Immunità innata sesso-specifica e invecchiamento nelle tartarughe d'acqua dolce longeve (Kinosternon Favescens: Kinosternidae)
Oct 12, 2023
Astratto
Sfondo
La progressiva deregolamentazione del sistema immunitario con l’età, chiamata immunosenescenza, è stata ben studiata nei sistemi dei mammiferi, ma gli studi sulla funzione immunitaria nelle popolazioni selvatiche e non mammiferi a vita lunga sono scarsi. In questo studio, sfruttiamo uno studio di riconquista del marchio di 38- anni per quantificare le relazioni tra età, sesso, sopravvivenza, capacità riproduttiva e sistema immunitario innato in un rettile longevo, le tartarughe del fango giallo (Kinosternon favescens;Testudine; Kinosternidi).
benefici dell'integratore di cistance: aumentano l'immunità
Metodi
Abbiamo stimato i tassi di sopravvivenza e mortalità specifici per età in base al sesso sulla base dei dati di ricattura del marchio per 1530 femmine adulte e 860 maschi adulti oltre 38 anni di catture. Abbiamo analizzato la competenza battericida (BC) e due risposte immunitarie ai globuli rossi estranei - emoagglutinazione naturale mediata da anticorpi (NAbs) e capacità di emolisi mediata dal complemento (Lys) - in 200 adulti (102 femmine; 98 maschi) che variavano da Di età compresa tra 7 e 58 anni, catturati nel maggio 2018 durante l'emergenza dalla brumazione e per i quali erano disponibili dati sulla capacità riproduttiva e sulla riconquista delle marche a lungo termine.
Risultati
Abbiamo scoperto che in questa popolazione le femmine sono più piccole e vivono più a lungo dei maschi, ma il tasso di accelerazione della mortalità in età adulta è lo stesso per entrambi i sessi. Al contrario, i maschi hanno mostrato un’immunità innata più elevata rispetto alle femmine per tutte e tre le variabili immunitarie che abbiamo misurato. Tutte le risposte immunitarie variavano anche inversamente con l’età, indicando immunosenescenza. Per le femmine che si sono riprodotte nella stagione riproduttiva precedente, la massa delle uova (e quindi la massa totale della covata) è aumentata con l'età. Oltre all'immunosenescenza della competenza battericida, le femmine che hanno prodotto covate più piccole avevano anche una competenza battericida inferiore.
Conclusioni
Contrariamente al modello generale dei vertebrati con risposte immunitarie inferiori nei maschi rispetto alle femmine (probabilmente riflettendo gli effetti soppressivi degli androgeni), abbiamo trovato livelli più elevati di tutte e tre le variabili immunitarie nei maschi. Inoltre, contrariamente al lavoro precedente che non ha trovato prove di immunosenescenza nelle tartarughe dipinte o nelle tartarughe dalle orecchie rosse, abbiamo riscontrato una diminuzione della competenza battericida, della capacità di lisi e degli anticorpi naturali con l’età nelle tartarughe del fango giallo.
Parole chiave
Funzione immunitaria innata, Rettile, Senescenza, Sesso-specifico, Invecchiamento
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Sfondo
L’invecchiamento in molti sistemi vertebrati è caratterizzato da senescenza degli organismi – un calo dell’efficienza e delle prestazioni dei processi fisiologici e cellulari [1] che porta a un declino della sopravvivenza e della fertilità specifiche per età con l’avanzare dell’età [2]. Gli studi sull'invecchiamento nelle popolazioni selvatiche di vertebrati si sono spesso concentrati sulla quantificazione dei cambiamenti legati all'età nella fecondità e nella mortalità [3], ma meno spesso sui meccanismi fisiologici che possono contribuire a tale invecchiamento demografico (ad esempio, [4–6]). Uno di questi meccanismi fisiologici candidati è la funzione immunitaria, che svolge un ruolo fondamentale nella sopravvivenza. È stato dimostrato che una ridotta funzione immunitaria ha un impatto negativo sulla sopravvivenza e sulla riproduzione [6–8]. La progressiva deregolamentazione del sistema immunitario con l’età, chiamata immunosenescenza, è stata ben studiata negli esseri umani sia per l’immunità innata (la cui disregolazione con l’età può portare a infiammazione cronica [9]), sia per l’immunità acquisita, dove i cambiamenti meglio studiati sono un aumento delle cellule T di memoria e una diminuzione delle cellule T naïve con l’avanzare dell’età (ma anche in questo caso l’immunosenescenza rimane enigmatica [10]). Tuttavia, i cambiamenti specifici dell’età nel sistema immunitario delle popolazioni selvatiche e non mammiferi a vita lunga non sono ben descritti in letteratura, e gli studi incentrati sull’immunosenescenza dei rettili sono addirittura rari (rivisti in [8]). La senescenza degli organismi, che dà origine alla senescenza demografica nelle popolazioni, si è evoluta in natura. Pertanto, gli studi sulle popolazioni naturali sono ben posizionati per rivelare processi senescenti evolutivamente conservati che rappresentano possibili vincoli sul modo in cui avviene l’invecchiamento. Allo stesso tempo, lo studio della senescenza organica e demografica in natura fornisce contesti ecologici realistici e rivela la misura in cui i meccanismi di invecchiamento sono flessibili. In particolare, i rettili presentano molte caratteristiche che li consigliano per gli studi sui meccanismi della senescenza, compresa l'immunosenescenza. Innanzitutto, sono il clade gemello dei mammiferi, che insieme formano il clade monofiletico degli amnioti; la funzione immunitaria e le vie di segnalazione cellulare sono altamente conservate negli amnioti (rivisti in [11]). In secondo luogo, i rettili presentano diversi fenotipi che consentono lo studio della senescenza in una gamma di contesti fisiologici e morfologici, cosa che non è