Numerosi soluti legati alle proteine ​​vengono eliminati dal rene con alta efficienza

Il rene elimina numerosi soluti dal plasma; tuttavia, la ritenzione di questi soluti causa malattia uremica quando i reni falliscono. Sappiamo molto poco su quali soluti ritenuti siano tossici, limitando la nostra capacità di migliorare le terapie di dialisi.

Per esplorare questo, abbiamo utilizzato la spettrometria di massa non mirata per identificare i soluti eliminati in modo efficiente dal rene. La spettrometria di massa ad alta risoluzione ha rilevato 1808 caratteristiche nell'ultrafiltrato di plasma e urina di 5 individui con funzione renale normale. I tassi di clearance stimati di 1082 picchi erano superiori alla clearance della creatinina che indica la secrezione tubulare.

Un'ulteriore analisi ha identificato 90 caratteristiche che rappresentano i soluti con tassi di clearance stimati più significativi del flusso plasmatico renale. La spettrometria di massa quantitativa con diluizione isotopica stabile ha confermato che l'eliminazione efficiente di questi soluti è resa possibile dalla combinazione del legame con le proteine ​​plasmatiche e della secrezione tubulare. La spettrometria di massa tandem ha stabilito l'identità chimica di 13 soluti tra cui acido ippurico, indossil solfato e p-cresolo solfato. È stato riscontrato che questi 13 soluti eliminati in modo efficiente si accumulano nel plasma dei pazienti in emodialisi, con livelli liberi che aumentano di oltre 20- volte il normale per tutti tranne due. Pertanto, un'ulteriore analisi dei soluti eliminati in modo efficiente dalla secrezione nel rene nativo può fornire una potenziale via per l'identificazione delle tossine uremiche.

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PAROLE CHIAVE

spettrometria di massa;funzionale renale;tossine

Il rene rimuove numerosi soluti di scarto dal plasma sanguigno. Quando la funzione renale è persa, questi soluti si accumulano nel corpo e causano la malattia uremica che culmina nella morte a meno che la funzione renale non sia parzialmente sostituita dalla dialisi.

Al momento, sappiamo molto poco di ciò che è tossico e questa mancanza di conoscenza limita la nostra capacità di migliorare il trattamento. 1,2 Il progresso è stato lento in parte perché il numero di soluti trattenuti quando i reni falliscono è molto grande. 1., 3., 4., 5., 6. Questo studio ha utilizzato la spettrometria di massa non mirata per trovare i soluti rimossi in modo efficiente dal plasma dal rene.

Ha rivelato che ci sono molti soluti di scarto per i quali i tassi di clearance renale normalmente superano il flusso plasmatico renale. Tali legami ad alta clearance richiedono proteine ​​plasmatiche e secrezione tubulare attiva. Le concentrazioni di tali soluti possono salire a livelli elevati quando la funzione renale viene sostituita dall'emodialisi che elimina i soluti solo per diffusione. La stampa ha affermato che l'evoluzione ha consentito al rene di rimuovere le sostanze tossiche in modo efficiente, l'identificazione di soluti con alti tassi di clearance renale potrebbe fornire una via per l'identificazione delle tossine uremiche.

RISULTATI

Le misurazioni sono state effettuate su quattro uomini e una donna con funzione renale normale, come evidenziato da una clearance media della creatinina di 142 ± 22 ml/min per 1,73 m2. Un totale di 1808 caratteristiche sono state rilevate sia nell'urina che nel plasma ultrafiltrato mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione non mirata. I tassi di clearance per queste caratteristiche sono stati stimati come il tasso di escrezione urinaria diviso per la concentrazione nell'ultrafiltrato plasmatico. I valori di clearance sono quindi espressi in termini di concentrazione di soluto non legato "libero" nel plasma piuttosto che di concentrazione di soluto totale.

