Rapalogs e inibitori MTOR come terapie antietà

La rapamicina, un inibitore del bersaglio meccanicistico della rapamicina (mTOR), ha il più forte supporto sperimentale fino ad oggi comepotenziale terapeutico antietànei mammiferi. A differenza di molti altri composti che si ritiene influenzino la longevità, la rapamicina è stata ripetutamente testata su topi geneticamente eterogenei e longevi, nei quali estende sia la durata media che quella massima. Tuttavia, il meccanismo che spiega questi effetti è tutt'altro che chiaro e un elenco crescente di effetti collaterali fa dubitare che la rapamicina possa in definitiva essere benefica per gli esseri umani. Questa recensione discute le prospettive per lo sviluppo di nuovi, più sicuriterapie antietàbasato su analoghi della rapamicina (denominati rapalogs) o altri approcci mirati alla segnalazione mTOR.

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Breve storia della rapamicina e bersaglio meccanicistico della rapamicina La rapamicina è stata scoperta nel suolo dell'Isola di Pasqua come un composto prodotto da Streptomyces hygroscopicus che era in grado di inibire la proliferazione del lievito Candida albicans ma non ha influenzato la crescita dei batteri (1). Nei mammiferi, è stato riscontrato che la rapamicina inibisce la risposta immunitaria ed è stata successivamente adottata come terapia standard per prevenire il rigetto del trapianto nei riceventi di trapianto e per trattare le malattie autoimmuni (2, 3). La rapamicina inoltre inibisce ampiamente la crescita e la proliferazione delle cellule dei mammiferi, stimolando un interesse più recente per il suo utilizzo come terapia del cancro (4). Meccanicisticamente, la rapamicina lega FKBP12, un'immunofilina con attività di prolil isomerasi. Due ulteriori proteine ​​necessarie per i suoi effetti nel lievito sono state identificate in uno screening genetico nel 1991 e definite bersagli della rapamicina 1 (TOR1) e TOR2 (5). Durante il 1994 e il 1995, tre gruppi separati hanno isolato una chinasi 289-kDa che è legata e inibita dal complesso rapamicina-FKBP12 nelle cellule di mammifero (6–8). Questa chinasi è ora nota come bersaglio meccanicistico della rapamicina (mTOR) ed è omologa per circa il 40% alle proteine ​​TOR di Saccharomyces cerevisiae ed è altamente conservata tra gli eucarioti. mTOR si trova in due complessi che hanno funzioni distinte e diverse sensibilità all'azione della rapamicina. Il complesso mTOR 1 (mTORC1; costituito da mTOR, raptor, mLST8/GL, PRAS40, DEPTOR) svolge un ruolo chiave nella regolazione della traduzione e della crescita cellulare attraverso la fosforilazione di substrati che includono la chinasi S6 (S6K) e la proteina legante il fattore di iniziazione eucariotica eIF4E (4E-BP), ed è potentemente inibito dalla rapamicina. Al contrario, mTORC2 (costituito da mTOR, Rictor, mLST8/GL, mSIN1, pro tor, DEPTOR) regola un insieme diversificato di substrati, tra cui AKT S473, chinasi regolata da siero/glucocorticoidi e PKC-, ed è acutamente resistente alla rapamicina, sebbene possa subire danni fisici durante l'esposizione cronica. Gli mTORC ricevono input attraverso un'ampia varietà di meccanismi di segnalazione e hanno ruoli in molti aspetti della fisiologia, che sono stati esaminati in profondità (9). In breve, mTORC1 risponde a segnali che includono amminoacidi, glucosio, ligandi WNT, ossigeno, cAMP e insulina/IGF-1. La regolazione dell'attività di mTORC2 è meno chiara ma può comportare l'interazione con i ribosomi (10). La segnalazione di insulina/IGF-1 a mTORC1 è mediata in parte da mTORC2 tramite la fosforilazione di AKT. A sua volta, l'attivazione di mTORC1 restituisce un feedback per attenuare la segnalazione di insulina/IGF-1 tramite S6K1 e GRB10 (Figura 1 e rif. 11).

