Superare la deficienza immunitaria con l'allorooming

Riepilogo semplice:

Abbiamo studiato se due specie di termiti strettamente imparentate differiscono nella loro dipendenza dall’immunità sociale o individuale contro due specie di funghi patogeni, che sono stati tutti raccolti dalla stessa posizione. I nostri risultati indicano che il grooming reciproco (allorooming) è altamente efficace nel limitare le infezioni mortali nella misura in cui può compensare le difese immunitarie individuali relativamente deboli. Dopo aver incontrato gli agenti patogeni, le termiti utilizzano una strategia alternativa per il distanziamento sociale e la limitazione della diffusione di malattie contagiose e si uniscono invece per pulirsi a vicenda. La variazione nell’intensità di questa risposta comportamentale indica una risposta sfumata al livello di minaccia.

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Astratto:

L’allogrooming sembra essere essenziale in molti animali sociali per proteggersi dall’esposizione di routine ai parassiti. Negli insetti sociali sembra essere fondamentale per la rimozione dei propaguli patogeni dalla cuticola prima che possano iniziare un ciclo infettivo. Per le termiti sotterranee, questo include spore fungine comunemente incontrate nel terreno, come Metarhizium conidia, che possono germinare rapidamente e penetrare nella cuticola. Abbiamo studiato se esiste una differenza nella dipendenza dall'immunità sociale e innata in due termiti sotterranee strettamente correlate per la protezione dalle infezioni mortali da parte di due specie di Metarhizium incontrate localmente. I nostri risultati indicano che l’immunità innata relativamente debole in una specie di termiti è compensata da un allogrooming più prolungato. Ciò include un migliore allogrooming in risposta alle concentrazioni di conidi che riflettono una contaminazione più ordinaria della cuticola, nonché a una forte contaminazione cuticolare che suscita una risposta di emergenza in rete.

Parole chiave:

immunità sociale; immunità innata; entomopatogeni; comportamento dell'allarme; capolinea