La distribuzione dei tassi di clearance stimati relativi alla clearance della creatinina è illustrata nella Figura 1. Per 1082 caratteristiche, i tassi di clearance stimati erano superiori alla clearance della creatinina con un tasso di scoperta falsa di q<0.05. Because the creatinine clearance is slightly higher than the glomerular filtration rate (GFR), these features were considered likely to represent solutes secreted by the renal tubules. There were, in contrast, only 290 features with estimated clearance rates less than the creatinine clearance with a false discovery rate of q<0.05.

Figura 1. La linea blu rappresenta la distribuzione dei tassi di clearance stimati relativi alla clearance della creatinina per le caratteristiche 1808 riscontrate nell'ultrafiltrato plasmatico e urinario di soggetti normali. I triangoli rossi rappresentano le 13 caratteristiche per le quali l'identità è stata confermata dall'analisi degli standard dei reagenti.

Per 163 caratteristiche, i tassi di clearance stimati erano più di sette volte la clearance della creatinina. Ciò ha suggerito che la loro clearance superava il flusso plasmatico renale, che è circa quattro volte la clearance della creatinina.

Tra queste 163 caratteristiche, 90 sono state considerate rappresentare composti chimici unici dopo l'eliminazione dei duplicati e le caratteristiche sono state considerate per rappresentare dimeri, addotti, isotopi o artefatti sulla revisione manuale dei cromatogrammi (Tabella Supplementare S2 online). I composti con valori di massa corrispondenti sono stati ricercati nei database standard e le identità chimiche di 13 di queste 90 caratteristiche sono state stabilite confrontando i loro tempi di ritenzione cromatografica e gli spettri di spettrometria di massa tandem (MS/MS) con quelli degli standard dei reagenti (Tabella 1 e Supplemento Tabella S2 in linea). Per 40 delle 90 caratteristiche di interesse, tuttavia, non sono stati trovati composti candidati tra i metaboliti umani noti con una massa entro 3 parti per milione (ppm) (Tabella supplementare S2 online).7,8 I valori di clearance sulla velocità del flusso plasmatico renale sono stati possibile perché le concentrazioni "libere" di questi soluti nell'ultrafiltrato plasmatico erano inferiori alle loro concentrazioni plasmatiche totali, presumibilmente riflettendo il legame con le proteine ​​plasmatiche.

Sebbene tutti i soluti eliminati in modo efficiente fossero legati alle proteine, l'entità del legame variava ampiamente, con la frazione libera compresa tra il 2 e il 52 percento della concentrazione plasmatica totale. Il calcolo in termini di concentrazione plasmatica totale ha prodotto valori di clearance molto più bassi per i soluti legati (Tabella supplementare S2 online).

Tabella 1. I soluti vengono eliminati in modo efficiente dal rene nativo e dal loro accumulo nei pazienti in emodialisi.

I valori sono media±sd Clearance/clearancecre è il rapporto medio tra clearance dei soluti e clearance della creatinina. La frazione libera è il livello nell'ultrafiltrato plasmatico come percentuale del livello plasmatico totale. Emodialisi/normale è il rapporto tra la concentrazione media prima del trattamento nei pazienti in emodialisi e la concentrazione media nei soggetti normali.

a

Indica q<0.05 for the elevation of the solute concentration in hemodialysis patients above the level in normal subjects.

b

Indica che la frazione libera di furoilglicina è stata calcolata in un solo soggetto perché i picchi nei campioni di plasma di altri soggetti erano troppo piccoli per essere quantificati.

Le misurazioni mediante cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS) con standard etichettati isotopicamente hanno confermato la scoperta di tassi di clearance molto elevati per i soluti legati ippurato, indossil solfato e p-cresolo solfato. I valori di clearance per questi soluti insieme a urea e creatinina sono riassunti nella Tabella 2.

