Parte 1: Un inibitore di NF-kB e un agonista di AMPK: previsione della rete e integrazione multi-omica per derivare percorsi di segnalazione per l'acteoside contro il morbo di Alzheimer

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1 , Yuan-Yuan Shi2 , Xiao Li Jiang1 , Shan-Shan Wu1 , Ping Zhou1 , Hui-Ying Wang1 , Ping Li1* e Fei Li1,2*

¹ Stato Chiave Laboratorio di Naturale Medicinali, Cina farmaceutico Università, Nanchino, Cina, ² Università di Farmacia,Università medica dello Xinjiang, Urumqi, Cina

INTRODUZIONE

Con l'invecchiamento e la rapida crescita della popolazione, il numero di casi di demenza nel mondo ha mostrato una tendenza al rialzo.Il morbo di Alzheimer(AD) è una comune malattia neurodegenerativa accompagnata da deterioramento cognitivo e discinesia (Perea et al., 2020), che è il tipo più frequente di demenza. È caratterizzato da grave perdita neuronale, placche senili e grovigli neurofibrillari (Shiao et al., 2017). La patogenesi dell'AD(Il morbo di Alzheimer)è multidimensionale e si collega alla neuroinfiammazione. La neuroinfiammazione è guidata dall'attivazione delle cellule gliali, che è strettamente correlata alla comparsa e allo sviluppo dell'AD(Il morbo di Alzheimer)(Hanslik e Ulland, 2020; Linnerbauer e Rothhammer, 2020). Durante la progressione e l'esacerbazione della neuroinfiammazione, la microglia è considerata un fattore chiave.

Le microglia sono le cellule immunitarie primarie nel sistema nervoso centrale, che sono strettamente associate a una cascata di processi come lo sviluppo del cervello, il mantenimento dell'ambiente neurale, nonché le risposte a lesioni e riparazioni (Perea et al., 2020). Inoltre, la microglia può essere stimolata a un fenotipo M1 e aumentare l'espressione di citochine pro-infiammatorie quando malattie neuroinfiammatorie come l'AD(Il morbo di Alzheimer)si verifica (Tsukahara et al., 2020). Gli studi dimostrano anche che la polarizzazione al fenotipo M1 è spesso accompagnata da disturbi metabolici (Li L. et al., 2020), che portano a squilibrio del metabolismo energetico e disfunzione mitocondriale (Agrawal e Jha, 2020). Questi cambiamenti avversi derivano dalla neurodegenerazione, persino dall'AD(Il morbo di Alzheimer).

Atteosidi(ACT), un glicoside feniletanoide, deriva principalmente daCistanche tubulose. Prove crescenti hanno suggerito che l'ACT possiede numerose attività farmacologiche, inclusi effetti neuroprotettivi (Wei et al., 2019), antinfiammatori (Lai et al., 2019) e antiossidanti (Ji et al., 2019). In particolare, è stato dimostrato che l'ACT può migliorare l'apprendimento e il deterioramento della memoria, nonché sovraregolare il metabolismo energetico nei ratti indotti da streptozotocina (Chen J. et al., 2020). Inoltre, può anche inibire la morte delle cellule apoptotiche neuronali e il danno mitocondriale nei topi sperimentali con encefalomielite autoimmune (Li W. et al., 2020). Tuttavia, l'effetto dell'ACT sulla polarizzazione M1/M2 della microglia e il suo meccanismo sono raramente riportati. Finora, i meccanismi come la riparazione della funzione dei mitocondri e la regolazione del metabolismo cellulare non sono chiari e sono necessarie ulteriori ricerche scientifiche per chiarire l'esatto meccanismo.

Lo scopo della presente relazione è di indagare l'efficacia terapeutica dell'ACT nonché il meccanismo molecolare sottostante dell'ACT sull'AD(Il morbo di Alzheimer). In questo caso, viene stabilito un metodo sistematico in silico per l'identificazione del target del farmaco basato su database consolidati. Indaghiamo ulteriormente i possibili meccanismi dell'ACT a livello biologico molecolare integrando il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) con il metodo metabolomico e le tecniche di biologia molecolare. La combinazione della strategia di screening sistematico in silico, in vivo e in vitro fornisce un nuovo protocollo per scoprire oggettivamente composti multi-bersaglio della medicina tradizionale cinese.