possibile nella maggior parte delle specie di mammiferi (ad esempio, resistenza all'ipossia, tolleranza al freddo, veleno, armatura, tolleranza al calore, esaminati in [8 ]). Ad eccezione degli uccelli, i rettili sono poichilotermi e molti continuano a crescere da adulti (ad esempio, [12] ma vedere [13]) e ad aumentare la loro fecondità con l'avanzare dell'età ([14-17], rivisto in [8]). Inoltre, molti lignaggi di rettili hanno caratteristiche morfologiche uniche. Esempi di questi ultimi includono fenotipi protettivi, come le gabbie toraciche esterne nelle tartarughe e il veleno in alcuni serpenti. Recenti analisi filogenetiche dei tassi di mortalità e invecchiamento hanno mostrato un forte sostegno all'ipotesi che i lignaggi dei rettili con fenotipi protettivi avessero una vita più lunga e un invecchiamento più lento rispetto ai mammiferi di dimensioni simili, in particolare tra le tartarughe [18], (vedi anche [19, 20]). In effetti, tra le 300 specie di tetrapodi campionate in natura [18], le tartarughe erano uniche in quanto l’intero lignaggio era caratterizzato da specie con mortalità quasi trascurabile, invecchiamento e lunga durata – una sensazione rispecchiata in cattività [21]. Dato che la crescita (e quindi la fecondità) può continuare nel corso della vita adulta, la selezione contro mutazioni deleterie con fenotipi di età avanzata può essere più forte in età avanzata nelle tartarughe e in altri rettili con queste caratteristiche rispetto ai mammiferi (come in [22]). Questi tratti suggeriscono che l'immunosenescenza potrebbe non manifestarsi allo stesso modo nei rettili rispetto ad altri vertebrati amnioti, come mammiferi o uccelli, e potrebbe addirittura essere assente a causa di pressioni selettive sul mantenimento della funzione immunitaria con aumento della riproduzione (ad esempio, [5]) . Qui ci concentriamo sull’espansione del panorama comparativo degli studi sull’invecchiamento nelle tartarughe per promuoverne l’uso come modelli di invecchiamento lento. Il sistema immunitario delle tartarughe, come altri amnioti, comprende componenti innati e acquisiti (rivisti in [23]), ma analisi recenti suggeriscono che i rettili potrebbero fare più affidamento sulle difese innate rispetto ai mammiferi e agli uccelli [24]. Nello specifico, sebbene i rettili abbiano cellule B e T associate all’immunità adattativa, la tradizionale risposta rapida adattativa all’esposizione secondaria agli agenti patogeni può fare più affidamento sull’immunità innata [24]. Esiste una letteratura crescente sui modelli di immunità innata associati all’età nei rettili ectotermici [4, 25–27], che offrono una prima linea di difesa contro i patogeni estranei. Allo stesso tempo, lo studio delle differenze sessuali sia nella senescenza degli organismi che nell’invecchiamento demografico si è ampliato fino a raggiungere una migliore copertura filogenetica, compresi i rettili [28]. È importante sottolineare che questi studi sono possibili nelle popolazioni selvatiche solo con la capacità di invecchiare accuratamente gli individui, il che richiede uno studio a lungo termine per le specie longeve ([29, 30], rivisto in [31]). Quindi aggiungiamo a questa letteratura indagando gli aspetti della specificità del sesso e dell'età dell'immunità innata, della sopravvivenza, della riproduzione femminile e delle relazioni tra loro in un rettile longevo. Sfruttiamo uno studio di riconquista di 38- anni di tartarughe di fango gialle di età nota (Kinosternon favescens) per quantificare le relazioni tra età, sesso, sopravvivenza e capacità riproduttiva sul sistema immunitario innato come approccio integrativo per comprendere l'immunosenescenza. Come altre tartarughe, è stato riscontrato che questa specie ha un invecchiamento lento quando i sessi vengono considerati insieme [18]. Nello specifico, abbiamo valutato tre misure del sistema immunitario innato – anticorpi naturali circolanti, capacità di lisi mediata dal complemento e competenza battericida del plasma – nella nostra popolazione di studio a lungo termine nel Nebraska (USA). Secondo il paradigma esistente dell’immunosenescenza innata, abbiamo previsto che le misure dell’immunità innata sarebbero diminuite con l’avanzare dell’età, nonostante alcune prove contrarie [5, 32].
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Risultati
Nel 2018 sono stati campionati duecento animali per le variabili immunitarie (N=98 maschi, N=102 femmine) e queste osservazioni costituiscono i nostri dati immunitari. Di queste 102 femmine, 85 si sono riprodotte nel 2017 e queste comprendono i nostri dati riproduttivi femminili. Infine, per l'analisi della senescenza della mortalità nella popolazione nel suo insieme, abbiamo utilizzato il nostro database a lungo termine di N=2380 individui unici con età nota (N=860 maschi, N=1530 femmine ). Nel nostro campione di individui con dati immunitari (200 adulti), l’età era altamente correlata alle dimensioni corporee; gli animali più anziani erano più grandi sia in massa che in lunghezza (ad esempio, massa corporea, r=0.58, Pr.<0.0001; plastron length, r=0.60, Pr. <0.0001). Therefore body size was not included in models where age was an explanatory factor. In the immune data individuals, adult females were smaller than males and tended to be older (Table 1, Fig. S2), a result that is mirrored in the population as a whole (see Fig. 5 in [33]). Because adult females in our immune sample were significantly older than males, we z-transformed age for all analyses of innate immune function to dissociate the confound of age and sex. This allowed for a comparison of relatively old and young adult males and females.