Per confronto, i valori di clearance sono stati misurati anche per la fenilacetilglutamina che studi precedenti avevano dimostrato essere secreta dai tubuli renali ma in gran parte non legata.9 Come previsto, la clearance dell'urea era inferiore alla clearance della creatinina, riflettendo il riassorbimento tubulare dopo la filtrazione glomerulare. La clearance della fenilacetilglutamina, al contrario, era in media di 455 ± 62 ml/min per 1,73 m2 o circa tre quarti del flusso plasmatico renale stimato. I valori di clearance per ippurato, indossil solfato e p-cresolo solfato erano molto più alti. I valori ottenuti mediante analisi quantitativa con standard etichettati erano leggermente inferiori a quelli stimati dalle aree di picco valutate mediante spettrometria di massa non mirata, ma ancora ben al di sopra del flusso plasmatico renale stimato. I valori di clearance per questi soluti espressi in termini di concentrazione plasmatica totale erano molto inferiori a quelli espressi in termini di concentrazione libera e non superavano il flusso plasmatico renale.

Tabella 2. Valori di clearance ottenuti utilizzando il dosaggio LC/MS/MS

Abbreviazione:

LC/MS/MS, cromatografia liquida/spettrometria di massa tandem.

I valori sono media±sd Clearance/clearancecre è il rapporto medio tra clearance dei soluti e clearance della creatinina. La frazione libera è il livello nell'ultrafiltrato plasmatico come percentuale del livello plasmatico totale. Clearancetotal è il valore che si otterrebbe se la clearance fosse calcolata utilizzando la concentrazione plasmatica totale anziché la concentrazione plasmatica libera.

Ulteriori studi hanno esaminato l'accumulo in pazienti con insufficienza renale di soluti trovati essere eliminati in modo efficiente dal rene nativo. Come riassunto nella Tabella 1, i livelli liberi di tutti i 13 soluti identificati chimicamente con alti tassi di clearance renale nativa erano elevati nei pazienti in emodialisi. Da notare che, per tutti tranne due di questi soluti, le concentrazioni libere medie nei campioni di pretrattamento dei pazienti in emodialisi erano più di 20- volte normali e le concentrazioni di soluto libero aumentavano più delle concentrazioni totali di soluto. La grande maggioranza dei soluti caratterizzati solo da valori di massa esatti che hanno elevate clearance renali native è stata trovata accumulata anche nei pazienti in emodialisi, come ulteriormente riassunto nella Tabella Supplementare S2 online.

DISCUSSIONE

Studi metabolomici hanno scoperto che l'urina contiene centinaia di soluti, la maggior parte dei quali deve ancora essere identificata chimicamente. poiché i soluti uremici possono contribuire alla malattia quando la funzione renale è ridotta. Al momento, tuttavia, abbiamo poche conoscenze su quali di questi soluti siano clinicamente importanti.3,13.

Questo studio è stato progettato per identificare i soluti per i quali i tassi di clearance renale sono normalmente molto elevati. Per qualsiasi tasso di produzione di soluto, un'elevata clearance serve a mantenere basso il livello di soluto nel corpo. Potremmo quindi aspettarci di trovare composti di rifiuti tossici tra quei soluti con alti tassi di clearance. L'analisi di campioni di ultrafiltrato di urina e plasma a tempo mediante spettrometria di massa non mirata ha rivelato la presenza di 90 caratteristiche ritenute probabilmente corrispondenti a soluti con velocità di clearance renale superiori al flusso plasmatico renale.

Da notare che i composti con valori di massa corrispondenti per molte di queste caratteristiche non sono stati trovati negli elenchi standard dei metaboliti umani.7,8 Ciò suggerisce che molte sostanze per le quali l'evoluzione ha fornito alti tassi di clearance devono ancora essere identificate. I composti che siamo stati in grado di identificare includevano indossil solfato e p-cresolo solfato. Questi composti derivano dall'azione dei batteri intestinali e sono noti per essere secreti dai tubuli renali. Si accumulano nel plasma quando i reni falliscono e recentemente hanno ricevuto un'ampia considerazione come tossine uremiche.

Tutte queste sostanze sono state precedentemente trovate nell'urina umana e anche ippurato, acido adipico e cinnamoil glicina si accumulano nel plasma di pazienti con insufficienza renale (http://www.hmdb.ca).5., 13. , 18. Come l'indossilsolfato e il p-cresolo solfato, l'ippurato e l'3-idrossiippurato vengono secreti dai tubuli renali.9,19 Ma per quanto possiamo scoprire, la possibilità di una clearance renale superiore al flusso plasmatico renale non è stato considerato per nessuno di questi soluti.