Collegamento della segnalazione mTOR all'età Un ruolo della segnalazione TOR nell'invecchiamento è stato rivelato per la prima volta nel 2003, quando Vellai e colleghi hanno dimostrato che l'RNAi contro let-363/CeTor ha esteso significativamente la durata della vita di Caenorhabditis elegans e ha funzionato indipendentemente da daf{{2} }, un omolog FOXO che in precedenza aveva dimostrato di influenzare la durata della vita (12). Ciò è stato rapidamente seguito dalla dimostrazione che l'inibizione genetica della segnalazione TOR estende la durata della vita in Drosophila melanogaster e nel lievito in erba S. cerevisiae (13, 14). L'inibizione genetica della segnalazione mTOR nei mammiferi è una questione delicata, poiché la proteina chinasi mTOR, raptor, rictor e mLST8 sono tutti essenziali per lo sviluppo (15). Recentemente, abbiamo dimostrato che i topi femmina Mtor plus /–Mlst8 plus /– hanno una ridotta attività di mTORC1 e una maggiore longevità, simile al fenotipo riportato da Sel man e colleghi per i topi privi di S6K1, uno dei principali substrati di mTORC1 (16, 17 ). Pertanto, il legame tra segnalazione mTOR e longevità sembra essere conservato dal lievito ai mammiferi (Tabella 1).

Effetti della rapamicina sulla longevità

La rapamicina prolunga la durata della vita di lieviti, vermi e mosche (Tabella 2 e rif. 18-21). Nel 2009, la rapamicina ha dimostrato di estendere sia la durata media che quella massima di topi geneticamente eterogenei maschi e femmine (figli di un incrocio a quattro vie tra ceppi consanguinei di lunga durata) (22). Sorprendentemente, il trattamento non è stato avviato fino a quando i topi non hanno raggiunto un'età avanzata (20 mesi), approssimativamente equivalente a un'età umana di 60 anni. In uno studio di follow-up iniziato a 9 mesi di età, la rapamicina ha esteso la durata media della vita nei maschi e nelle femmine rispettivamente del 10% e del 18% e la durata massima della vita del 16% e del 13% (23). La rapamicina è stata microincapsulata in un rivestimento enterico che ha consentito la somministrazione nel cibo durante questi studi e il livello ematico raggiunto è stato di circa tre volte superiore al range terapeutico tipico per l'immunosoppressione nell'uomo (24).

Figura 1 segnalazione mTOR. mTOR si trova in due complessi, mTORC1 e mTORC2. mTORC1 è regolato in parte tramite il complesso TSC, che normalmente agisce come una proteina che attiva la GTPasi per Rheb per sopprimere la segnalazione di mTORC1. mTORC1 è anche regolato dagli amminoacidi tramite la famiglia di piccoli GTPasi legati a Ras (Rag) di legame GTP. Le proteine ​​Rag attivano mTORC1 localizzando mTORC1 nel lisosoma attraverso l'interazione con il complesso regolatore (110). mTORC1 promuove la crescita migliorando la biogenesi ribosomiale, la traduzione e altri processi anabolici mentre inibisce l'autofagia. mTORC1 sopprime la segnalazione di insulina/IGF-1 attraverso la regolazione diretta di Grb10 e S6K, che successivamente riduce la segnalazione a mTORC2. AKT, un inibitore di TSC1/2, è uno dei numerosi substrati diretti di mTORC2. I processi sovraregolati dalla segnalazione mTOR sono mostrati in rosso; quelli che sono sottoregolati dalla segnalazione mTOR sono mostrati in blu.

Altri studi hanno anche riscontrato un effetto positivo della rapamicina sulla durata della vita. Chen et al. trovato che la rapamicinadiminuito il tasso di mortalità nei maschi anzianitopi C57BL/6 (25). Anisimov et al. hanno dimostrato che la rapamicina estende la durata massima della vita (durata media della vita dell'ultimo 10 percento sopravvissuto) in un ceppo di topi a vita breve, incline al tumore (FVB/N HER-2/neu transgenici) (26). Sebbene questo studio fornisca una forte evidenza che la rapamicina può essere utile nel contesto del cancro, la scelta del ceppo rende difficile separare gli effetti antitumorali dall'invecchiamento in sé. Tuttavia, la rapamicina prolunga anche la durata della vita nei topi 129/Sv, un ceppo consanguineo con una durata della vita e un'incidenza tumorale più tipiche (27). Sorprendentemente, il 22,9% dei topi trattati è rimasto vivo alla morte dell'ultimo animale di controllo.

Nel loro insieme, queste osservazioni rendono la rapamicina il candidato meglio supportato per un farmaco per la longevità dei mammiferi. La comprensione del suo meccanismo d'azione ha il potenziale per offrire informazioni sulla natura del processo di invecchiamento sottostante e può portare a nuovi approcci terapeutici per alleviare il peso delle malattie legate all'età. Tuttavia, il meccanismo che spiega gli effetti anti-invecchiamento della rapamicina non è ancora chiaro (Tabella 2).