Tabella 1 Dimensioni, età e mortalità dell'invecchiamento nelle tartarughe gialle
Nella popolazione nel suo complesso, le femmine avevano una durata media e massima di vita adulta maggiore (età alla quale erano morti il 50 e il 95% degli adulti). Sia le tartarughe adulte maschi che quelle femmine hanno mostrato aumenti di moralità legati all'età, indicando l'invecchiamento. Il tasso di mortalità iniziale degli adulti era più alto nei maschi rispetto alle femmine, ma i tassi di accelerazione della mortalità erano equivalenti (Tabella 1, Fig. 1). Nel nostro sottocampione immunitario di individui, le tre misure della funzione immunitaria innata erano significativamente (positivamente) correlate tra loro (emoagglutinazione mediata da anticorpi naturali, emolisi mediata dal complemento e competenza battericida, Tabella S1). Ma poiché le correlazioni erano deboli (tutti |r|< 0.28), we analyzed each variable separately. For all three variables, batch represents the reagents used. For bactericidal competence, five individual lyophilized pellets of Escherichia coli were used to generate control plates across the experiment; as control plates decreased in their colony count, a fresh control solution was made. For natural antibodies and cell lysis capability, two separate bottles of rabbit red blood cells were used sequentially. Significant variation among E. coli pellets and individual rabbits (that generate the red blood cells) is expected, and we controlled for it here as a batch effect in our models. All three immune variables declined with advancing age (BC and Lysis, Pr< 0.05; Nabs, Pr=0.08, Table 2, Fig. 2) and were higher in males than females (Table 2, Fig. 3). For the 85 females in our data for which we had both most-recent reproductive output and immune measures, clutch size did not change with age, whereas egg mass increased with age (Tables 3, S2, Fig. 4). Because clutch size did not change with age, a third measure of reproductive effort, total clutch mass followed the identical trend as egg mass and was not considered further. Interestingly, the three females greater than 50 years old had lower age-corrected egg mass (age>50 anni) rispetto alle femmine nell'intervallo di età immediatamente inferiore (N=13 età 40–50 anni (t=2.45, Pr.=0.014)), suggerendo la possibilità di senescenza nella capacità riproduttiva nelle femmine molto anziane (vedi Fig. 4). Per queste 85 femmine riproduttive, le femmine più anziane hanno seguito la stessa tendenza osservata per tutti gli adulti: ridotta competenza battericida ed emolisi mediata dal complemento con l'età (Tabella 3, vedere Fig. 1). Inoltre, le femmine con covate più grandi, indipendentemente dall'età, avevano una competenza battericida maggiore rispetto a quelle con covate più piccole (Fig. S1). A differenza delle dimensioni della covata, non abbiamo riscontrato effetti della massa delle uova sulla funzione immunitaria (dati non mostrati).
Discussione
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Mortalità e senescenza riproduttiva
Le femmine delle tartarughe gialle vivono più a lungo dei maschi in questa popolazione; tuttavia, invecchiano a ritmi simili (Fig. 1) e la mortalità specifica per età aumenta con l'età in entrambi i sessi (Fig. 1), anche se lentamente. Questi dati dimostrano una senescenza a mortalità lenta in questa specie, ma non abbiamo trovato prove di senescenza riproduttiva nei nostri campioni femminili. Una piccola accelerazione nella mortalità specifica per età degli adulti nelle tartarughe è stata segnalata nell'ampio studio filogenetico sui tetrapodi [18] così come in studi individuali a lungo termine per le tartarughe giganti [34] e le tartarughe dipinte ([35, 36] ma vedere [ 37, 38] e specie di testuggini a cerniera [39]); tuttavia, in altre specie di tartarughe, la mortalità spesso rimane costante con l’avanzare dell’età adulta [40], o diminuisce con l’età [3, 15, 41]. Nelle popolazioni di tartarughe in cattività (ad esempio, nei registri dello zoo) da Silva et al. [21] hanno scoperto che la maggior parte delle specie di tartarughe mostravano un calo lento o trascurabile della mortalità con l’età. L'invecchiamento riproduttivo femminile (cioè il calo della capacità riproduttiva specifica per età) non è stato finora osservato nelle specie di tartarughe (tartarughe dipinte [30], tartarughe di Blanding [15, 41], tartarughe del deserto [3] e tartarughe scatola [42]). . Warner e colleghi [30] hanno notato una diminuzione della sopravvivenza dei cuccioli di tartaruga dipinta rispetto alle femmine più anziane di tartaruga dipinta, nonostante nessuna diminuzione della capacità riproduttiva. Inoltre, molti studi sulla riproduzione delle tartarughe hanno dimostrato correlazioni positive tra la dimensione della covata, la dimensione dell'uovo e/o la massa della covata con la dimensione corporea nelle tartarughe ([43]; revisione [44]), dove la dimensione corporea è spesso positivamente associata all'età nelle tartarughe. tartarughe (ad esempio, il presente studio, [17, 32], ma vedere [41]). Questi dati suggeriscono che la senescenza riproduttiva si verifica raramente nelle tartarughe, se non del tutto.
