Galactan protegge le cellule di lievito dalla morte cellulare per apoptosi.

Per verificare se Galactan haanti-apoptoticoproprietà,abbiamo trattato mutanti deficienti del gene anti-apoptotico del lievito (fs1∆ e pep4∆) con galactan e li abbiamo esposti a un induttore di apoptosi, H2O2. Mentre il lievito Fis1 è una proteina di fusione mitocondriale epreviene l'apoptosi, il lievito Pep4 è un'aspartil proteasi vacuolare eprotegge le cellule dall'apoptosi indotta dall'acido acetico80,81. I conteggi di CFU hanno mostrato un aumento di circa il 25-30% nella sopravvivenza di entrambe le cellule pep4∆ e fs1∆ quando trattate con galattano rispetto alle cellule sotto stress apoptotico indotto da 1 mM H2O2 (Fig. 5A). I risultati del test spot hanno anche mostrato una concordanza con i conteggi CFU che hanno mostrato una migliore sopravvivenza dei mutanti anti-apoptotici di lievito trattati con galattano sotto stress apoptotico (Fig. 5B). I nostri risultati mostrano che il galattano protegge le cellule di lievito dalla morte cellulare per apoptosi indotta da H2O2.

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Galactan riduce la condensazione della cromatina. In questo studio, abbiamo eseguito la colorazione AO/EB delle cellule di lievito pretrattate con galattano. Le cellule pep4∆ e fs1∆ con solo H2O2 apparivano per lo più giallo-arancio rispetto a WT, e una notevole riduzione del numero di cellule di colore giallo-arancio è stata osservata nelle cellule pretrattate con galattano e poi esposte a H2O2. Ciò dimostra che il numero di cellule apoptotiche si è ridotto significativamente nella riduzione di pep4∆ e nella condensazione della cromatina. La colorazione AO/EB è un metodo utilizzato per rilevare l'apoptosi sia nelle cellule di lievito che in quelle di mammifero. L'arancio di acridina è un colorante permeabile alle cellule che colora prontamente gli acidi nucleici sia nelle cellule vitali che in quelle non vitali, mentre il bromuro di etidio è un colorante intercalante del DNA che entra solo quando le cellule sono disintegrate o apoptotiche o morte. Questa selettività della colorazione AO/EB consente il rilevamento di cellule in tre diverse fasi, vale a dire cellule vitali con colore verde uniforme sia nel nucleo che nel citoplasma, cellule apoptotiche precoci con nucleo di colore verde brillante a causa della condensazione della cromatina che risalta nel citoplasma e cellule tardive cellule apoptotiche che mostrano un colore dal giallo all'arancio/rosso vivo a causa dell'ingresso di bromuro di etidio nelle cellule50,51.

Galactan riduce la frammentazione nucleare.

Yeast WT e mutanti deficienti anti-apoptotici (pep4∆ e fs1∆) pretrattati con o senza galattano sono stati esposti a H2O2 e sottoposti a colorazione DAPI. Le cellule mutanti carenti di lievito anti-apoptotico pretrattate con galattano hanno mostrato una minore frammentazione nucleare e una bassa intensità di DAPI, mentre quelle senza pretrattamento con galattano hanno mostrato una fluorescenza significativamente più alta e una maggiore frammentazione nucleare (Fig. 5D)52. Ciò indica che il galattano può alleviare efficacemente la frammentazione nucleare indotta dallo stress ossidativo che porta alla disintegrazione cellulare. In precedenza, è stato dimostrato nei topi transgenici che Bifidobacterium breve riduce le caratteristiche apoptotiche come lo spargimento cellulare nelle cellule epiteliali intestinali che è mediato dall'EPS presente sulla superficie del termine Bifdobac. Il rapporto mostra una significativa riduzione dose-dipendente della dispersione cellulare e dei livelli di espressione dei marcatori apoptotici. Bifidobacterium EPS ha protetto le cellule dalla morte cellulare per apoptosi modulando le vie di segnalazione apoptotica sia intrinseca che estrinseca 82. I nostri risultati, in accordo con i risultati precedenti, indicano che l'EPS galattano protegge i mutanti deficienti del gene anti-apoptotico del lievito pep4∆ e fs1∆ dallo stress apoptotico indotto da H2O2.

Galactan estende CLS di S. cerevisiae.

Per valutare l'attività anti-invecchiamento del galattano abbiamo eseguito un saggio CLS con mutanti WT e lievito (sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆) con trattamento con galattano. SOD2 è una SOD di manganese, localizzata nella matrice mitocondriale. La delezione di SOD2 rende le cellule altamente sensibili allo stress ossidativo e ad un alto tasso di mutazione perché il mtDNA è più accessibile ai ROS generati nei mitocondri83 ed è uno dei geni associati alla durata della vita cronologica del lievito. TSA1 è una tioredossina perossidasi (antiossidante tiolico specifico) che è associata sia al citoplasma che al ribosoma. TSA1 è coinvolto nel conferire la resistenza della cellula allo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno ed è noto che la mancanza di TSA1 influisce sulla durata della vita delle cellule di lievito. Un altro mutante antiossidante ctt1∆ utilizzato nell'esperimento CLS manca di CTT1, la catalasi citosolica coinvolta nella disintossicazione del perossido di idrogeno.