Potenziali meccanismi di estensione della durata della vita da parte della rapamicina

Effetti antitumorali. Il cancro è la causa più comune di morte per i topi da laboratorio e la rapamicina è un farmaco antitumorale. Pertanto, rimane possibile che l'estensione della durata della vita da parte della rapamicina sia secondaria alla soppressione del tumore e non correlata al processo di invecchiamento sottostante. Ci sono diversi motivi per cui non favoriamo questo modello. In primo luogo, gli esperimenti iniziali che collegavano la rapamicina e l'inibizione di mTOR alla longevità sono stati eseguiti in organismi che sono principalmente postmitotici (vermi e mosche) o unicellulari (lievito) e quindi non soffrono di cancro. In secondo luogo, la rapamicina aumenta la massima longevità, fornendo supporto all'idea che rallenti molteplici patologie legate all'età. Prendere di mira una singola malattia non dovrebbe aumentare sostanzialmente la durata della vita degli individui più longevi di un gruppo, poiché gli individui più anziani saranno a rischio molto elevato per la maggior parte o tutte le cause di morte, a meno che il processo di invecchiamento sottostante non sia stato posticipato. In terzo luogo, è stato dimostrato che la rapamicina ritarda diversi cambiamenti legati all'età nei topi, tra cui perdita della funzione delle cellule staminali (25), declino cognitivo (28), retinopatia (29), accumulo di alterazioni subcellulari nel miocardio, degenerazione epatica, iperplasia endometriale , irrigidimento dei tendini e declino dell'attività fisica (30). Inoltre, la rapamicina è terapeutica nei modelli di roditori di ipertrofia cardiaca (31, 32) e malattie neurodegenerative (33-35), condizioni che colpiscono l'invecchiamento dell'uomo. Sebbene la prevenzione del cancro svolga chiaramente un ruolo importante nel beneficio di sopravvivenza conferito dalla rapamicina, è importante comprendere che il cancro è una malattia legata all'età e la sua prevenzione è una conseguenza prevista di qualsiasi terapia che rallenti l'invecchiamento

Traduzione. mTORC1, tramite S6K e 4E-BP, svolge un ruolo centrale nella regolazione della traduzione e vale la pena considerare se la ridotta sintesi proteica di per sé possa mediare gli effetti della rapamicina sulla longevità. Ad esempio, la riduzione del tasso complessivo di traduzione potrebbe consentire una migliore fedeltà durante la sintesi e/o alleviare lo stress sui meccanismi che degradano le proteine ​​errate, mal ripiegate o danneggiate (36). In effetti, esperimenti su S. cerevisiae, C. elegans e D. melanogaster hanno dimostrato che la delezione o il knockdown mediato da siRNA delle subunità ribosomiali, S6K o fattori di inizio della traduzione si traducono in un aumento della durata della vita e la delezione di S6K1 estende la durata della vita nei topi femmina, mentre la delezione 4E-BP blocca gli effetti di prolungamento della vita della restrizione calorica (CR) nelle mosche (13, 37-40).

Scoperte recenti sfidano l'idea che la traduzione di per sé sia ​​la chiave per i vantaggi dell'inibizione TOR/mTOR. Mentre i topi femmina privi di S6K1 hanno una durata di vita prolungata, non vi è alcun effetto riconoscibile sulla traduzione complessiva, almeno nel muscolo scheletrico (41). Inoltre, la lunga durata della vita dei worm privi di un fattore chiave di inizio della traduzione può essere ulteriormente aumentata dalla delezione di TOR, il che implica che sono in gioco meccanismi distinti (38). Inoltre, l'estensione della durata della vita dovuta alla cancellazione dei fattori di inizio della traduzione dipende da daf-16, mentre l'estensione della durata della vita per deplezione di TOR, S6K o subunità ribosomiali non lo è, indicando ancora una volta il coinvolgimento di molteplici meccanismi distinti (12 , 37). È interessante notare che la riduzione del TOR utilizzando l'RNAi non riesce a prolungare ulteriormente la durata della vita dei vermi mutanti -2, un modello per la CR, nonostante la soppressione del già basso tasso di sintesi proteica di un ulteriore 49% (37). Inoltre, l'inattivazione dell'omologo del verme di AMPK è sufficiente per sopprimere l'estensione della durata della vita negli animali privi di S6K, apparentemente senza influire sulla traduzione (16). Chiaramente, il rapporto tra traduzione e longevità è più complesso di quanto si pensasse inizialmente

La traduzione di specifici mRNA può influenzare la durata della vita.

Mentre la completa perdita della funzione mTOR ha un effetto importante sulla traduzione generale, la rapamicina ha un effetto più sottile, molto probabilmente perché un sottoinsieme delle funzioni di 4E-BP è resistente alla rapamicina (42, 43). Sia la rapamicina che l'inibizione completa di mTOR sopprimono preferenzialmente la traduzione di mRNA con motivi oligopirimidinici terminali 5′, suggerendo un potenziale ruolo di questi geni nella longevità (43, 44). Nonostante la diminuzione della sintesi proteica complessiva, la CR nelle mosche migliora specificamente la traduzione di un sottoinsieme di mRNA che hanno UTR 5 'brevi e meno strutturati, inclusi i geni mitocondriali con codifica nucleare (40). Il substrato TOR 4E-BP è necessario per questo effetto e per l'estensione della durata della vita. Nel lievito privo di subunità ribosomiali o TOR, l'estensione dell'intera durata della vita richiede una maggiore traduzione di un trascritto specifico, GCN4 (45). L'espressione di GCN4 è limitata da più ORF a monte che normalmente sequestrano i ribosomi che si legano all'mRNA. In condizioni di ridotta attività TOR o di grande abbondanza di subunità ribosomiale, gli ORF a monte vengono bypassati più frequentemente per avviare la traduzione dell'ORF GCN4. Questi esempi evidenziano sottigliezze nella regolamentazione della traduzione che stiamo solo iniziando ad apprezzare.

Tabella 2 Effetti della rapamicina sulla longevità

Autofagia. Un altro effetto dell'inibizione di mTOR che è stato collegato alla longevità è l'induzione dell'autofagia, un processo mediante il quale le cellule riciclano le loro proteine ​​e organelli. L'autofagia consente alle cellule di sopravvivere a condizioni limitate dai nutrienti ed è un meccanismo centrale mediante il quale vengono rimossi i componenti danneggiati. In condizioni di sufficienza di nutrienti, mTOR fosforila e inibisce la chinasi ULK1 che avvia l'autofagia (46). L'inattivazione dei geni coinvolti nell'autofagia riduce la durata della vita nel lievito (cronologico), C. elegans e Drosophila, e la promozione dell'autofagia nel sistema nervoso della mosca prolunga la durata della vita (47-49). Inoltre, l'autofagia è necessaria per l'estensione da parte della rapamicina della durata della vita cronologica del lievito (47) e per l'estensione della durata della vita mediante CR o inibizione genetica della segnalazione mTOR nei vermi (50).

Anche nei mammiferi l'autofagia sembra svolgere un ruolo significativo nel processo di invecchiamento. Più drammaticamente, l'induzione dell'autofagia è sufficiente per ringiovanire l'istologia e la funzione del fegato dei topi anziani (51). Inoltre, l'autofagia sembra essere sovraregolata nei topi CR e mediare alcuni degli effetti benefici di una dieta CR su cuore, fegato e reni (52-54). Anche le cellule di topi nani Snell longevi mostrano prove di un aumento dell'autofagia (55).Cardiomiociti isolati da topi anziani hanno un'autofagia inferiore e mostrano difetti nella gestione del calcio, entrambi corretti dall'esposizione alla rapamicina ex vivo (56). Tuttavia, l'aumento dell'autofagia potrebbe non essere sempre vantaggioso e in effetti può contribuire al fenotipo pro-invecchiamento dei topi progeroidi (57).

È interessante notare che la rapamicina migliora il blebbing nucleare e la senescenza prematura nelle cellule derivate da pazienti con progeria di Hutchinson Gilford, una rara sindrome da invecchiamento precoce (58). La malattia deriva da una variante errata della lamina A, chiamata progerina, che si accumula in larga misura nei pazienti ed è anche rilevata in quantità minori durante il normale invecchiamento cellulare (59, 60). Rapamycin sembra stimolare la clearance della progerina dalle cellule malate tramite l'autofagia e quindi può limitare anche il normale accumulo di progerina correlato all'età. Nel complesso, è probabile che l'appropriata regolazione dell'autofagia sia un fattore determinante per un invecchiamento sano.