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1. Introduzione

I meccanismi sociali di difesa possono essere molto efficaci nel contrastare la suscettibilità alle malattie contagiose nonostante la socialità ne favorisca la diffusione [1,2]. Nelle termiti e nelle formiche, l’evoluzione di meccanismi sociali efficaci di difesa immunitaria sembra aver allentato la pressione selettiva sui meccanismi immunitari innati individuali [3–6]. Dopo l’incontro con gli agenti patogeni, la minaccia di malattia negli insetti sociali dipenderà dall’efficacia delle difese innate di prima linea, che includono barriere fisiche alle infezioni. Molti agenti patogeni fungini producono spore asessuali (conidi) che possono penetrare direttamente nella cuticola dell'insetto. Le difese immunitarie sociali che aiutano a proteggere la cuticola, compresi l'allogrooming e gli antifungini secreti, sembrano essere particolarmente importanti nelle termiti per la difesa contro Metarhizium spp [7–9]. I conidi del metarhizium sono onnipresenti nel terreno attraverso il quale molte termiti si muovono mentre cercano cibo e raggiungono concentrazioni che sostengono una costante minaccia di infezione [10]. Le termiti foraggiatrici, come le specie del genere Reticulitermes, si muovono attraverso il suolo per espandere l'areale delle loro colonie e accedere a molteplici siti di alimentazione, che di solito sono risorse di legno appoggiate sulla superficie del suolo [11]. Le reti sotterranee delle loro colonie possono estendersi per decine di metri, contenere oltre centomila individui e raggiungere densità di oltre un centinaio di colonie per ettaro [12]. Si sono evoluti da un antenato con colonie limitate a un singolo pezzo di legno [13,14]. Questa transizione avrebbe comportato un aumento degli incontri con predatori, agenti patogeni e concorrenti e avrebbe coinciso con l’evoluzione di una vera casta operaia dedicata che di solito rinuncia alla riproduzione diretta. È probabile che il miglioramento dell’igiene sia stato fondamentale per questa transizione e per le successive radiazioni e l’attuale successo ecologico delle termiti, il cui contributo alla decomposizione del legno può superare la decomposizione microbica [15,16] e che sembrano destinate a espandersi rapidamente a livello globale con l’aumento delle temperature [17] . Durante la transizione al foraggiamento, un allentamento della pressione selettiva sui geni del sistema immunitario innato ha coinciso con la sua intensificazione su due geni che producono proteine antifungine secrete [6]. Queste proteine sembrano essere essenziali per la rimozione dei conidi fungini mediante allogrooming. La contrastante pressione selettiva sui componenti dei meccanismi di difesa innati e sociali individuali in passato suggerisce che continua ad esserci un compromesso adattivo nella dipendenza delle termiti dall’immunità individuale innata e sociale per la protezione dalle malattie fungine. Ciò è supportato dall’osservazione che l’espressione del gene del sistema immunitario innato è inferiore nei gruppi rispetto agli individui di lavoratori di Reticulitermes che sono stati esposti a Metarhizium conidia [18]. L'allorooming riduce la necessità di attivare il sistema immunitario interno. In questo studio, abbiamo studiato le differenze nell’immunità sociale e innata in due specie di termiti sotterranee rispetto a due specie locali di Metarhizium che si incontrano naturalmente. Le specie Metarhizium sono state isolate dal terreno sottostante o accanto ai tronchi in cui venivano raccolte le termiti. Le due specie di termiti, Reticulitermes virginicus e Reticulitermes flavipes, sono state raccolte nella stessa località nel Maryland. Sebbene sembrino agonisti, si trovano spesso a foraggiarsi uno accanto all'altro o anche occasionalmente nello stesso tronco. L'aggressività interspecifica tra i lavoratori spesso provoca ferite mortali nei test di agonismo su piastre Petri [19]. L'attività antifungina dei lavaggi cuticolari dei lavoratori di R. virginicus ha precedentemente dimostrato di essere più efficace nell'inattivare i conidi di Metarhizium rispetto ai lavaggi dei lavoratori di R. flavipes [20]. Ciò suggerisce che, sebbene queste due termiti siano strettamente correlate e incontrino gli stessi agenti patogeni, possono differire nella loro dipendenza dall’immunità innata o sociale individuale. Abbiamo utilizzato un approccio comparativo per indagare se esiste una differenza tra la dipendenza e l’integrazione dell’immunità sociale e innata e se esiste un potenziale compromesso tra i due. Una maggiore immunità sociale può essere associata a meccanismi immunitari innati meno efficaci, che possono includere la potenza degli antifungini secreti, e viceversa. Un’immunità individuale più debole può essere compensata da un’immunità sociale più efficace. È stata studiata la sopravvivenza dei lavoratori delle termiti allo stadio avanzato in gruppi di dodici, coppie o individui singoli dopo che erano stati attaccati con funghi provenienti da Metarhizium robertsii o Metarhizium brunneum. Gruppi di 12 lavoratori sono stati brevemente esposti ad una dose elevata del fungo. Questa concentrazione potenzialmente fatale provoca risposte comportamentali simili a quelle osservate quando le termiti incontrano un cadavere sporulante, in alcuni casi suscitando un aumento sostanziale della risposta di allarme che si traduce in rapidi movimenti oscillatori longitudinali, LOM [21–23]. La frequenza dei LOM nei primi 12 minuti dopo che le termiti sono state esposte ai conidi di diversi ceppi e specie di Metarhizium è positivamente correlata con la frequenza degli attacchi di allogrooming. I LOM, che sono più facili da misurare rispetto all’allorooming, possono quindi essere utilizzati come misura indiretta dei livelli di allorooming. Il rilevamento del fungo sembra essere ritardato fino a quando le superfici delle termiti non sono contaminate dai conidi, il che suggerisce che i recettori di riconoscimento associati all'apparato boccale sono fondamentali per l'insorgenza di un elevato allarme e di allogrooming. Coppie e individui singoli sono stati esposti a una bassa dose del fungo che è più probabile che rifletta i livelli di esposizione che le termiti incontrano quando costruiscono gallerie attraverso il terreno, in contrasto con gli incontri diretti con cadaveri sporulanti. A differenza delle singole termiti, le coppie di termiti sono quasi completamente resistenti alle infezioni fatali a questa dose per 10 giorni. Per separare l’immunità sociale da quella innata a questa bassa dose, coppie di termiti sono state separate in momenti diversi subito dopo le sfide con i conidi fungini, e la sopravvivenza di queste coppie è stata confrontata con quella dei singoli che non avevano opportunità di interazioni sociali dopo le sfide fungine. L'allogrooming e i LOM sono stati osservati prima dei punti temporali di separazione delle coppie di termiti. Inoltre, è stata testata l’attività antifungina di estratti grezzi di termiti intere per valutare ulteriormente le differenze nell’immunità innata tra le due specie di termiti in risposta alle due specie di funghi.