Come descritto qui, il rene può raggiungere velocità di clearance rispetto al flusso plasmatico renale attraverso una combinazione di secrezione tubulare e legame del soluto rapidamente reversibile alle proteine ​​plasmatiche. Per i soluti che sono confinati nel plasma e non legati alle proteine, la clearance massima è pari al flusso plasmatico renale. Ma per i soluti legati, la secrezione attiva abbassa la concentrazione di soluto plasmatico libero nel sangue che passa attraverso i capillari peritubulari dopo aver lasciato i glomeruli in modo che la porzione legata del soluto tenda a dissociarsi dalle proteine ​​leganti e diventi disponibile per la secrezione.

Se l'avidità del trasporto secretorio nel lume tubulare è sufficiente, la quantità di soluto secreto è maggiore del flusso plasmatico renale moltiplicato per la concentrazione libera nel plasma che entra nei capillari peritubulari e la clearance aumenterà al di sopra della velocità del flusso plasmatico. L'effetto netto è quello di ridurre la concentrazione di soluto non legato nella circolazione sistemica a un livello inferiore rispetto a quello che si otterrebbe se il soluto fosse completamente rimosso dal plasma che passa attraverso i reni ma non fosse legato alle proteine.

Poiché è la concentrazione libera e non legata di soluti a cui sono esposti i tessuti in tutto il corpo, la combinazione di legame proteico e secrezione tubulare può fornire un vantaggio adattativo nella rimozione dei composti tossici di scarto. In sostanza, l'aggiunta del legame proteico reversibile alla secrezione consente di ridurre il livello libero di un soluto senza aumentare il flusso sanguigno e le dimensioni del rene.

La capacità del rene di ridurre la concentrazione plasmatica libera di soluti legati a livelli molto bassi è stata riconosciuta da Marshall20 che ha fornito la prima dimostrazione inequivocabile della secrezione di soluto da parte dei tubuli renali. Marshall non ha misurato alcun soluto naturale, ma ha ipotizzato la loro potenziale elevata clearance sulla base dell'osservazione della manipolazione renale del rosso fenolo, un colorante legato alle proteine.

Da allora, tuttavia, il potenziale vantaggio del legame proteico è stato ampiamente ignorato nella medicina renale e i valori di clearance per i soluti di scarto legati e non legati sono stati espressi in termini di concentrazione plasmatica totale piuttosto che più rilevante. La pratica standard è stata diversa, tuttavia, nella letteratura farmacologica.21 Con gli agenti farmaceutici come con altri composti, solo la porzione libera di un soluto legato è biologicamente attiva, e i tassi di clearance per i prodotti farmaceutici sono stati quindi abitualmente espressi in termini di loro plasma libero concentrazioni. Il calcolo in termini di concentrazione totale produce valori inferiori e sottostima la capacità del corpo di limitare il livello di soluto libero effettivo, come rivelato nella Tabella 2 e nella Tabella supplementare S2 online.

Una domanda ovvia per la medicina renale è se la secrezione può persistere quando la filtrazione glomerulare diminuisce. La speranza basata su osservazioni morfologiche precoci che un numero significativo di "tubuli glomerulari" continuasse ad operare in pazienti con malattia glomerulare è stata ampiamente delusa dalle analisi successive.22,23 Ancora più importante, gli studi funzionali hanno ripetutamente dimostrato che le clearance secretorie diminuiscono con la GFR. L'evidenza è più ampia per la clearance del para-amminoippurato, a lungo utilizzato come misura del flusso plasmatico renale.

