (ARE), portando a una maggiore espressione di enzimi disintossicanti (fase II) (GPx, GSTol e GSTa2) e geni antiossidanti (SOD, CAT, NQO1, GCLM e EAAT3)[25,26] .In accordo con i rapporti, l'espressione delle proteine ​​SIRT1 e Nrf2, nonché i geni antiossidanti, inclusi NQO1, GCLM, EAAT3 e SIRT1, sono stati sovraregolati durante il trattamento con GZM. Inoltre, dall'espressione dell'enzima antiossidante endogeno, anche SOD, GPx, GSTol e GSTa2 erano significativamente aumentati, il che potrebbe essere dovuto all'attivazione di Nrf2/ARE. I risultati sono in accordo con il nostro studio precedente, in cui è stato dimostrato che gli estratti di GZleaf forniscono proprietà di resistenza allo stress ossidativo in C. elegans attraverso meccanismi dipendenti da SKN-1/Nrf-2 [11]. Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che le proprietà di difesa antiossidante dell'estratto di GZM nelle cellule neuronali in coltura (HT22 e Neuro{28}}a) coinvolgono la via di segnalazione SIRT1/Nrf2. È stato dimostrato che NRF2 influenza la direzione del metabolismo del glutammato derivato dalla glutammina, inclusa la generazione del glutatione antiossidante (GSH) per il mantenimento dell'omeostasi redox[13]. In questo studio, ci concentriamo innanzitutto sulle proprietà antiossidanti dell'estratto di GZM attraverso la via di segnalazione SIRT1/Nrf2, che è una nota difesa antiossidante. Abbiamo scoperto che l'estratto di GZM aumenta la via di segnalazione SIRT1/Nrf2 per promuovere la difesa cellulare contro gli insulti tossici. Tuttavia, lo studio degli effetti dell'estratto di GZM sulla via di segnalazione SIRT1/Nrf2 in condizioni di tossicità indotte dal glutammato è un argomento interessante per confermare le proprietà antiossidanti dell'estratto di GZM attraverso la via di segnalazione SIRT1/Nrf2.

Gli squilibri tra radicali liberi e antiossidanti (stress ossidativo) sono stati implicati nella progressione delle malattie neurodegenerative [1,3]. Nell'ultimo decennio, i composti polifenolici sono stati ampiamente studiati negli effetti neuroprotettivi a causa delle loro proprietà antiossidanti[13,32-35].metodo di estrazione dei flavonoidi pdfInoltre, sono emersi in il trattamento alternativo delle malattie neurodegenerative. Alla luce di quanto sopra, i nostri risultati sono supportati dal fatto che gli effetti benefici del GZM sugli effetti neuroprotettivi sono probabilmente dipendenti dalla sua attività antiossidante.

La neuritogenesi o escrescenza dei neuriti gioca un ruolo essenziale nello sviluppo neuronale [32].giacinto del desertoLe proprietà di crescita dei neuriti dell'estratto di GZM sono state determinate utilizzando cellule Neuro-2a. È stato dimostrato che l'estratto di GZM esercita attività di crescita dei neuriti poiché aumentava la lunghezza dei neuriti e il numero di cellule portatrici di neuriti. Inoltre, questi fenomeni sono stati ulteriormente confermati dall'aumentata espressione dei marcatori di crescita dei neuriti GAP-43 e Ten-4. Diversi studi hanno riportato che i polifenoli, incluso l'acido gallico [32,34], il catechin [ 13,40,41] e quercetina[33,42,43], promuovono l'attività di crescita dei neuriti. La presenza di composti fenolici, nonché di acido gallico, catechina e quercetina nell'estratto di GZM può essere responsabile del comportamento osservato (Figura supplementare S1)[1,12].