Fig. 1 Sopravvivenza e mortalità specifica per età nei maschi e nelle femmine adulti di K. favescens. La durata mediana (50% viva) e massima (5% viva) è maggiore nelle femmine adulte (linee tratteggiate nere) delle tartarughe gialle rispetto ai maschi adulti (linee continue grigie). L'asse Y è la sopravvivenza Lx per gli adulti, a partire dall'età di 11 anni. Le linee che scendono verso l'asse x mostrano la durata mediana e massima specifica per sesso in età cronologica. Il riquadro mostra i modelli Gompertz di accelerazione della mortalità in età adulta; la mortalità iniziale degli adulti per i maschi è significativamente più alta che per le femmine (elevazione delle linee), con incrementi equivalenti (pendenze delle linee) (Tabella 1). L'asse Y è il logaritmo naturale della mortalità specifica per età dal modello di accelerazione di Gompertz adattato
Longevità e invecchiamento specifici per sesso
Gli studi sulle differenze sessuali nella senescenza organismica e demografica rimangono rari nelle specie non mammiferi. Ci sono probabilmente due ragioni per questo: i rapporti iniziali sulla demografia delle popolazioni selvatiche spesso raccolgono dati sufficienti per stimare l’accelerazione della mortalità; e in molte specie il sesso dei giovani è sconosciuto a causa della mancanza di genitali esterni e deve fare affidamento sullo sviluppo di fenotipi sessuali secondari per assegnare il sesso negli animali appena maturi. In una revisione dei dati sulla longevità in cattività, da Silva e colleghi [21] hanno riferito che l’aspettativa di vita media dei maschi adulti superava quella delle femmine di circa il 20%, contrariamente ai nostri risultati per le tartarughe gialle. Tuttavia, il modello sembra essere una maggiore longevità nelle femmine nelle popolazioni selvatiche di tartarughe (tartarughe dipinte [28, 45]), tartarughe maculate [46, 47], tartarughe legno [48], tartarughe mappa [49] cooters [50], tartarughe scatola [51] e tartarughe dalle orecchie rosse [52]). Al contrario, siamo a conoscenza di solo due studi che hanno riportato che le tartarughe maschi sopravvivono alle femmine in natura (tartarughe gopher [53] ma vedere [54], e una popolazione di tartarughe dipinte [36]. Sono necessari ulteriori dati, ma questi sono i dati sul campo contrastano con i dati in cattività riassunti da [21] e suggeriscono una possibile interazione sesso-ambiente correlata alla longevità e all'invecchiamento.
Tabella 2 Analisi della varianza per le variabili immunitarie per tartarughe gialle adulte maschili e femminili
Funzione immunitaria specifica per il sesso
Abbiamo riscontrato livelli più elevati di funzione immunitaria nei maschi rispetto alle femmine, l'opposto del modello generale nei vertebrati [55, 56], e si presume che siano correlati almeno in parte alla soppressione del sistema immunitario da parte degli androgeni [57, 58]. Molte specie di tartarughe sono modelli appropriati per questa domanda perché mancano di cromosomi sessuali e quindi i sessi hanno un'architettura genomica identica al momento del concepimento. Tey invece ha la determinazione del sesso dipendente dalla temperatura (TSD) per cui il sesso è determinato dall'ambiente termico sperimentato durante il periodo critico dello sviluppo embrionale, eliminando qualsiasi confusione tra genomi sesso-specifici e sviluppo sessuale sesso-specifico [59]. López-Pérez e colleghi [60] non hanno riscontrato differenze nella competenza battericida tra maschi e femmine in una specie di tartaruga muschiata (un'altra tartaruga kinosternide con TSD). Allo stesso modo, Zimmerman e colleghi [32, 61, 62] non hanno riscontrato differenze tra i sessi nelle misure di immunità innata nelle tartarughe dalle orecchie rosse (anche con TSD). Al contrario, nelle tartarughe dipinte [5] – un’altra specie con TSD –, è stata segnalata una maggiore capacità di emolisi mediata dal complemento nei maschi e titoli anticorpali naturali più elevati nelle femmine, senza alcun effetto sessuale sulla competenza battericida. Inoltre, Freedberg e colleghi [63] hanno scoperto che le temperature fresche di incubazione per la produzione dei maschi in un'altra tartaruga TSD hanno aumentato l'immunocompetenza nei maschi più che nelle femmine, ma non hanno riscontrato tali effetti in un congenere strettamente correlato. Sebbene questi dati preliminari sembrino suggerire che le tartarughe potrebbero non seguire il modello generale dei vertebrati di risposte immunitarie inferiori nei maschi, sono chiaramente necessarie ulteriori ricerche. Seguendo la teoria dell’ecoimmunologia che postula associazioni tra difese immunitarie e strategie di storia della vita [64, 65], ci aspetteremmo che il sesso più longevo investa più pesantemente nell’immunità acquisita rispetto a quella innata [66]; i dati limitati sulla longevità specifica per sesso precludono un test completo su tutte le specie.
Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario
Le differenze comportamentali e i modelli di attività possono sottoporre le femmine delle tartarughe gialle a maggiori pressioni infettive rispetto ai maschi, il che può sopprimere la funzione immunitaria femminile [55, 56]. La nostra specie di studio ha un ciclo di attività annuale insolito (vedi Metodi). Nel nostro sito di studio i maschi adulti emergono dalla brumazione in media 5 giorni prima delle femmine in primavera [Iverson e Greene, dati non pubblicati], rimangono attivi in acqua in giugno durante le estese incursioni di nidificazione delle femmine, e in media si spostano verso l'estivazione estiva più tardi rispetto alle femmine [67]. Pertanto, il periodo di attività annuale di questa specie è insolitamente breve, con un maschio tipico che è attivo nell'acqua forse il 25% più a lungo di una femmina tipica. Tuttavia, non è chiaro il motivo per cui la stagione di attività più breve delle femmine le esporrebbe a maggiori pressioni sul sistema immunitario. Inoltre, l’attività riproduttiva differisce tra maschi e femmine, con l’accoppiamento e la fecondazione che avvengono nella colonna d’acqua, dopo di che le femmine devono emergere dall’acqua per raggiungere la terra per depositare le uova (mentre i maschi non hanno tale incursione obbligatoria sulla terra) [67]. stagionale (ad esempio, [le concentrazioni di steroidi circolanti nei rettili sono altamente 68, 69]), e quindi il modello che abbiamo osservato di una maggiore funzione immunitaria nei maschi potrebbe essere attribuito al campionamento solo durante l'emergenza primaverile, cioè molto all'inizio della stagione. Le variazioni stagionali degli androgeni delle tartarughe sono state studiate abbastanza bene e i livelli circolanti di testosterone per le tartarughe maschi sono generalmente molto bassi all'inizio della primavera (recensione in [69]), mentre raggiungono il picco in primavera per le femmine mentre si preparano per l'ovulazione [69– 74]. È noto che il testosterone sopprime la funzione immunitaria ([57], ma vedere [58]) e questo potrebbe spiegare le risposte immunitarie inferiori nelle donne rispetto ai maschi. Tuttavia, è noto che l’estradiolo migliora la funzione immunitaria [23], ed è generalmente elevato nelle femmine all’inizio della primavera, seguito da un picco subito dopo in associazione con l’ovulazione e l’ovideposizione ([75], rivisto in [69]). Pertanto, sulla base del nostro campionamento all’inizio della primavera, i modelli di estradiolo e testosterone sono improbabili spiegazioni per le risposte immunitarie inferiori osservate nelle nostre femmine. Sfortunatamente, non disponiamo di dati sui livelli ormonali circolanti nelle specie studiate, ma dati i modelli generali appena descritti, l’impatto degli steroidi circolanti sulla funzione immunitaria non è ancora chiaro.
Fig. 2 L'immunità innata diminuisce con l'età negli adulti di K. favescens. A La competenza battericida e B La lisi mediata dal complemento diminuiscono con l'età in modo simile per le tartarughe gialle adulte maschi e femmine (vedere la Tabella 2 per i risultati statistici). Gli anticorpi naturali C (NAbs) hanno mostrato la stessa tendenza. In tutti i pannelli, l'asse Y rappresenta i residui dei modelli lineari con l'età rimossa dal modello (Tabella 2). L'asse X è un'età trasformata in z con linee inserite per indicare l'età in anni per le tartarughe adulte maschi e femmine. Regressioni: residui BC=−{{10}}.138(zAge), R2=0.06; Residui di lisi=−0,01(zAge), R2=0,02; Residui NAbs=−0,01(zAge), R2=0,01
Riproduzione femminile e funzione immunitaria
Non abbiamo trovato prove di un costo immunitario per la riproduzione femminile. Né le dimensioni della covata (Tabella 3) né la massa delle uova (dati non mostrati) hanno avuto un impatto negativo su alcuna variabile immunitaria. In effetti, le femmine che deponevano covate di uova più grandi avevano una maggiore capacità battericida (Fig. S1). La teoria della storia della vita prevede che gli individui debbano allocare risorse verso tratti come quelli che supportano l’automantenimento e la riproduzione al fine di massimizzare la forma fisica [76]. Tuttavia, la riproduzione rappresenta un costo energetico significativo per le femmine, e quindi le risorse destinate alla riproduzione possono andare a scapito di altri tratti [77]. Ci si può quindi aspettare che le femmine che investono molto nell’attuale riproduzione sperimentino un compromesso con l’attuale efficacia immunitaria [78]. Questo compromesso tra riproduzione e funzione immunitaria è stato esaminato in altri rettili con risultati contrastanti. I serpenti giarrettiera terrestri occidentali gravidi (Tamnophis elegans) hanno mostrato una capacità proliferativa dei linfociti T inferiore in risposta a un mitogeno rispetto ai conspecifici non gravidi, ma non hanno mostrato differenze nella BC tra gli stati riproduttivi [27]. Al contrario, i serpenti a sonagli pigmei gravidi (Sistrurus milarius) mostravano una ridotta capacità BC rispetto ai serpenti non gravidi [79]. Le misurazioni dell’immunità innata tra gli stati riproduttivi nelle tartarughe dipinte (Chrysemys picta) erano dipendenti dall’età [5]. Nello specifico, le femmine più giovani che avevano covate di grandi dimensioni hanno mostrato una maggiore capacità di lisi rispetto alle femmine più anziane con covate di dimensioni simili. Tuttavia, questo stesso studio ha riscontrato un aumento del BC nelle donne anziane, il che è in contrasto con i risultati di questo studio sulla diminuzione della funzione immunitaria con l'avanzare dell'età. Inoltre, indipendentemente dall'età, abbiamo scoperto che dimensioni maggiori della frizione erano correlate con un BC più elevato e che non vi era alcun effetto della riproduzione sulla produzione naturale di anticorpi o sulla capacità di lisi. Questi risultati suggeriscono che i compromessi tra funzione immunitaria e riproduzione sono probabilmente specifici della componente immunitaria.