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2. Metodi

2.1. Studiare gli organismi

Le termiti R. flavipes e R. virginicus e i funghi M. brunneum e M. Roberts sono stati raccolti da foreste decidue a crescita secondaria nella contea di Baltimora (Pleasant Hills e Monkton), nel Maryland. Le specie di termiti sono state identificate utilizzando test di agonismo intra e interspecifico [19] e sequenze di rRNA mitocondriali [4]. Le specie Metarhizium sono state isolate da campioni di terreno vicino ai siti di raccolta delle termiti (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) e il legno con cui si nutrivano venivano raccolti e conservati in contenitori di plastica in condizioni di buio e umidità a 25 ◦C. Le termiti appartenenti alla stessa specie sono state raccolte da siti separati da almeno 60 m, che di solito è sufficiente per garantire che le raccolte provengano da colonie diverse [12]. Queste raccolte separate vengono denominate colonie di seguito. Le termiti sono state raccolte nell'estate del 2018 e 2019 per gli esperimenti con i gruppi di 12 nonché per gli esperimenti in vitro con estratti grezzi di termiti, e nel 2021 e 2022 per gli esperimenti con coppie e singoli esemplari. Le termiti sono state utilizzate nei rispettivi esperimenti entro 4 mesi dalla raccolta. I lavoratori sono stati rimossi delicatamente dai pezzi di legno e mantenuti in gruppi di piastre Petri di 12 55 mm di diametro rivestite con carta da filtro inumidita (Whatman 1) per 24 ore alla luce ambientale prima di essere utilizzati per i nostri esperimenti. Ciò ha permesso loro di acclimatarsi alla luce e di pulire le superfici cuticolari dai detriti particolati prima dell'esposizione ai funghi. Non abbiamo incluso i soldati perché non puliscono i compagni di nido, rappresentano l’1-2% della colonia e non si trovano costantemente nei gruppi di foraggiamento.

2.2. Sopravvivenza e risposta all'allarme per gruppi di dodici

Gruppi di 12 lavoratori di R. flavipes o R. virginicus sono stati esposti a una dose elevata di 10 6 conidi mL−1 di 0.05% Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, USA) o Tween 80 allo 0,05% per i controlli. Tween 80 è stato incluso per aiutare a rompere i grumi di conidi durante la preparazione delle sospensioni. Il giorno prima di questi trattamenti, tutte e 12 le termiti sono state contrassegnate con un piccolo punto di smalto colorato sulla parte dorsale dell'addome in modo che potessero essere identificate individualmente. L'allogrooming ha rimosso la vernice da alcuni individui, ma questi individui potevano ancora essere identificati individualmente al momento della morte esaminando i sopravvissuti e attraverso la variazione individuale naturale dei lavoratori, come il grado di colorazione scura nell'addome. Le termiti utilizzate per ciascuna replica di 12 termiti e controlli infestati provenivano da colonie diverse. Sono state utilizzate cinque colonie sia per R. flavipes che per R. virginicus (n=480 lavoratori). Gli esperimenti con le colonie di M. Roberts sono stati ripetuti dopo tre mesi per verificare la coerenza della sopravvivenza. In totale, c'erano 60 repliche di 12 o 11 termiti (n=709). In 11 repliche una termite è morta prima dell'esposizione ai funghi, cosa che sembrava essere dovuta alla manipolazione durante la marcatura con la vernice. Le termiti sono state esposte ai conidi preparati da una coltura clonale di M. Roberts o M. brunneum. I lavoratori sono stati aggiunti a provette da 1,5 ml contenenti 500 µl delle diluizioni di conidi, o Tween 80 allo 0,05% per i controlli, con un piccolo imbuto di plastica e agitati delicatamente per 10 secondi per garantire l'immersione completa. I lavoratori sono stati quindi depositati su carta da filtro per assorbire il fluido in eccesso, trasferiti su piastre Petri da 55 mm di diametro rivestite con carta da filtro inumidita (Whatman 1) e video registrato per 12 minuti. La mortalità è stata monitorata quotidianamente per due settimane. Gli individui morti sono stati rimossi, sterilizzati in superficie con etanolo al 70% e posti su carta da filtro umida in piastre Petri (55 mm) mantenute a 24 ◦C e umidità al 100% per la conferma dell'infezione da Metarhizium (crescita di muscardina verde dopo 3-4 giorni). Per ciascuna termite è stato assegnato un punteggio al numero totale di LOM osservati nei video nell'arco di 12 minuti. I LOM duravano tra 2 e 7 secondi e dovevano essere interrotti e poi ripresi per essere conteggiati come eventi separati [23].