Le placche A e le proteine ​​tau sono note caratteristiche dell'AD [4,45]. La produzione e la deposizione anormali di A giocano un ruolo importante nella patogenesi dell'AD [44]. C.el egans è un organismo modello utile per comprendere la neurodegenerazione associata all'età [47] Questo verme ha un sistema nervoso di base che contiene solo 302 neuroni che mappano in modo completo la connettività neuronale [47]. Inoltre, il verme transgenico mostra l'accumulo di carbonili proteici e ROS, simile alla patologia dell'AD [48]. Pertanto, abbiamo sfruttato la correlazione stabilita tra l'espressione A e i sintomi apparenti, inclusi paralisi e comportamento chemiotassico, nel modello transgenico di C.elegans. Il fenotipo della paralisi nei ceppi A che esprimono (nei muscoli) CL4176 e CL2006 è stato studiato per la prima volta. L'estratto di GZM ha ritardato l'insorgenza indotta da A e la paralisi invecchiata rispettivamente nei vermi transgenici CL4176 e CL2006. Per collegare la tossicità di A con le funzioni neurologiche, è stato esplorato il comportamento chemiotassico di un ceppo che esprime (nei neuroni) CL2355. È stato riscontrato che l'estratto di GZM mostra miglioramenti nei difetti comportamentali della chemiotassi nei vermi transgenici CL2355 contro A . Collettivamente, questi risultati indicano che l'estratto di GZM protegge le funzioni muscolari e neurologiche in C elegans dalla tossicità indotta da A. Diversi studi hanno riportato che i fattori di trascrizione DAF-16 e SKN-1 svolgono un ruolo cruciale nella deposizione di A nei nematodi[47,48]. Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che l'estratto di foglie GZM può stimolare la resistenza allo stress ossidativo attraverso le vie di segnalazione DAF-16/FoxO e SKN-1/Nrf-2, portando a miglioramenti nella la durata della vita e la salute di C. elegans [11]. Ipotizziamo che DAF-16/FoxO e SKN-1/Nrf-2 possano svolgere un ruolo nella protezione mediata dall'estratto GZM contro la tossicità A.

Diversi studi hanno riportato che gli antiossidanti fenolici possono proteggere dalla neurotossicità indotta dal glutammato, dai peptidi A e dallo stress ossidativo, che dipende principalmente dalle vie di segnalazione Nrf2/ARE [13,17,{3}}]. L'estratto di GZM contiene composti fenolici tra cui acido gallico, catechina e quercetina (Figura supplementare S1)[1,12]. Pertanto, gli effetti neuroprotettivi mediati dalla via di segnalazione SIRT1/Nrf2 possono derivare dalla presenza di composti bioattivi nell'estratto GZM. Sono necessari ulteriori studi per confermare il coinvolgimento degli effetti neuroprotettivi ed esplorare più possibili bersagli dell'estratto di GZM.

5. Conclusioni

In conclusione, in questo studio sono stati dimostrati gli effetti neuroprotettivi dell'estratto GZM contro la tossicità indotta da H202/glutammato/A e le proprietà di crescita dei neuriti. L'estratto di GZM protegge dalla tossicità ossidativa indotta da H4O2/glutammato inibendo l'accumulo di ROS intracellulari e aumentando gli enzimi antiossidanti endogeni attraverso la via di segnalazione SIRT1/Nrf2. Inoltre, l'estratto di GZM protegge dalla tossicità indotta da A in C. elegans. Oltre ai suoi effetti neuroprotettivi, l'estratto di GZM ha mostrato effetti benefici nel promuovere l'attività di crescita dei neuriti. Gli antiossidanti che sono correlati nel processo di superamento della tossicità indotta dallo stress ossidativo e dell'attività che induce la crescita dei neuriti sono diventati i principali bersagli della terapia neuroprotettiva. L'estratto di GZM mostra proprietà neuroprotettive che non solo sono protettive contro la tossicità indotta da H202/glutammato/A, ma promuovono anche l'attività di crescita dei neuriti. Gli effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM sono stati confermati con successo in colture di cellule neuronali (HT22 e Neuro{15}}a) e in modelli di C. elegans. Il presente studio conferma, per la prima volta, i benefici effetti neuroprotettivi dell'estratto di GZM, suggerendo che G.zeylanicum potrebbe essere un candidato neuroprotettivo per la prevenzione e il trattamento dell'AD e di altri disturbi neurodegenerativi legati allo stress ossidativo. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi in organismi modello più complessi per illuminare i componenti attivi dell'estratto di GZM e le vie meccanicistiche coinvolte nella neuroprotezione al fine di supportare il potenziale terapeutico degli estratti vegetali per il trattamento alternativo o aggiuntivo delle malattie neurodegenerative.

Questo articolo è estratto da Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology