Nuovi strumenti di imaging per misurare il numero di nefroni in vivo: opportunità per la nefrologia dello sviluppo

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Il mammiferoreneè un organo complesso, che richiede la funzione concertata di milioni di nefroni. Il numero di nefroni è costante dopo la nefrogenesi durante lo sviluppo e la perdita di nefroni nel corso della vita può portare a suscettibilità a malattie acute omalattia renale cronica. Sono in fase di sviluppo nuove tecnologie per contare i singoli nefroni nel rene in vivo. Questa recensione delinea queste tecnologie ed evidenzia la loro rilevanza per gli studi sullo sviluppo e la malattia renale umana.

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introduzione

Il rene dei mammiferi è un organo complesso che si è evoluto per controllare un'ampia gamma di processi fisiologici. Questi processi includono il volume del sangue, la pressione sanguigna, la pressione osmotica, la rimozione dei rifiuti e l'omeostasi dei metaboliti. Il normale sviluppo renale richiede la formazione reciproca della gemma ureterica e del mesenchima metanefrico. Questo è seguito da un processo di ramificazione iterativo e da una cascata di segnali per mantenere un pool rinnovabile di cellule progenitrici, che producono le cellule differenziate che svolgono le diverse funzioni dei reni.

La durata e la fine della nefrogenesi variano tra le specie. Negli esseri umani e nei primati non umani, la nascita e la fine della nefrogenesi umana si verificano in momenti simili; la nefrogenesi termina a circa 35 settimane di gestazione nell'uomo. Le specie che partoriscono cucciolate hanno spesso un periodo variabile di nefrogenesi postnatale naturale. Il numero di nefroni varia in base alla specie, al ceppo,sesso, e fattori ambientali e genetici? Il numero del nefrone umano è altamente variabile (da 200,000 a 2,7 milioni), sulla base degli studi effettuati all'autopsia. Un'ampia gamma di numeri di nefroni è stata osservata anche in un'autopsia neonatale umana, suggerendo che questo intervallo è stabilito durante la nefrogenesi.

Il numero di nefrone può determinare la suscettibilità a numerose patologie renali e la perdita di nefrone può accelerare lo sviluppo della malattia renale cronica (CKD). È quindi importante considerare le cause del basso numero e della perdita di nefroni e capire perché nell'uomo rimane un intervallo così ampio nel numero di nefroni. Vi sono prove crescenti che la genetica ei fattori epigenetici determinati dalla salute e dalla nutrizione materna sono determinanti critici della nefrogenesi. Lo sviluppo fetale è vincolato dall'energia disponibile dalla madre, regolata dalla funzione placentare. La pressione di selezione evolutiva governata dall'idoneità riproduttiva ha dato la priorità alla crescita cerebrale rispetto allo sviluppo fetale e postnatale del rene, con oltre il 50% del tasso metabolico a riposo assegnato al cervello durante il primo anno di vita. Pertanto, la denutrizione materna, lo stress ambientale o l'infezione portano a una restrizione della crescita intrauterina o al parto prematuro e alla sottoregolazione della metilazione del DNA nelle cellule progenitrici del nefrone. I meccanismi molecolari necessari per sviluppare un rene sano sono stati studiati principalmente in modelli di roditori. Tuttavia, fino a poco tempo fa c'erano pochi confronti diretti tra lo sviluppo renale nei roditori e nell'uomo.

La perdita di nefrone è tipicamente superata attraverso l'ipertrofia e l'iperfiltrazione dei nefroni rimanenti, evidenziate dal mantenimento dell'intero rene GFR. L'ipertrofia è un adattamento a breve termine per mantenere l'omeostasi metabolica durante gli anni riproduttivi. Tuttavia, ci sono vincoli fisici sull'ipertrofia adattativa, limitati dall'area della superficie tubulare necessaria per il trasporto e dalla resistenza al flusso risultante dall'aumento della lunghezza del tubolare. Questo vincolo viene superato nei mammiferi più grandi (balene) confezionando 100 milioni di nefroni in piccole unità unipapillari che contengono tubuli corti. Oltre gli anni riproduttivi, l'aumento del danno ossidativo cellulare derivante dall'accumulo di fattori di stress (ischemia, ipossia, infezione) promuove la perdita continua di nefroni che si sovrappone alla senescenza, riflessa da una riduzione del 50% del numero di nefroni nella popolazione normale che invecchia.

Nonostante la nostra crescente comprensione dello sviluppo renale e del ruolo dell'ambiente gestazionale nello stabilire la salute renale, ci manca ancora una visione integrata dei singoli nefroni nel contesto dell'organo intatto e funzionante. Gli attuali metodi imparziali per la stima del numero glomerulare richiedono la distruzione del rene, limitandone il potenziale nell'analisi longitudinale e nell'uso in vivo. Lo sviluppo di tecniche di imaging non invasive per monitorare il numero di nefroni funzionanti durante tutto il ciclo di vita fornirebbe informazioni chiave per prevedere la progressione della malattia renale cronica e per misurare l'efficacia di nuovi interventi.

Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti radiologici per affrontare queste sfide e fornire un mezzo non invasivo per monitorare e misurare la massa del nefrone in vivo. Questa tecnologia ha il potenziale per fornire nuove informazioni sullo sviluppo renale e sul suo ruolo nella progressione della malattia più avanti nella vita. Le osservazioni disponibili attraverso questa tecnologia includono il numero del nefrone, il volume e l'ipertrofia glomerulare e possibilmente la funzione del singolo nefrone. Questa revisione delineerà lo stato attuale di questa nuova tecnologia e fornirà una visione delle sue potenziali applicazioni nella scienza preclinica e nelle indagini cliniche.

Approcci ex vivo alla misurazione del numero di nefroni e della dimensione glomerulare

Gli approcci più ampiamente sviluppati per misurare il numero di nefroni e la dimensione glomerulare si basano sulla stereologia design-based. Il tessuto viene preparato e sezionato per la microscopia e le dimensioni delle strutture, come i glomeruli, osservate sui vetrini vengono analizzate per dedurre i volumi medi delle strutture nel tessuto originale. Questo può essere eseguito in organi asportati o da tessuto bioptico campionando sistematicamente e casualmente il tessuto. La tecnica del dissettore-frazionatore ha rivelato differenze basate sulla popolazione nel numero di nefroni e nell'iperfiltrazione negli esseri umani25 ed è stata ampiamente utilizzata per studiare modelli animali di malattie umane.

Per evitare il sezionamento richiesto dalla stereologia, sono stati recentemente sviluppati nuovi approcci di imaging per integrare i dati bioptici e per misurare il numero di nefroni. La risonanza magnetica (MRI) si basa più spesso sul rilevamento di protoni d'acqua nei tessuti, principalmente dall'acqua, utilizzando campi magnetici. Il soggetto o campione è posto all'interno di un ampio campo magnetico. Le tipiche intensità del campo magnetico utilizzate per la risonanza magnetica clinica vanno da 1,5 T a 7 T. I sistemi MRI preclinici spesso impiegano intensità di campo molto più grandi per un elevato rapporto segnale-rumore e un contrasto e una risoluzione dell'immagine migliorati. La risonanza magnetica fornisce un'ampia gamma di tecniche di contrasto dell'immagine per l'immagine dei tessuti molli e non richiede radiazioni ionizzanti. La risonanza magnetica fornisce anche un'alta risoluzione sia nei sistemi preclinici che clinici.

La ferritina cationica (CF) è stata introdotta come agente di contrasto iniettato per via endovenosa per rilevare e visualizzare i glomeruli in tutto il rene mediante risonanza magnetica. Le nanoparticelle cariche, inclusa la ferritina, sono state utilizzate per decenni per studiare la struttura e la funzione della membrana basale utilizzando la microscopia elettronica (EM). La CF è stata originariamente creata come tracciante per la microscopia elettronica da Danon, che ha dimostrato che potrebbe legarsi a siti anionici . La molecola di ferritina viene rilevata in EM a causa del suo nucleo di ossido di ferro denso di elettroni. Questo stesso nucleo di ossido di ferro è spesso magnetico, il che lo rende rilevabile da MR. Questa tecnica, la risonanza magnetica con ferritina cationica (CFE-MRI), è stata utilizzata per contare ogni glomerulo nei reni di ratto sani30, ex vivo, ed è stata utilizzata per misurare la distribuzione intrarenale dei volumi glomerulari. La CFE-MRI è stata utilizzata anche per contare e misurare ogni glomerulo nel rene del topo3] e i volumi glomerulari sono stati mappati per rivelare la variazione spaziale delle dimensioni glomerulari. Questi risultati sono stati confermati da più gruppi. Sia le misurazioni del ratto che del topo utilizzando CFE-MRI sono state convalidate dalla stereologia del dissettore-frazionatore.

La CFE-MRI è stata eseguita anche in reni di donatori umani intatti in cui la FC è stata iniettata direttamente nell'arteria renale e il rene è stato lavato con soluzione fisiologica prima di essere fissato e sottoposto a imaging. La CFE-MRI nei reni umani ha fornito una vista tridimensionale delglomerulare renalemorfologia, che mostra ipertrofia glomerulare eterogenea e regioni di perdita di nefrone probabilmente associate all'ipertensione non trattata del paziente. Le regioni di perdita di nefrone sono state correlate con l'istologia delle stesse regioni, dimostrando sia la sclerosi vascolare che quella glomerulare.