In media, la clearance del para-amminoippurato diminuisce solo leggermente meno del GFR, con variazioni tra i singoli pazienti e le malattie specifiche.24,25 Un declino della clearance secretoria con GFR è stato dimostrato anche per anioni organici endogeni come ippurato e { {3}}idrossiindolacetato e molti prodotti farmaceutici inclusi composti legati alle proteine ​​come la furosemide.26., 27., 28. Una riduzione simile nella clearance secretoria media dei soluti endogeni strettamente legati indossilsolfato e p-cresolo solfato in parallelo con GFR stimato è stato anche recentemente descritto in forma astratta.29 L'aumento delle concentrazioni plasmatiche con il progredire della malattia renale cronica non serve quindi a distinguere i composti che vengono eliminati mediante secrezione da quelli che vengono eliminati in gran parte mediante filtrazione. Domande più sottili, come la misura in cui i livelli di soluto secreto sono influenzati dalla competizione per le molecole di trasporto e le molecole di trasporto di espressione alterate durante la progressione della malattia renale, sono state studiate meno a fondo.

Un punto debole della spettrometria di massa non mirata è che non fornisce una quantificazione precisa. Gli effetti matrice alterano la forza dei segnali ionici da singoli campioni, in particolare da campioni di fluidi diversi. I valori di clearance nella Tabella 1, che si basano sulle aree dei picchi relativi nei cromatogrammi dell'ultrafiltrato di urina e plasma, devono quindi essere considerati solo approssimativi. Sono stati sviluppati saggi quantitativi LC/MS/MS più accurati per misurare le concentrazioni di soluti selezionati per i quali siamo stati in grado di ottenere standard sia senza etichetta che con etichetta isotopica.

Queste misurazioni hanno confermato che le clearance per ippurato, p-cresolo solfato e indossil solfato erano molto superiori al flusso plasmatico renale stimato. La loro clearance può essere messa a confronto con quella della fenilacetilglutamina, un soluto che viene secreto attivamente ma in gran parte non legato, cosicché la sua clearance può avvicinarsi solo al flusso plasmatico renale. È noto che indossil solfato, p-cresolo solfato, 3-idrossiippurato, acido 1,3,7-trimetil urico e acido 1,7-dimetil urico vengono manipolati dal trasportatore di anioni organici 1 e/o 3 nel tubulo prossimale renale, e le strutture degli altri soluti che abbiamo identificato come efficientemente eliminate per renderle probabili candidati per il trasporto mediante gli stessi meccanismi.30., 31., 32., 33., 34. L'identificazione di quali trasportatori gestiscono quali soluti, tuttavia, richiederà studi su cellule in coltura o animali in cui l'attività del trasportatore è stata manipolata geneticamente.

La conferma che i singoli soluti vengono eliminati dal rene è fornita dal riscontro di livelli elevati nei pazienti con insufficienza renale. Tra i composti che abbiamo identificato come aventi clearance renale nativa maggiore del flusso plasmatico renale, le concentrazioni plasmatiche totali di ippurato, p-cresolo solfato, indossilsolfato, acido adipico e cinnamoil glicina sono state precedentemente riportate essere elevate nei pazienti con insufficienza renale .5., 13., 18. Questo studio mostra inoltre che i livelli liberi di soluti legati che vengono eliminati in modo efficiente dal rene nativo possono salire a livelli elevati nei pazienti mantenuti in emodialisi che fornisce la clearance per diffusione passiva.

Tra i 13 composti che abbiamo identificato come aventi elevate clearance renali native, i livelli liberi per tutti tranne due erano più di 20-volte normali nei pazienti in emodialisi. Le eccezioni, l'acido 1,3,7-trimetil urico e l'acido 1,7-dimetil urico sono metaboliti della caffeina.35 Tutti i nostri soggetti normali bevevano caffè o tè, mentre l'assunzione tra i pazienti in emodialisi era limitato a una singola tazza di tè al giorno in un individuo. Oltre alle differenze nella produzione, la clearance non renale e il volume di distribuzione dei singoli soluti possono influenzare il grado in cui i loro livelli sono elevati nei pazienti in dialisi.

Occorre riconoscere diverse limitazioni. In primo luogo, il nostro elenco di caratteristiche corrispondenti ai soluti con elevati tassi di clearance renale è senza dubbio incompleto. Studi precedenti hanno dimostrato che il numero di caratteristiche identificate dalla spettrometria di massa aumenta quando i campioni vengono analizzati utilizzando più metodi cromatografici e di ionizzazione.11., 12., 36., 37. In secondo luogo, l'approccio attuale non riuscirebbe a identificare i composti che vengono rimossi in modo efficiente dal plasma ma sono stati poi degradati nel rene o alterati prima dell'escrezione nelle urine. Infine, potremmo aver calcolato valori di clearance falsamente elevati per le sostanze che vengono escrete nelle urine in seguito alla produzione nel rene.

In sintesi, questo studio mostra che la combinazione del legame proteico con la secrezione tubulare consente al rene di eliminare i soluti di scarto a velocità superiori al flusso plasmatico renale. E suggerisce che tassi di clearance così elevati vengono raggiunti per un gran numero di soluti naturali, molti dei quali devono ancora essere identificati chimicamente. Un'ulteriore analisi del gruppo di soluti eliminati in modo efficiente dal rene potrebbe fornire una via per l'identificazione di queste tossine uremiche.

MATERIALI E METODI

I campioni di sangue sono stati ottenuti a metà delle raccolte di urina a tempo dopo il digiuno notturno in cinque soggetti con una normale funzionalità renale le cui caratteristiche sono riportate nella Tabella supplementare S1 online. Gli studi sono stati eseguiti dalla Dichiarazione dei Principi di Helsinki. Il plasma è stato deproteinizzato con metanolo (1:3 vol: vol), essiccato e ricostituito in 90:10 vol: vol acqua/acetonitrile a metà della concentrazione originale. L'ultrafiltrato è stato ottenuto utilizzando i separatori Omega Nanosep 30K (Pall, Ann Arbor, MI), essiccato e ricostituito in 90:10 acqua/acetonitrile a cinque volte la concentrazione originale. L'urina è stata diluita con acqua per fornire le concentrazioni di soluto che si sarebbero trovate in un flusso di urina di 100 ml/min, essiccata e ricostituita in 90:10 acqua/acetonitrile al doppio della concentrazione del campione diluito.

Tabella supplementare 1.

La cromatografia è stata eseguita su un sistema ACQUITY UPLC (Waters, Milford, MA). Di ogni campione, 10 ul è stato caricato su una colonna Kinetex XB-C18 150 × 2,1 mm, dimensione delle particelle di 1,7 μm (Phenomenex, Torrance, CA) mantenuta a 4{{1{{12} }}} grado . Il flusso della fase mobile era di 0,4 ml/min utilizzando acido formico allo 0,1% in acqua (A) e acido formico allo 0,1% in acetonitrile (B) con un gradiente dal 3% B al 25% B in 9 min, dal 25% B al 100% B a 15 min, rimanendo al 100 percento B a 19 min e ritornando al 3 percento B a 21 min. La MS è stata eseguita su uno spettrometro di massa Exactive orbitrap (Thermo Fisher, San Jose, CA) con dati raccolti nell'intervallo da m/z 70 a 800 a 50,000 larghezze complete a metà della risoluzione massima utilizzando la ionizzazione elettrospray (ESI ) con una sonda riscaldata (400 gradi). La MS è stata calibrata in modalità positiva utilizzando una soluzione di calibrazione di ioni positivi ESI standard LTQ (quadrupolo a trappola lineare) (Pierce, Rockford, IL) nell'intervallo di massa m/z 138-1922. La calibrazione degli ioni negativi è stata estesa fino a m/z 97 dall'intervallo di massa m/z 265–1980 di una soluzione standard di calibrazione degli ioni negativi LTQ ESI aggiungendovi p-cresolo solfato e indossil solfato a 3,3 ug/ml, che ha generato ulteriori ioni di calibrazione di m/z 96,9601 (frammento di solfato), m/z 187,0070 (p-cresolo solfato) e m/z 212,0023 (indossilsolfato).

La modifica della miscela di calibrazione aveva lo scopo di consentire precisioni inferiori a 1 ppm nell'intervallo di massa della maggior parte dei soluti escreti nelle urine e quindi diminuire il numero di possibili composizioni elementari. Per ridurre al minimo gli effetti della deriva dello strumento, i campioni di ciascun soggetto sono stati analizzati insieme in triplicato e i campioni di tutti i soggetti sono stati analizzati prima in modalità negativa e poi in modalità positiva.