Fig. 3 L'immunità innata è significativamente più elevata nei maschi rispetto alle femmine adulte di K. favescens. I minimi quadrati retrotrasformati significano ±1 SE per A) competenza battericida (l'asse y è la proporzione di colonie di E. coli uccise) e B) anticorpi naturali (l'asse y è il titolo di diluizione massimo al quale si verifica l'emoagglutinazione dei globuli rossi di coniglio ) e lisi mediata dal complemento (titolo di diluizione massimo al quale avviene la lisi dei globuli rossi di coniglio). Gli asterischi rappresentano una differenza sessuale significativa per una determinata misura immunitaria. (Vedi tabella 2 per i risultati statistici). LS significa: BC=0.37, 0.62; NAb=4.0, 4.6; Lys=8.2, 9.0
Tabella 3 Analisi delle variabili immunitarie e dello sforzo riproduttivo per le femmine riproduttive delle tartarughe del fango giallo
Fig. 4 La massa delle uova, non la dimensione della covata, aumenta con l'età nella riproduzione delle femmine di K. favescens. L'asse Y rappresenta i residui del modello lineare nella Tabella 3 con l'età rimossa dal modello. Residui di massa delle uova=0.025(Età) – 0,73, R2=0.40
Immunosenescenza
Delle variabili immunitarie innate che abbiamo esaminato nelle tartarughe gialle, abbiamo trovato prove di immunosenescenza in tutte e tre (Fig. 2; Tabella 2). I risultati di altri studi sono contrastanti. Ad esempio, gli slider dalle orecchie rosse più grandi (presumibilmente più vecchi) non hanno mostrato alcun cambiamento nel BC rispetto agli individui più piccoli [32, 61], in modo simile ai risultati relativi alla competenza battericida nelle tartarughe dipinte dove l'età era nota [5]. Quest'ultimo studio ha riportato anche un aumento dell'emoagglutinazione negli animali più anziani. Ovviamente, non è ancora evidente alcun modello di cambiamenti legati all’età nel sistema immunitario innato delle tartarughe. Anche tra gli altri rettili non aviari, i risultati sono piuttosto variabili (rivisti in [8, 26]). Ad esempio, nelle popolazioni di serpenti giarrettiera, sia la capacità di emoagglutinazione che quella di emolisi diminuiscono nei serpenti più anziani [27, 80], così come la risposta immunitaria al mitogeno fitoemoagglutinina nelle lucertole dal collare di Dickerson [81]. Mentre nei pitoni acquatici, l’emoagglutinazione aumenta con l’età [82]. Saranno necessarie ulteriori ricerche per comprendere questa variazione nella direzione dei cambiamenti legati all’età nell’immunità innata nei rettili in generale e nelle tartarughe in particolare. Al contrario, i dati relativi ai mammiferi e agli uccelli mostrano generalmente un declino della funzione immunitaria con l’età. Inoltre, in questi taxa, la maggior parte dell’immunosenescenza osservata si è verificata nel sistema immunitario adattivo [83-85] con cambiamenti meno pronunciati riscontrati nell’immunità innata (rivista in [6]), sebbene anche in questo caso i modelli non siano necessariamente coerenti tra le misure dell’immunità innata [ 86]. Tuttavia, nei rettili, il sistema immunitario adattativo risponde più lentamente alle sfide e non mostra risposte robuste durante l’esposizione ripetuta agli agenti patogeni (rivisto in [24, 87]). Pertanto, la funzione immunitaria innata e i cambiamenti legati all’età in tale funzione possono essere fondamentali per la salute immunitaria generale nei rettili.
Conclusioni
Qui abbiamo tentato di espandere le considerazioni comparative sull'immunosenescenza innata e sulle sue interazioni con la mortalità e l'invecchiamento riproduttivo. Abbiamo scelto una popolazione selvatica di tartarughe (fango giallo) studiata a lungo per testare le associazioni tra queste misure di invecchiamento perché recenti ampi studi comparativi hanno identificato il clade delle tartarughe come dotato di invecchiamento eccezionalmente lento e lunga durata. Ciononostante, le misurazioni dei meccanismi di invecchiamento richiedono età conosciute, cosa ottenibile solo attraverso studi a lungo termine per specie selvatiche e longeve. Abbiamo scoperto che la mortalità e l’immunità avevano caratteristiche specifiche per il sesso; le femmine vivevano più a lungo e avevano una funzione immunitaria innata inferiore rispetto ai maschi. Questo risultato è sorprendente in base alla dipendenza dalla temperatura della determinazione del sesso, escludendo così il contributo dei cromosomi sessuali all'invecchiamento sesso-specifico. Tutte e tre le misure dell’immunità innata diminuiscono con l’avanzare dell’età. Nelle femmine, la massa della covata aumentava con l'avanzare dell'età e la capacità riproduttiva non prevedeva la funzione immunitaria innata, a parte il fatto che le femmine con covate più grandi avevano una maggiore competenza battericida, suggerendo che non vi fosse alcun costo evidente dello sforzo riproduttivo per l'immunità innata nelle femmine. Questo è il primo studio ad esaminare tre assi di invecchiamento nelle tartarughe, un gruppo caratterizzato da un invecchiamento da lento a trascurabile. Questi risultati su immunosenescenza, mortalità e riproduzione suggeriscono le tartarughe come un nuovo modello per comprendere i meccanismi dell’invecchiamento lento o, più precisamente, lo studio dei meccanismi di invecchiamento universale (come l’immunosenescenza) in un gruppo monofiletico caratterizzato da una lenta accelerazione della mortalità adulta e da senescenza riproduttiva trascurabile.