Questi studi iniziali si sono concentrati sui cambiamenti nel numero di nefroni e nella morfologia glomerulare con malattie renali sia croniche che acute. In Bennett et al{0}}, la distribuzione della FC nel rene è stata ridistribuita a causa della patologia glomerulare precoce in un modello di ratto di glomerulosclerosi focale e segmentale, prima della presentazione della proteinuria. Nei topi, la CFE-MRI è stata applicata per rilevare e mappare l'ipertrofia glomerulare nel modello di oligosindattilismo(Os/plus) di riduzione del nefrone31. Più recentemente lo abbiamo dimostratodanno renale acutoin un modello di coniglio neonatale ha causato una perdita rilevabile di glomeruli con riorganizzazione vascolare35 Pertanto, il monitoraggio dei cambiamenti nell'etichettatura della FC mediante risonanza magnetica può essere uno strumento importante per comprendere l'impatto del danno durante lo sviluppo e il suo impatto sulla salute renale più avanti nella vita.

Ci sono alcune considerazioni importanti nella convalida della CFE-MRI utilizzando altre tecniche, come la stereologia dei direttori-frazionatori impiegata in questi primi studi. La CFE-MRI può misurare solo i glomeruli che sono perfusi, mentre gli approcci istologici rilevano anche i glomeruli che non lo sono. Se i due vengono confrontati direttamente quando ci sono glomeruli sotto o non perfusi, le misurazioni della risonanza magnetica saranno inferiori. I fattori strutturali e funzionali, come la pressione oncotica, le velocità di perfusione capillare e la struttura del GBM, che influenzano l'accumulo di FC nel GBM, sono poco conosciuti, quindi è possibile che l'assorbimento glomerulare sia modulato da processi patologici che modulano la CFE-MRI in modi diversi che non sono stati descritti. Infine, il danno GBM o la proteinuria possono causare la fuoriuscita della FC nei tubuli, portando a un'etichettatura diffusa piuttosto che puntata dei glomeruli osservata dalla risonanza magnetica. Negli studi sullo sviluppo, la struttura della carica GBM e la filtrazione glomerulare variano con l'età gestazionale. In tutti questi casi, è importante comprendere i parametri coinvolti nell'etichettatura CF attraverso continue indagini. È anche fondamentale stabilire la tossicologia della FC, che appare minima negli animali sani ma deve essere studiata con ogni nuovo modello.

La TC a raggi X è stata recentemente dimostrata per la misurazione della microstruttura renale e la mappatura dei numeri di nefroni nel rene intatto, ex vivo. Un vantaggio principale della TC è la sua semplicità e velocità di utilizzo e il basso costo rispetto alla risonanza magnetica. Uno svantaggio è l'uso di radiazioni ionizzanti, che possono limitarne l'uso in vivo o in applicazioni cliniche. Tuttavia, C offre imaging ad alta risoluzione di strutture etichettate ex vivo che possono quindi essere co-registrate con l'anatomia dei tessuti molli utilizzando altre modalità di imaging.

La microscopia a foglio luminoso dopo la compensazione ottica dell'intero organo è stata utilizzata per misurare il numero glomerulare e la dimensione del ciuffo capillare nei reni di topo intatti. Questo approccio attraente ha il vantaggio dell'automazione e della visualizzazione dell'intero glomerulo a risoluzione microscopica nell'intero organo o in campioni di organi di grandi dimensioni.

Approcci in vivo alla misurazione diretta del numero di nefroni e della dimensione glomerulare

Strumenti consolidati ed emergenti per misurare il numero di nefroni ex vivo hanno permesso di dedurre l'eterogeneità inter e intra-soggettiva nel numero di nefroni e nel volume glomerulare. Questi strumenti stanno iniziando a colmare le lacune critiche nella nostra conoscenza della struttura del rene e di come si collega alla funzione nel rene, in vivo. Queste domande includono: 1) Qual è la relazione tra numero e dimensione glomerulare con la filtrazione del nefrone individuale?, 2) Qual è la distribuzione spaziale del numero di nefrone e della dimensione glomerulare e la sua relazione con la patologia? e 3) Il tasso di senescenza glomerulare cambiamento di salute e malattie renali? Clinicamente, è possibile stimare il numero di nefroni in vivo utilizzando una combinazione di raggi X/TC e biopsia. Questo tipo di lavoro sta iniziando a fornire un collegamento critico tra il numero di nefroni e la funzione renale. Diverse pubblicazioni hanno dimostrato che la risonanza magnetica può essere utilizzata per rilevare i singoli glomeruli in un animale vivente. I primi lavori in quest'area utilizzando CFE-MRI erano limitati a specifiche regioni del rene. In un rapporto, è stato sviluppato un amplificatore wireless per aumentare localmente il segnale nel rene per consentire la co-registrazione di singoli nefroni durante la filtrazione e la funzione4. Più recentemente, due pubblicazioni hanno riportato misurazioni di singoli glomeruli in vivo nell'intero rene mediante CFE-MRI sia nei ratti che nei topi. Questo approccio è stato utilizzato anche in un esperimento longitudinale, dimostrando che la CFE-MRI può essere potenzialmente utilizzata per monitorare i cambiamenti nel numero di nefroni nel tempo in risposta alla terapia o per monitorare lo sviluppo renale.

Una sfida primaria con CFE-MRI in vivo è la sensibilità. La deossiemoglobina nel sangue è paramagnetica e può causare un artefatto di suscettibilità magnetica nei capillari che riduce la gamma dinamica per rilevare i glomeruli marcati con CF. Per risolvere questo problema, la ferritina può essere modificata per incorporare più ferro e il nucleo di ossido di metallo del CF può essere modificato per renderlo più facilmente rilevabile senza l'artefatto di suscettibilità. Tuttavia, altre strategie di rilevamento comportano compromessi nella resa del prodotto o nella velocità di imaging, quindi la prima dimostrazione di CFE-MRI non ha utilizzato questi approcci. La chiave per CFE-MRI è controllare il movimento e garantire che la bobina a radiofrequenza (RF) sia sufficientemente sensibile sull'intero rene.

Prospettive per la nefrologia dello sviluppo: struttura e funzione Qui abbiamo descritto strumenti emergenti per misurare direttamente la dotazione di nefrone, sia ex vivo che in vivo. La TC a raggi X fornisce una rapida acquisizione di immagini e fenotipizzazione, ex vivo. Strumenti come la TC a raggi X combinata con la biopsia hanno il vantaggio di essere utilizzati rapidamente in clinica, con lo svantaggio di invasività, uso di radiazioni ionizzanti e potenziale distorsione del campione. Gli approcci basati sulla risonanza magnetica superano la necessità di radiazioni ionizzanti e forniscono un contrasto combinato dei tessuti molli e possono essere utilizzati sia ex vivo che in vivo. La CFE-MRI richiede l'iniezione di un mezzo di contrasto che deve essere considerato sicuro prima di poter essere utilizzato in clinica. Mentre la misurazione in vivo del numero di nefrone è agli albori, le nuove sequenze di acquisizione delle immagini per l'imaging rapido, oltre a hardware e elaborazione delle immagini migliorati, hanno il potenziale per rendere questi strumenti MRI pratici per l'uso di routine. Man mano che la tecnica matura, verranno implementate altre sequenze di impulsi per ridurre la sensibilità all'artefatto di suscettibilità indotta da CF e la fisica dell'ambiente magnetico locale sarà meglio compresa per rivelare potenzialmente ancora più informazioni. Esistono anche opportunità uniche per combinare la morfologia glomerulare e tubulare con altre strategie di acquisizione delle immagini per fornire una visione completa della microstruttura, dell'anatomia macroscopica e della fisiologia del rene in vivo. Queste informazioni combinate possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo della perdita di nefrone nel tempo, una caratteristica primaria delle malattie renali acute e croniche e delle malattie renali progressive durante lo sviluppo.

Il recente perfezionamento della visualizzazione e della segmentazione delle immagini, attraverso strumenti analitici o intelligenza artificiale, consente di estrarre grandi quantità di informazioni da immagini tridimensionali di tessuti. Alcune tecniche emergenti, come l'imaging del tensore di suscettibilità, promettono di fornire nuove informazioni che possono essere utilizzate come surrogato della microstruttura dei tessuti. Nel rene, questo può facilitare le mappe combinate di glomeruli, tubuli, vascolarizzazione e interstizio da una combinazione di immagini co-registrate. Potrebbe anche essere possibile co-registrare direttamente queste immagini all'imaging ottico o alle informazioni ottenute con altre modalità di imaging radiologico. È importante in ogni caso convalidare ampiamente questi nuovi strumenti e eventualmente standardizzare alcuni protocolli di acquisizione tra le istituzioni per fornire un elevato livello di riproducibilità. La disponibilità e la facilità d'uso di nuovi strumenti probabilmente guideranno nuovi approcci nella scienza dei dati per integrare le informazioni provenienti da tutti questi meccanismi e modalità di contrasto per offrire una nuova visione quantitativa del rene in un gran numero di soggetti. In fase di sviluppo, questi strumenti possono essere eventualmente combinati in studi longitudinali. L'adozione e la creazione di un nuovo machine learning sarà fondamentale per questo sforzo.

Un'altra sfida è tradurre le misurazioni dei numeri di dotazione di nefroni per l'imaging in vivo nell'uomo49. Una misura clinica del numero di nefroni o del volume glomerulare consentirebbe potenzialmente terapie individualizzate su misura per le osservazioni in pazienti specifici e potrebbe fornire una visione completamente nuova del rene umano sviluppo.