Il software MZmine v2.2 (Okinawa Institute of Science and Technology, Okinawa, Giappone) è stato utilizzato per identificare le caratteristiche caratterizzate da tempo di ritenzione e m/z da ciascuna corsa LC/MS e per assegnare ampiezze a queste caratteristiche in base all'integrazione dello ione valori correnti.38 ​​Poiché il nostro obiettivo era identificare i soluti eliminati dal rene, l'analisi è stata ulteriormente ristretta alle caratteristiche di 754 ioni negativi e 1054 ioni positivi con un'area di picco media maggiore di 4000 nelle prove in triplo nell'ultrafiltrato plasmatico di almeno tre di cinque soggetti e anche nelle urine di almeno tre soggetti su cinque. I tassi di clearance per queste caratteristiche del 1808 sono stati stimati confrontando le concentrazioni nell'ultrafiltrato plasmatico e urinario con quelle della creatinina.

Per 1082 delle 1808 caratteristiche, i tassi di clearance stimati erano superiori alla clearance della creatinina con un tasso di scoperta falsa di q<0.05. This was considered evidence of tubular secretion. Chromatograms for 163 of the 1082 secreted features with clearance values more than sevenfold the creatinine clearance were examined manually. The cutoff of sevenfold was chosen to be well above the renal plasma flow, which is approximately fourfold the creatinine clearance and to include the feature identified as p-cresol sulfate for which a deuterated standard was available, allowing its high renal clearance to be confirmed by a more quantitative assay (below). Elimination of duplicates when features appeared in both positive and negative mode and of features considered to represent dimers, adducts, isotopes, or artifacts on manual review reduced the total number of features with estimated clearance rates greater than sevenfold the creatinine clearance to 90 as summarized in Supplementary Table S2 online. Compounds with m/z values corresponding to these features were identified using the Human Metabolome and Metlin Databases (http://www.hmdb.ca and http://metlin.scripps.edu/) and chemical standards were obtained as further summarized in Supplementary Table S2 online. 

Per confermare le identità chimiche, campioni di urina e standard chimici selezionati sono stati analizzati utilizzando lo stesso metodo LC accoppiato a un LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher) per le caratteristiche che appaiono con modalità negativa e a una trappola ionica LTQ XL (Thermo Fisher) per le caratteristiche che appaiono con modalità positiva modalità. L'identificazione chimica è stata stabilita da una corrispondenza tra tempo di ritenzione, massa ionica principale e spettro MS/MS (tabella supplementare S3 online). Tra le 13 caratteristiche identificate chimicamente, l'ampiezza media dell'errore di massa assegnato ai picchi estratti da MZmine era 0.5±0.5 ppm, incoraggiando la fiducia che i valori di massa corretti fossero assegnati alle caratteristiche non identificate elencato nella tabella supplementare S2 online.

Tabella supplementare 3.

Anche il plasma pretrattamento di sei pazienti in emodialisi e di sei soggetti normali le cui caratteristiche sono riassunte nella Tabella supplementare S1 online è stato analizzato mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione come descritto sopra. Il plasma è stato deproteinizzato, essiccato e ricostituito in 90:10 vol: vol acqua/acetonitrile a un quarto della concentrazione originale per i pazienti in dialisi e alla concentrazione originale per i soggetti normali. L'ultrafiltrato è stato ricostituito in 90:10 acqua/acetonitrile alla concentrazione originale per i pazienti in dialisi e dieci volte la concentrazione originale per i soggetti normali. Le aree di picco per il plasma e l'ultrafiltrato ottenute con il software MZmine sono state mediate escludendo i valori di<4000 in duplicate runs of each sample. Peaks corresponding to solutes previously identified as having very high renal clearance values were identified by matching retention time and mass. Peaks corresponding to the 13 chemically identified features were reintegrated manually using Xcalibur Software (Thermo Fisher).