Figura 2 Il trattamento cronico con rapamicina interrompe mTORC2. (A) In vivo, nutrienti e fattori di crescita guidano l'attività di mTORC1 e mTORC2, che promuovono la crescita, l'invecchiamento e la sensibilità all'insulina. (B) Il trattamento acuto con rapamicina inibisce la segnalazione mTORC1, limitando la crescita e promuovendo la longevità senza ridurre la sensibilità all'insulina. (C) Il trattamento cronico con rapamicina inibisce sia mTORC1 che mTORC2, limitando la crescita e compromettendo la segnalazione dell'insulina, ma promuovendo la longevità

Manutenzione delle cellule staminali. La rapamicina ha una serie di effetti interessanti sulla funzione delle cellule staminali. La segnalazione iperattiva a monte di mTORC1 dovuta alla delezione di Pten, alla delezione della sclerosi tuberosa 1 (Tsc1) o all'attivazione costitutiva di AKT riduce il numero e la capacità funzionale delle HSC (61-63). Il trattamento con rapamicina può ripristinare la normale capacità di autorinnovamento in una sottopopolazione di HSC di topo che presentano spontaneamente un elevato stress ossidativo e una ridotta capacità funzionale (64). Più recentemente, Chen et al. notato che l'attività di mTORC1 è elevata nelle HSC derivate da topi anziani, che mostrano deficit funzionali che ricordano quelli causati dalla delezione di Tsc1 (25). La rapamicina ha ripristinato la capacità funzionale nelle HSC di topi anziani e ha potenziato la risposta immunitaria al virus dell'influenza. La rapamicina aumenta anche l'auto-rinnovamento delle cellule staminali intestinali attraverso l'inibizione di mTORC1 nelle cellule Paneth adiacenti, in modo simile agli effetti osservati negli animali CR (65). Inoltre, la rapamicina migliora la riprogrammazione delle cellule somatiche per generare cellule staminali pluripotenti indotte, suggerendo una promozione generale della funzione delle cellule staminali (66). D'altra parte, la rapamicina compromette la pluripotenza, riduce la proliferazione e promuove la differenziazione nelle cellule staminali embrionali umane (67, 68). Nelle cellule staminali embrionali di topo, l'espressione dei marcatori di pluripotenza è più resistente al trattamento con rapamicina, tuttavia le dimensioni e la proliferazione cellulare sono ancora ridotte e la differenziazione è migliorata (67, 69). Curiosamente, la rapamicina esaurisce le cellule che danno inizio alla leucemia e inibisce sia l'auto-rinnovamento che le capacità di differenziazione delle cellule staminali derivate dall'emangioma infantile, suggerendo un effetto protettivo contro le cellule staminali tumorali (61, 70). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che la rapamicina modula il comportamento delle cellule staminali e generalmente favorisce il mantenimento della "staminalità" e un fenotipo più giovanile nei tipi di cellule staminali adulte che sono state studiate.

in quanto immunosoppressore non dovrebbe essere trascurato quando si tratta di longevità.

cronico,l'infiammazione di basso grado è una caratteristica dell'invecchiamentoe quasi tutte le malattie croniche hanno una componente infiammatoria (71). Una discussione completa degli effetti immunologici della rapamicina esula dallo scopo di questa recensione e l'argomento è stato trattato altrove (72). È importante sottolineare che il farmaco ha effetti sia positivi che negativi sull'immunità innata e adattativa, con un risultato netto più complesso della semplice soppressione immunitaria, come esemplificato dalla sua capacità di migliorare l'immunizzazione dei topi anziani contro il virus dell'influenza (25). meccanismi dipendenti da mTORC2-. Nonostante l'elevata specificità della rapamicina per mTORC1 durante il trattamento acuto, l'esposizione cronica può anche inibire mTORC2. Questo effetto è stato osservato per la prima volta in alcune linee cellulari in coltura (73) e recentemente abbiamo dimostrato che si verifica anche in vivo in più tessuti tra cui fegato, muscolo e adiposo (vedi Figura 2). Al momento non è chiaro se l'inibizione di mTORC2 abbia un ruolo negli effetti di pro-longevità della rapamicina. I topi femmina privi di S6K1 e i topi femmina Mtor plus /–Mlst8 plus /– sono apparentemente longevi a causa della compromissione della segnalazione dipendente da mTORC 1-, ma i dati di C. elegans suggeriscono che anche l'inibizione di mTORC2 può promuovere la longevità ( 21, 74). È interessante notare che l'estensione della durata della vita mediante l'interruzione di mTORC1 nei vermi richiede skin-1 (l'omologo della NRF1/2 dei mammiferi) e daf-16 (l'omologo delle FOXO dei mammiferi), entrambi fattori di trascrizione che controllano i geni coinvolti nella difese dallo stress. L'estensione della durata della vita mediante rapamicina o interruzione di mTORC2, tuttavia, richiede solo SKN-1. Coerentemente con il ruolo delle difese generali da stress nei benefici della rapamicina, sia i vermi che le mosche con funzione TOR compromessa sono resistenti allo stress e l'induzione dei geni bersaglio NRF1/2 e FOXO è stata rilevata nel fegato di topi trattati con rapamicina (2 mg /kg al giorno per due settimane) (20, 21).