Metodi
Campionamento sul campo
Il campionamento dei tessuti delle tartarughe del fango giallo (YMT) per questo studio ha avuto luogo il 2018 maggio sul lago Gimlet presso il nostro sito di ricerca a lungo termine nel Crescent Lake National Wildlife Refuge (CLNWR), nella contea di Garden, Nebraska , Stati Uniti (41 gradi 45,24′N, 102 gradi 26,12′O). Il complesso paludoso del lago Gimlet è un lago sabbioso poco profondo (profondità media 0,8 m) con habitat palustre [88]. Gli YMT mostrano una determinazione del sesso dipendente dalla temperatura (TSD) con femmine prodotte in condizioni di incubazione calde e sia maschi che femmine prodotti in condizioni più fresche [59]. Qui dal 1981 al 2018 erano in corso studi sulla riconquista dei segni e sull'ecologia della nidificazione. In questo sito, gli YMT tipicamente svernano terrestre sepolti nelle colline sabbiose montane adiacenti alle zone umide, emergono in aprile e maggio e migrano verso l'acqua, quindi la maggior parte delle femmine ritorna al mare. stessi sandhills a nidificare in giugno, anche se alcuni non si riproducono ogni anno [67, 87]. Entro luglio tutte le tartarughe iniziano a lasciare le zone umide per estivare nelle colline sabbiose per il resto dell'estate (vedi anche [89]). Durante la stagione dei campi, sono state costruite recinzioni parallele alla riva tra tre siti di svernamento e il lago, e monitorate continuamente ogni giorno. Durante gli anni (incluso il 2017) in cui le recinzioni erano installate durante la stagione di nidificazione, ciascuna femmina catturata è stata sottoposta a raggi X per determinare la dimensione della covata ed è stata misurata la larghezza di ciascun uovo su ciascuna radiografia. Un'equazione di regressione che mette in relazione la larghezza media dei raggi X della covata con la massa media effettiva delle uova di un sottoinsieme di nidi successivamente scavati ci ha permesso di stimare la massa delle uova e la massa della covata (entrambe in g) per ciascuna femmina gravida nel 2017 (n{{24} }). Le equazioni per queste relazioni e ft sono le seguenti: Larghezza uovo effettiva=0.98(Larghezza uovo stimata)+1.52, R2=0.89; Massa effettiva delle uova=0.64 (Massa stimata delle uova) – 6,07, R2=0.85; e in un campione di N=1795 uova YMT raccolte nell'arco di diversi anni la larghezza dell'uovo può essere utilizzata in modo affidabile per stimare la massa dell'uovo (e quindi la massa totale della covata) Massa dell'uovo=0.68(Larghezza dell'uovo) – 6,77, R2=0.85 (Iverson, dati non pubblicati). Ciò ci ha permesso di esaminare gli effetti di tali misure della capacità riproduttiva sull’immunità nella primavera del 2018, quando queste 85 femmine di tartaruga emergevano dalla brumazione. Una volta catturate, le tartarughe sono state trasportate al laboratorio sul campo dove sono stati registrati i dati morfometrici, tra cui la lunghezza massima del carapace (CL in mm), la lunghezza massima del piastrone (PL in mm) e la massa corporea (BM in g). Fino a 0,5 ml di sangue intero sono stati raccolti dal seno cervicale tramite una siringa eparinizzata calibro 26 e centrifugati (7000 giri/min) in una crioprovetta per 5 minuti per separare i componenti del sangue. Il plasma sanguigno è stato pipettato in un criotubo separato. Sia il plasma che i globuli rossi concentrati sono stati immediatamente congelati in azoto liquido fino al trasporto all'Iowa State University per la conservazione a -80 gradi. Le tartarughe campionate (98 maschi e 102 femmine) sono state trasportate al luogo di cattura iniziale e rilasciate sul lato opposto della recinzione per procedere verso il lago.
Determinazione dell'età
Dall'inizio di questo studio nel 1981, l'età in anni alla cattura iniziale di ciascuna tartaruga è stata stimata come il numero di inverni successivi alla schiusa. La stima dell'età è la stessa ogni anno e, quindi, i nostri metodi per la determinazione dell'età si applicano a tutti i dati qui considerati (popolazione e sottocampione immunitario). Poiché in questa popolazione viene prodotto ogni anno un solo scute anulare, l'età delle tartarughe immature solitamente equivale al numero totale di anelli anulari presenti. Tuttavia, durante anni estremamente rigidi, potrebbe non esserci alcuna crescita e due anelli annuli potrebbero apparire come uno solo. Pertanto, i conteggi degli annuli sono età minime e potrebbero essere sottostimati se gli annuli non vengono contati e valutati nel contesto dei modelli generali di crescita delle conchiglie nell'intera popolazione. Confrontando il modello degli incrementi nella crescita degli scudi di una tartaruga giovane non invecchiata con il modello generale di crescita degli scudi nella popolazione, l'età alla prima cattura potrebbe essere determinata in modo affidabile fino ad almeno 12 anni. Abbiamo contato il numero minimo di anelli annuali sulle tartarughe adulte catturate nei primi anni dello studio e l'età è stata stimata per tutte quelle tartarughe se il numero di anelli annuali era inferiore a 20. Tuttavia, la maggior parte delle tartarughe sono state inizialmente contrassegnate individualmente e invecchiate prima del sesto inverno, e successivamente invecchiate in base all'effettivo intervallo di riconquista. Le femmine adulte erano significativamente più vecchie (e più piccole) dei maschi nei nostri campioni (Tabella S3; test t non accoppiato, P=0.0003, vedere Fig. S2 e Fig. 5 in [33]). Pertanto l'età è stata trasformata in z all'interno di ciascun sesso in una media pari a 0 con varianza unitaria. Questa variabile "età" è stata utilizzata in tutte le analisi statistiche. Abbiamo escluso i dati di 26 giovani asessuati.