Le concentrazioni di p-cresolo solfato, indossilsolfato, ippurato e fenilacetilglutamina nei campioni normali sono state ulteriormente analizzate mediante diluizione isotopica stabile LC/MC/MS utilizzando p-cresolo-d8-solfato (sintetizzato da p-cresolo d8; 39 Cambridge Isotopes), indossil-2,4,5,6,7-d5-solfato (Isosciences), e N-benzoil-d5-glicina e N -( phenyl-d5-acetyl)-L-glutamine (entrambi da C/D/N Isotopes, Pointe-Claire, Quebec, Canada) come standard interni. La preparazione è stata la stessa, tranne per il fatto che i campioni essiccati sono stati ricostituiti in acqua al doppio della concentrazione utilizzata per l'analisi non mirata.

Di ciascun campione, 10 ul di è stato caricato su una colonna Kinetex C18 150 × 2,1 mm, dimensione delle particelle di 1,7 μm mantenuta a 30 gradi. Il flusso del tampone è stato impostato a 0,35 ml/min utilizzando 10 mmol/l di formiato di ammonio in acqua (A) e 10 mmol/l di formiato di ammonio in metanolo (B) con 5 percento B per 1 min, dal 5 percento B al 30 percento B a 6 min, rapidamente al 90 percento B a 8,5 min, e poi giù al 5 percento B a 13,5 min. La MS è stata eseguita su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Agilent 6430 con ESI in modalità negativa (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Le concentrazioni di soluto sono state calcolate utilizzando il software del produttore (MassHunter Quant, Agilent Technologies). Le transizioni ioniche utilizzate per la quantificazione erano m/z 187,0→107,0 per p-cresolo solfato, m/z 212,0→80,0 per indossilsolfato, m/z 178,1→134,2 per ippurato e m/z 263,2→145,1 per fenilacetilglutamina con transizioni corrispondenti per gli standard interni deuterati. I recuperi per p-cresolo solfato, indossilsolfato, ippurato e fenilacetilglutamina erano 100±4, 114±6, 93±3 e 105±3 percento per i reagenti aggiunti all'ultrafiltrato di plasma, 93±7, 108±25, 107±6 e 95±4% per i reagenti aggiunti al plasma e 91±17, 105±12, 95±15 e 102±14% per i reagenti aggiunti all'urina per raggiungere concentrazioni simili a quelle riscontrate nei soggetti sperimentali. La creatinina e l'urea sono state dosate nel laboratorio clinico.

Statistiche

I tassi di clearance per le 1808 caratteristiche rilevate nelle urine e nell'ultrafiltrato plasmatico sono stati confrontati con i tassi di clearance della creatinina in ciascun soggetto mediante il test dei ranghi con segno di Wilcoxon utilizzando SAS Enterprise Guide 4.3 e sono stati eseguiti confronti non appaiati tra i valori per pazienti in emodialisi e soggetti normali utilizzando il Mann –Whitney U-test utilizzando SPSS V20. I tassi di false scoperte sono stati quindi calcolati utilizzando Q-VALUE.

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo il Dr. Andres Martinez della California Polytechnic State University, San Luis Obispo, CA, USA, per la sintesi del solfato di p-cresolo deuterato, lo staff del Laboratorio di spettrometria di massa della Vincent Coates Foundation presso la Stanford University per l'assistenza con le analisi, e Dr. Jenny Shen della Stanford University per aiuto con le statistiche. TLS è stato supportato dalla Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation NKF Fellowship for the Study of Uremia. Un altro supporto è stato fornito dal NIH (R21DK84439 e RO1 DK80123 a TWM e RO1 DK80123 a THH).

MATERIALE SUPPLEMENTARE

Tabella S1. Caratteristiche dei soggetti normali e dei pazienti in emodialisi.

Tabella S2. Le caratteristiche della spettrometria di massa rappresentano potenzialmente i soluti eliminati in modo efficiente dal rene e il loro accumulo nei pazienti in emodialisi.

Tabella S3. Spettrometria di massa tandem (MS/MS) di caratteristiche identificate chimicamente come soluti eliminati in modo efficiente dal rene.

RIFERIMENTI

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