2.3. Sopravvivenza e allogroming per coppie e single

La sopravvivenza delle coppie di termiti è stata confrontata con quella dei singoli esemplari dopo l'esposizione a una dose bassa (104 conidi mL−1) di conidi che non ha causato una mortalità eccessiva e probabilmente riflette le concentrazioni che le termiti incontrano quando si muovono nel suolo [10] . Coppie e singoli individui sono stati confrontati per misurare la sopravvivenza offerta dai meccanismi sociali di difesa. Gruppi di 12 lavoratori sono stati inizialmente sottoposti a test con o senza funghi come descritto sopra, tranne che le sospensioni di conidi di circa 107 conidi mL−1 sono state preparate in Tween 80 allo 0,1% e vortexate vigorosamente prima delle diluizioni con acqua sterile a 104 conidi mL−1. Tween 80 non è stato incluso nelle diluizioni perché le sospensioni dei singoli conidi potevano essere mantenute a basse concentrazioni e perché il tensioattivo può interferire con l'adesione dei conidi alla cuticola. Questi individui non avevano segni di vernice. Immediatamente dopo i trattamenti e prima che le termiti avessero l'opportunità di interagire, sono state divise in coppie o singoli nei pozzetti di piastre di coltura cellulare in plastica 24-well (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Ciascun pozzetto è stato rivestito con carta da filtro inumidita (Whatman 1). Per ciascuna combinazione termite/fungo (n=4), quattro coppie di termiti sono state separate in singole dopo 15 minuti, 2 ore, 5,5 ore, 8 ore e 27 ore (n=160) e per ciascuna Combinazione termite/fungo 12 termiti che non hanno mai avuto l'opportunità di interagire sono state separate in singole termiti trattate con funghi o di controllo (n=96). Queste singole termiti furono anche divise in 24-piastre a pozzetti rivestite con carta da filtro. La mortalità delle termiti è stata successivamente monitorata per dieci giorni e gli individui morti sono stati rimossi per la conferma dell'infezione da Metarhizium. È stata utilizzata un'unica colonia sia per R. flavipes trattato con M. robertsii o M. brunneum che per R. virginicus trattato con M. robertsii o M. brunneum (n=256). Sei coppie non trattate sono state mantenute anche in piastre a pozzetti 24- per 10 giorni per ciascuna specie. Un esperimento separato con le stesse colonie si è concentrato sulla registrazione dell'allorooming prima dei tempi di separazione delle coppie a 15 minuti, 2 ore, 5,5 ore, 8 ore e 27 ore. Sei diverse coppie di ciascuna specie di termiti sono state trattate con ciascun fungo o acqua per i controlli e valutate per l'allorooming per 15 minuti prima dei punti temporali di separazione (n=180). Gli eventi di allogrooming sono stati valutati quando il contatto bocca a corpo tra due termiti comportava il movimento dell'apparato boccale (palpi) ed è stata registrata la durata di ciascun evento di allogrooming ininterrotto. L'allogrooming è stato valutato da un singolo osservatore cieco rispetto al trattamento ricevuto dalle termiti. Anche i LOM sono stati valutati, ma erano trascurabili e non utilizzati nell'analisi. Non è stata osservata l'auto-cura.

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2.4. Attività antifungina in vitro

Dodici lavoratori provenienti da 5 colonie di R. flavipes o R. virginicus sono stati immobilizzati a freddo in provette Eppendorf da 1,5 mL e a ciascuna provetta sono stati aggiunti 120 µL di acqua fredda e sterile. Le operaie di entrambe le specie utilizzate in questo studio avevano all'incirca la stessa taglia (lunghezza 4-5 mm). Le termiti sono state omogeneizzate con un pestello di plastica e l'estratto è stato centrifugato a 16,000 g per 2 minuti. Il surnatante è stato sterilizzato con filtro con filtri Ultrafree da 0,22 µm (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Dieci µ l del filtrato sono stati incubati per 24 ore con dieci µ l contenenti 100 conidi di M. robertsii o M. brunneum e 20 µ l di 100 µ g mL−1 di ampicillina per evitare ulteriormente la contaminazione batterica. I controlli includevano 10 µl di acqua sterile al posto dell'estratto grezzo. Due repliche per ciascuna miscela incubata sono state distribuite su agar di destrosio di patate (PDA) integrato con 50 µg mL−1 di ampicillina (piastre Petri da 60 mm) e incubate a temperatura ambiente al buio per 4–5 giorni. L’attività antifungina è stata misurata confrontando le unità formanti colonie (CFU) nei trattamenti con estratti grezzi con i controlli.

2.5. Statistiche

Le stime di Kaplan-Meier dei tempi medi di sopravvivenza sono state utilizzate per confronti a coppie della sopravvivenza. I rapporti di rischio di morte (HR) sono stati calcolati con l'analisi di regressione di Cox. Abbiamo utilizzato la regressione di Cox per studiare le differenze nella mortalità tra individui che esibiscono LOM o non esibiscono LOM controllando altre variabili categoriali (trattamento o controllo fungino, specie di funghi, specie di termiti, colonia di origine). I LOM sono stati classificati come assenti o presenti negli individui a causa della frequenza di valori anomali e della mancanza di normalità. Nell'analisi di sopravvivenza con coppie di termiti e esemplari singoli, l'HR si basava su un confronto tra coppie trattate con conidi (separate in momenti diversi) e esemplari singoli trattati con conidi. Questi HR, quindi, forniscono una misura della sopravvivenza offerta dai meccanismi sociali di difesa controllando i meccanismi di difesa individuali. L'associazione tra il tempo trascorso in coppia e la variazione della frequenza cardiaca è stata misurata con le correlazioni di Pearson. La distribuzione dei LOM tra i diversi trattamenti è stata confrontata con un test Kruskal-Wallis con correzioni Bonferroni per test multipli per confronti a coppie. La media delle CFU o la durata degli eventi di allogrooming è stata confrontata con un test ANOVA con correzioni di Bonferroni per confronti a coppie. Abbiamo utilizzato IBM SPSS Statistics (versione 28) per i test statistici.

3. Risultati

3.1. Sopravvivenza e allarme di gruppi di dodici persone sfidati

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>90% di conferme). Per le termiti infestate da M. Roberts, sono stati osservati 129 decessi tra 237 individui e il tempo medio di sopravvivenza per R. virginicus (9,10 giorni) è stato significativamente inferiore a quello per R. flavipes (10. 98 giorni)(Breslow=10.05, df=1, p=0.002) (Figura 1). Per le termiti infestate da M. brunneum, sono stati osservati 79 decessi su 120 individui e il tempo medio di sopravvivenza per R. flavipes (9,70 giorni) è stato inferiore a quello di R. virginicus (10,68 giorni) ma non in modo significativo (Breslow=2 .74, df=1, p=0.098). La distribuzione dei LOM (Figura 2) tra i trattamenti fungini e quelli di controllo era significativamente diversa (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p <0,001). La frequenza dei LOM non era significativamente diversa tra i trattamenti con M. brunneum e i rispettivi controlli per R. flavipes (p aggiustato=0.097) e R. virginicus (p aggiustato=1.000 ). Tuttavia, la frequenza dei LOM era significativamente maggiore per i trattamenti con M. Roberts rispetto ai rispettivi controlli per R. flavipes (p aggiustato <0,001) e R. virginicus (p aggiustato <0,001) (Figura 2). Per il trattamento con M. Roberts, la frequenza dei LOM di R. flavipes era significativamente maggiore rispetto ai LOM di R. virginicus (p aggiustato <0,001). Tuttavia, per il trattamento con M. brunneum, la frequenza dei LOM di R. flavipes non era significativamente diversa da quella dei LOM di R. virginicus (p aggiustato=1.000). A differenza di M. brunneum, gruppi di 12 termiti sfidati con i conidi di M. Roberts hanno prodotto una risposta comportamentale significativa.

3.2. Sopravvivenza di coppie e singoli sfidati

La sopravvivenza di coppie di termiti separate in tempi diversi subito dopo l'esposizione al patogeno è stata confrontata con la sopravvivenza di individui isolati con un rapporto di rischio di morte (HR). Un HR pari a 1 corrisponde a una sopravvivenza uguale nelle coppie separate e nei singoli nell'arco di dieci giorni. Valori inferiori a uno indicano che vi è una mortalità ridotta nelle coppie separate rispetto ai singoli. La correlazione tra il tempo trascorso in coppia e la riduzione della frequenza cardiaca era significativa solo per R. flavipes trattati con M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) o M. brunneum (r=−0.983, p=0.003), e non per R. virginicus trattato con nessuno dei due M. Roberts (r=−0,643, p=0 ,242) o M. brunneum (r=−0,812, p=0 ,095). Ciò si riflette anche nei valori R2 delle regressioni lineari mostrati nella Figura 3 (il tempo è stato trasformato in logaritmo per il calcolo delle correlazioni di Pearson e dei valori R2). Non è stata osservata alcuna morte nelle coppie non trattate (6 coppie per ciascuna specie di termiti) e una morte in 16 coppie trattate (4 coppie per ciascuna combinazione termite/fungo) che non erano mai state separate nell'arco di 10 giorni.

Figura 1. Sopravvivenza per gruppi di 12. Rf corrisponde a R. flavipes, Rv a R. virginicus, Mr a M. robertsii e Mb a M. brunneum. Differenze significative di sopravvivenza per i confronti a coppie erano basate sui test di Breslow (test di Wilcoxon generalizzati). * Differenza significativa tra i trattamenti, NS nessuna differenza significativa tra i trattamenti (p< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Attività antifungina degli estratti grezzi

Le due specie di funghi sono state analizzate separatamente (la vitalità dei conidi sul PDA differisce tra le due specie). Per M. robertsii, le unità formanti colonie (CFU) medie tra i trattamenti fungini e quelli di controllo erano significativamente diverse (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Figura 5a). Gli estratti grezzi di R. virginicus ma non quelli di R. flavipes hanno mostrato un'attività antifungina significativa contro M. robertsii rispetto al controllo (p aggiustato < 0.001 e p=1.{{ 10}}, rispettivamente). L'attività antifungina degli estratti di R. virginicus contro M. robertsii è stata significativamente maggiore dell'attività antifungina degli estratti di R. flavipes contro M. robertsii (p aggiustato < 0,001). Per M. brunneum, le CFU medie (Figura 5b) tra i trattamenti fungini e quelli di controllo erano significativamente diverse (F=27.26, df=2, p <0,001). Gli estratti grezzi di R. virginicus ma non di R. flavipes hanno mostrato una significativa attività antifungina contro M. brunneum rispetto al controllo (p aggiustato < 0,001 e p=0,072, rispettivamente). L'attività antifungina degli estratti di R. virginicus contro M. brunneum era significativamente maggiore dell'attività antifungina di R. flavipes contro M. brunneum (p aggiustato < 0,001).

Figura 2. Risposta all'allarme per la sfida fungina. I boxplot rappresentano la distribuzione dei LOM (LOM valutati in 709 individui marchiati con vernice). Le caselle corrispondono alla distanza tra i quartili superiore e inferiore dalla mediana (IQR). I baffi corrispondono a 1,5 × IQR. Cerchi e asterischi rappresentano valori anomali rispettivamente oltre 1,5 × IQR o 3 × IQR. Lettere diverse indicano differenze significative tra le distribuzioni dei trattamenti fungini e di controllo (aggiustato secondo Bonferroni). Rf corrisponde a R. flavipes, Rv a R. virginicus, Mr a M. robertsii e Mb a M. brunneum.

3.4. Allorooming tra coppie sfidate

La frequenza degli attacchi di allorooming è diminuita in modo significativo con le sfide fungine (media della sfida {{0}},55, media del controllo=8,80, t=−4,461, p < {{20}}.001). Tuttavia, la durata media dell'allorooming è aumentata in modo significativo con i test fungini (media del test=19,01 s, media del controllo=5,62 s, t=4,876, p < 0,001). La durata dei periodi di allogrooming per ciascuna interazione tra coppie di termiti differiva significativamente tra i trattamenti e i controlli (F=7.166, df=5, p < 0,001) (Figura 6). La durata dell'allorooming per evento è stata significativamente elevata nelle coppie di R. flavipes trattate con M. robertsii (p aggiustato < 0,001) o M. brunneum (p aggiustato=0,037) rispetto ai controlli ma non nelle coppie di R. virginicus trattate con M. robertsii (p aggiustato=1.000) o M. brunneum (p aggiustato=1.000) rispetto ai controlli.

Figura 3. La sopravvivenza di due termiti rispetto a una è stata confrontata con i rapporti di rischio di morte (n=80 coppie, 96 esemplari singoli). Rf corrisponde a R. flavipes, Rv a R. virginicus, Mr a M. robertsii e Mb a M. brunneum. Il tempo è stato trasformato in logaritmo per il calcolo dei valori R2.

Figura 4. Sopravvivenza di singole termiti dopo un attacco fungino (n=96). Rf corrisponde a R. flavipes, Rv a R. virginicus, Mr a M. robertsii e Mb a M. brunneum. Vedere il testo per i dettagli sulle differenze statistiche tra i trattamenti. Differenze significative di sopravvivenza per i confronti a coppie erano basate sui test di Breslow (test di Wilcoxon generalizzati). *Differenza significativa tra i trattamenti (p < 0,025 aggiustato Bonferroni).

Figura 5. Attività antifungina dell'estratto grezzo contro M. robertsii (a) e M. brunneum (b). I valori sopra le barre rappresentano le CFU medie (± DS) e lettere diverse indicano differenze significative (aggiustato secondo Bonferroni). Rf corrisponde a R. flavipes e Rv a R. virginicus. L'analisi ha utilizzato due replicati di 5 colonie di ciascuna specie di termiti, 6 replicati per il controllo Rf e 2 replicati per il controllo Rv.

Figura 6. Durata dell'allorooming per interazione (n=161 eventi di allogrorooming). I valori sopra le barre rappresentano la durata media delle interazioni di allorooming (± DS) e combinazioni distinte di lettere indicano differenze significative (aggiustato secondo Bonferroni). Rf corrisponde a R. flavipes, Rv a R. virginicus, Mr a M. robertsii e Mb a M. brunneum.

4. Discussione

R. flavipes fa affidamento su meccanismi sociali di difesa contro i patogeni fungini locali in misura maggiore rispetto a R. virginicus. Per i lavoratori di R. flavipes sfidati con entrambe le specie Metarhizium, c'era una forte correlazione negativa tra il tempo trascorso insieme da due termiti e la loro probabilità di morte rispetto alle singole termiti sfidate. Il rapporto di rischio di morte rispetto alle singole termiti infestate è stato dimezzato in circa due ore (Figura 3). Le prime interazioni sociali sembrano quindi essere fondamentali per la sopravvivenza quando i lavoratori di R. flavipes incontrano basse concentrazioni di conidi di Metarhizium. Al contrario, i lavoratori del R. virginicus hanno mostrato una debole correlazione tra il tempo trascorso insieme da due termiti e la loro probabilità di morte. Inoltre, a differenza di R. virginicus, le coppie di operaie di R. flavipes hanno aumentato significativamente la durata dei periodi di allorooming dopo un attacco fungino (Figura 6). È probabile che il rilevamento di conidi sulla cuticola di un compagno di nido abbia portato a questo aumento. Una rimozione più efficace dei conidi dalle superfici cuticolari aumentando la durata dei periodi di allorooming sembra spiegare la superiore immunità sociale di R. flavipes. I nostri risultati indicano anche che R. virginicus si basa su meccanismi di difesa innati individuali contro i patogeni fungini locali in misura maggiore rispetto a R. flavipes. La mortalità dei singoli lavoratori di R. flavipes esposti a una delle specie Metarhizium era significativamente più elevata della mortalità dei lavoratori di R. virginicus (Figura 4). L'attività antifungina dei lavaggi cuticolari di R. virginicus work contro i conidi di Metarhizium ha precedentemente dimostrato di essere significativamente più forte dell'attività dei lavoratori di R. flavipes [20]. Anche l'attività antifungina degli estratti grezzi di termiti intere era più forte in R. virginicus che in R. flavipes (Figura 5). Questi estratti includono composti di simbionti intestinali che, insieme ai composti antifungini delle termiti, possono anche contribuire all’eliminazione dei conidi ingeriti [26]. La variazione dei rapporti di rischio di morte e la loro debole correlazione con i tempi di separazione nei lavoratori di R. virginicus è coerente con una maggiore dipendenza dai meccanismi di difesa immunitaria innata che variano tra gli individui piuttosto che dai meccanismi immunitari sociali. R. flavipes ha mostrato anche una maggiore dipendenza dall'immunità sociale quando gruppi di 12 lavoratori sono stati brevemente esposti ad alte concentrazioni di conidi di M. robertsii. Immediatamente dopo l'esposizione ai conidi di M. robertsii, entrambe le specie di termiti hanno mostrato LOM elevati. Questa attività di allarme era significativamente più alta in R. flavipes che in R. virginicus (Figura 2), e anche la resistenza alle infezioni fatali era significativamente più alta in R. flavipes che in R. virginicus (Figura 1). Al contrario, si è verificata una risposta di allarme elevata ma debole per i conidi di M. brunneum. Coerentemente con questo risultato, è stato precedentemente dimostrato che un allarme elevato in R. flavipes in risposta ai conidi di diversi ceppi e specie di Metarhizium è correlato ad elevati livelli di allorooming e sopravvivenza [23]. I lavoratori di R. flavipes possono avere una soglia inferiore rispetto ai lavoratori di R. virginicus per riconoscere e rispondere collettivamente ed efficacemente alla contaminazione cuticolare con conidi di M. robertsii. M. robertsii, che è la specie Metarhizium più diffusa nel nostro sito di studio [24], può rappresentare una minaccia per R. flavipes che richiede una forte risposta immunitaria sociale perché questa termite ha difese immunitarie innate relativamente deboli contro di essa. È probabile che l’efficacia dei composti antifungini associati alle secrezioni delle ghiandole salivari sia essenziale per le difese individuali osservate in questo studio [20]. Questi composti sono presenti sulla superficie dei lavoratori prima delle sfide fungine in quanto si esprimono costitutivamente e sono costantemente disseminati dai livelli basali dell'allogrooming, che integra quindi le difese individuali e sociali. Questa gestalt probabilmente include il piccolo peptide antifungino termicon, simile alla defensina, che viene secreto nella ghiandola salivare ed è di fondamentale importanza per la difesa contro le infezioni fatali da Metarhizium [27]. Uno studio su R. flavipes e R. virginicus provenienti dallo stesso sito di raccolta nel Maryland utilizzato in questo studio ha rivelato che i termicini hanno recentemente affrontato uno spostamento selettivo che ha portato ad una riduzione del polimorfismo nucleotidico, e questa riduzione è stata maggiore in R. flavipes rispetto a R. virginico [28].