La Figura 6 mostra l'effetto del galattano sulla CLS dei ceppi mutanti di lievito privi di geni antiossidanti. Mentre le cellule WT trattate con Galactan EPS hanno mostrato un aumento della vitalità di circa il 10%, sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆ hanno mostrato un aumento della vitalità del 15-20% (Fig. 6). I ROS mitocondriali portano alla senescenza e al danno del DNA nucleare e la SOD2 è coinvolta nell'eliminazione dell'accumulo di ROS nei mitocondri. TSA1 e CTT1 sono coinvolti nella disintossicazione del perossido accumulato nel citoplasma che è significativamente più alto nelle cellule che invecchiano. I nostri risultati del test CLS indicano che l'EPS elimina l'accumulo di ROS mitocondriale e citoplasmatico, previene la senescenza o le caratteristiche simili alla morte cellulare ed estende il CLS nelle cellule di lievito prive di SOD2, TSA1 e CTT154 .

Lo stress ossidativo cellulare è strettamente associato al processo di invecchiamento e influenza notevolmente l'insorgenza di diverse malattie umane associate all'età comediabete, malattia cardiovascolares,disturbi neurodegenerativie tumori. Lo stress ossidativo e l'infiammazione sono due eventi interconnessi che svolgono un ruolo importante nella patologia di molte malattie croniche. Rapporti recenti suggeriscono uno stretto legame tra l'effetto del microbiota intestinale su questi disturbi legati all'età. Il microbioma intestinale protegge il rivestimento epiteliale intestinale dal danno cellulare indotto dalle vie infiammatorie indotte dallo stress ossidativo. Il microbiota intestinale complesso interagisce con i ROS e il sistema di difesa antiossidante, aiutando a eliminare i radicali liberi e prevenendo l'infiammazione. e può anche regolare lo stato ossidativo del sistema nervoso centrale attraverso la produzione di neurotrasmettitori come GABA, dopamina e serotonina. Il microbioma ha anche attività immunomodulatoria, previene l'estesa colonizzazione di microbi patogeni e fornisce immunità contro molte infezioni microbiche83. Molti polisaccaridi microbici sono stati testati in diversi modelli e riportati per avere un elevato potenziale antiossidante, attività antinfiammatoria e funzioni protettive cellulari evidenziate modulando i rispettivi livelli di biomarcatori mediati da questi esopolisaccaridi82,84. È stato scoperto che queste molecole hanno un effetto neuroprotettivo prevenendo le placche amiloidi e la morte neuronale nei modelli sperimentali della malattia di Alzheimer. Inoltre, alcuni di essi hanno dimostrato di migliorare l'attività della SOD, ridurre i livelli di marcatori neurotossici e inibire la morte dei neuroni dopaminergici nei modelli sperimentali della malattia di Parkinson.

ILprocesso d'invecchiamentoè caratterizzato da un elevato ossidativo cellulare che porta a un aumento dell'accumulo di danni al DNA, a un tasso di mutazione elevato e a una diminuzione della vitalità cellulare. È stato precedentemente dimostrato che il ROS induce la morte cellulare per apoptosi nelle cellule di lievito che invecchiano cronologicamente e l'integrazione delle cellule con i composti naturali può aumentare la longevità delle cellule che invecchiano47,85. I nostri risultati sull'effetto antietà esercitato dall'EPS galattano di W. confusa, sul lievito sod2∆, tsa1∆ e ctt1∆ mostrano che l'EPS galattano protegge le cellule di lievito da ROS e apoptosi indotte dall'invecchiamento e ne aumenta la vitalità. Gli omologhi umani di questi geni sono implicati nel fornire protezione contro le malattie neurodegenerative ei tumori legati all'età. I nostri risultati suggeriscono che l'integrazione di EPS galattano può salvare le cellule prive di questi geni di difesa antiossidante dalla morte cellulare correlata all'età e ridurre il rischio di sviluppare malattie legate all'età.

Conclusione

Lo stress ossidativoè una causa di molti processi sfavorevoli all'interno delle cellule che portano a varie malattie e disturbi. Galactan da W. confusa KR780676 Weissella confusa KR780676 esibiva pronunciatoproprietà antiossidantisia in studi in vitro che in vivo. Questo studio ha mostrato chiaramente che il galattano proteggeva i mutanti antiossidanti del lievito dallo stress ossidativo extracellulare. Galactan ha anche protetto le cellule mutanti carenti di anti-apoptotico dallo stress apoptotico mediato dall'ossidazione, come evidenziato dalla ridotta frammentazione nucleare. Galactan ha ridotto i livelli di ROS estendendo la loro aspettativa di vita e proteggendo le cellule dallo stress ossidativo. Nel complesso, i risultati dimostrano che il galattano ha la capacità di alleviare lo stress ossidativo nel mezzo eliminando i radicali liberi. Sarebbe interessante testare il potenziale antiossidante e anti-invecchiamento del galattano in modelli di cellule eucariotiche superiori come linee cellulari di mammiferi e modelli animali. Al galactan è attribuita una forte attività prebiotica e l'attività antiossidante può svolgere un ruolo significativo nella riduzione dello stress ossidativo nell'intestino oltre a mantenere l'omeostasi intestinale. Con varie proprietà tecnologiche attribuite al galactano come forti proprietà emulsionanti, troverebbe un'immensa applicazione nell'industria alimentare e farmaceutica come ingrediente funzionale naturale.

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