Analisi riproduttiva
La capacità riproduttiva – dimensione della covata, massa totale della covata – aumenta con l’aumentare della taglia e dell’età. Pertanto, per le analisi che includevano la capacità riproduttiva femminile insieme all’età nel modello, abbiamo utilizzato valori grezzi della capacità riproduttiva senza correggere le dimensioni corporee. Tutti i modelli lineari sono stati eseguiti in SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA).
Analisi di sopravvivenza
I tassi di sopravvivenza e di mortalità specifici per età degli adulti di Kinosternon favescens del Nebraska occidentale sono stati stimati sulla base del modello Gompertz (Tabella 1) [18, 90, 91] che stima una probabilità di mortalità iniziale all'età di partenza e il tasso di accelerazione della mortalità in tutto il periodo. durata. Modelli più complicati (ad esempio, incluso un termine Makeham costante per la mortalità indipendente dall'età, incluso un parametro di decelerazione) non erano supportati da questi dati basati sulla variazione dell'AIC (calcolata nel pacchetto BaSTA R [90]). Il modello Gompertz è stato applicato al nostro set di dati di ricattura dei segni a lungo termine da Gimlet Lake, inclusi i dati di 1530 singole femmine e 860 singoli maschi. L’età alla maturità era in media di 11 anni per entrambi i sessi, come è noto dal monitoraggio a lungo termine dell’età e della riproduzione in questa popolazione [88, 92, 93]. Poiché la maturazione dipende dalle dimensioni, queste stime dell'età di maturazione (cioè 11 anni) sono stime massime (ad esempio, una tartaruga maschio occasionale può essere identificata in età più giovane). Abbiamo testato la sensibilità dell'utilizzo di un'età media di maturazione di 10 anni senza effetti apprezzabili sulle stime della durata della vita e della mortalità dell'invecchiamento (dati non mostrati). La durata massima e mediana della vita adulta è stata calcolata come il numero di anni successivi all'età della prima riproduzione fino al momento in cui si stimava che il 95 e il 50% degli adulti nella coorte sintetica fossero morti. I set di dati sono stati analizzati utilizzando la funzione 'basta' del pacchetto BaSTA per R [90].
Misure immunitarie
Si ritiene che l’emoagglutinazione naturale mediata da anticorpi e l’emolisi mediata dal complemento (NAbs, Lysis) siano la prima linea di difesa contro i patogeni nei vertebrati (rivisti in [94]), e queste misure della funzione immunitaria innata sono state studiate in molti rettili specie (ad esempio, [4, 5, 32, 80, 82, 95]). Abbiamo completato i test per gli NAbs e la capacità di lisi secondo il test di emolisi-emoagglutinazione adattato da [96] per l'uso nelle tartarughe dipinte [5, 97]) utilizzando globuli rossi di coniglio. Abbiamo utilizzato due flaconi di globuli rossi di coniglio (HemoStat HemoStat Laboratories, Dixon, CA, USA) per completare tutti i test. Abbiamo analizzato tutte le piastre con controlli positivi e negativi e campioni in duplicato. Titoli più elevati di emoagglutinazione indicano una maggiore abbondanza di anticorpi naturali nel campione di plasma, poiché titoli elevati indicano che gli anticorpi naturali sono ad alte concentrazioni anche in plasma sempre più diluito [96]. Allo stesso modo, titoli più elevati di emolisi indicano che il plasma è in grado di lisare i globuli rossi anche a concentrazioni più diluite [96]. Pertanto, l’aumento dei livelli di anticorpi naturali e della capacità di lisi sono associati ad un aumento della funzione immunitaria. Abbiamo valutato la competenza battericida (BC) del plasma quantificando la sua capacità di inibire la crescita di Escherichia coli utilizzando il nostro protocollo pubblicato per le tartarughe dipinte [5, 97], adattato da [98]. Nel presente esperimento sono stati utilizzati cinque pellet liofilizzati di E. coli (Microbiologics, ATCC#8739), e ogni nuovo pellet è stato utilizzato per generare una nuova soluzione di controllo man mano che si procedeva attraverso i campioni. Una maggiore competenza battericida corrisponde ad un aumento della funzione immunitaria. Tutti i test immunitari sono stati condotti nella primavera del 2019 su campioni raccolti nella primavera del 2018.
Misura immunitaria: analisi statistiche
Le variabili dipendenti sono state analizzate utilizzando modelli lineari generali con variabili esplicative di zAge (età standardizzata per ciascun sesso); Sesso (maschi adulti e femmine adulte); l'interazione bidirezionale tra zAge e Sex; e il lotto di analisi della variabile fastidiosa (BC: N=4; NAbs e Lysis: N=2) per tenere conto dei pellet di controllo (BC) o del flacone di globuli rossi di coniglio (NAbs e Lysis). La competenza battericida è stata trasformata in Arcoseno per tenere conto dei dati proporzionali e per soddisfare le condizioni di normalità. NAbs e Lysis sono stati trasformati in log-10 per soddisfare le condizioni di normalità. Tutti i modelli lineari sono stati eseguiti in SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA). I grafici sono stati realizzati in ggplot2 [99].
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