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L'impatto potrebbe essere stato, e forse continua ad essere, più grave per R. flavipes perché R. virginicus ha meccanismi immunitari innati più efficaci che hanno ridotto la sua dipendenza dai termici per la difesa contro una recente epidemia fungina. In alternativa, i vincoli adattativi sull’evoluzione delle termiti (mancanza di variazione genetica) potrebbero aver lasciato R. flavipes con armi più deboli di fronte a una nuova epidemia fungina. Vincoli sul cambiamento adattativo delle termiche sotto forte pressione selettiva sono evidenti anche nei Nasutitermes australiani [29]. Sembra che il processo stocastico di duplicazione genica abbia rilasciato questo vincolo in diverse linee genetiche del naso, determinando l'evoluzione ripetuta di due termiche con cariche molecolari diverse. Ciò potrebbe aver favorito la difesa antifungina perché due terminali con diverse proprietà di carica limitano le opportunità di evoluzione della resistenza fungina nei loro confronti. Le termiti che mostravano allarme (LOM) dopo l'esposizione a una dose elevata di conidi avevano meno probabilità di morire nell'arco di due settimane rispetto agli individui che non mostravano allarme. I LOM sono correlati positivamente con l'aggregazione dei lavoratori di R. flavipes e l'allorooming [23], il che suggerisce che gli individui che mostravano allarme in questo studio hanno sollecitato una maggiore pulizia da parte dei compagni di nido. I LOM sono raramente riportati nella ricerca che indaga le infezioni da Metarhizium nelle termiti e si ritiene che non abbiano un ruolo nel segnalare l'esposizione agli agenti patogeni [30]. Tuttavia, potrebbero non essere rilevati perché non si verificano in individui isolati, non sono sostanzialmente provocati da alcuni ceppi e specie di Metarhizium, impiegano circa 3 minuti dopo un attacco prima di intensificarsi e regrediscono dopo circa 30 minuti [22,23]. I nostri risultati suggeriscono che i LOM comunicano un avviso di emergenza dopo l’esposizione a una dose elevata di conidi, che vengono rilevati durante l’allorooming. Tuttavia, i LOM non sono necessari per una risposta comportamentale proattiva poiché la durata dell’allorooming è aumentata dopo un’esposizione a basse dosi quando i LOM erano trascurabili.

5. Conclusioni

I LOM sembrano far parte di una risposta di emergenza alla grave contaminazione cuticolare che utilizza la comunicazione in rete per intensificare rapidamente la rimozione e la distruzione della maggior parte dei conidi prima che abbiano la possibilità di attaccarsi saldamente e germinare, operazione che richiede circa 12 ore [31]. Questa risposta all’emergenza sarà probabilmente energeticamente costosa. Una maggiore immunità sociale in R. flavipes in risposta a M. robertsii può essere un compromesso adattativo che R. virginicus non deve fare nella stessa misura perché ha meccanismi immunitari innati più efficaci. Di fronte ai bassi livelli di esposizione agli agenti patogeni che i lavoratori del settore foraggiamento devono sopportare abitualmente, l’allorooming sembra anche compensare i deboli meccanismi immunitari innati.

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