Cistanche tubulosa può trattareIl morbo di Alzheimer

MATERIALI E METODI

Modellazione di rete

Quattro piattaforme online sono state combinate per prevedere e scoprire gli obiettivi di ACT, vale a dire GeneCards1 , approccio di ensemble di similarità (SEA2 ), SwissTargetPrediction3 e PharmMapper4 . Tutte le associazioni geniche di AD(Il morbo di Alzheimer)sono stati raccolti in modo indipendente da DisGeNET5 e GeneCards. Dopo l'analisi dell'interazione target-target condotta da String database6 , la rete è stata ulteriormente integrata dal software Cytoscape (versione 3.8.2). Le analisi di arricchimento GO e KEGG sono state eseguite sul database DAVID7 per annotare ed estrarre la rete.

Animali e raggruppamento di modelli

In questo studio sono stati scelti pesci zebra di tipo selvatico (ceppo AB, 4 mesi) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 14/10- h a 28°C, seguendo il metodo precedente (Li YQ et al., 2020). Tutti gli esperimenti sui pesci zebra sono stati condotti sotto la supervisione dell'Animal Ethics Committee della China Pharmaceutical University.

Le larve di pesce zebra sono state divise in sei gruppi e trattate da 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) a 7 dpf: gruppo di controllo, gruppo modello, gruppo modello più donepezil cloridrato (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) e gruppo modello più gruppi ACT (purezza HPLC 98 percento, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.). Il gruppo di controllo è stato mantenuto nel mezzo con 0,2 percento di DMSO e il gruppo modello è stato trattato con AlCl3 150 uM (pH 5,8). Il gruppo modello più DPZ è stato co-trattato con AlCl3 e 8 uM DPZ. Il modello più i gruppi ACT sono stati co-trattati con AlCl3 e diverse concentrazioni di ACT (200, 100 e 50 uM).

Analisi comportamentale

I movimenti delle larve di pesce zebra sono stati registrati da un analizzatore comportamentale ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) a 28oC. In breve, i parametri comportamentali e l'elaborazione dei risultati erano coerenti con il metodo che abbiamo stabilito in precedenza (Li YQ et al., 2020). Qui, sono stati selezionati la velocità media (AS), il cambiamento di velocità (AS), il tasso di recupero dalla discinesia (DRR) e l'efficienza della risposta (RE, percentuale ) per valutare il recupero della discinesia nello zebrafish.

Determinazione dell'attività dell'acetilcolinesterasi e della colina acetiltransferasi

Dopo aver trattato da 3 a 7 dpf, sono state raccolte larve di pesce zebra per misurare le attività dell'acetilcolinesterasi (AChE) e della colina acetiltransferasi (ChAT). Sulla base del protocollo del produttore, l'attività è stata rilevata dai kit di test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina).

Colture cellulari e trattamenti

La linea cellulare BV-2 è stata acquistata dall'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Stati Uniti). Sono stati coltivati ​​in DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanchino, Cina). Il mezzo è stato integrato con il 10% di FBS (Gibco, Grand Island, NY, Stati Uniti),

100 U/ml di penicillina e 100 mg/ml di streptomicina, accompagnati dal 95% di aria/5% di CO2 a 37°C. Le cellule BV-2 sono state incubate con ACT (50, 25 e 12,5 uM) o stimolate con lipopolisaccaride (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Stati Uniti) per 24 ore. Le cellule sono state osservate al microscopio invertito (Nikon ECLIPSE Ti2, Giappone).

Test di vitalità cellulare

Il test del kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanchino, Cina) è stato utilizzato per valutare la vitalità cellulare. In breve, l'assorbanza è stata misurata a 450 nm con un lettore di micropiastre (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Stati Uniti).

Saggio di produzione di ossido nitrico

L'ossido nitrico (NO) è stato determinato misurando i livelli di nitrito nel surnatante di coltura BV-2 utilizzando il reagente di Griess. Brevemente, il mezzo (100 ul) è stato trasferito in una nuova 96-piastra a pozzetti, lo stesso volume di reagente di Griess è stato aggiunto a ciascun pozzetto e fatto reagire per 15 minuti al buio. L'assorbimento a 540 nm è stato determinato da un lettore di micropiastre.

Livelli di citochine infiammatorie nel supernatante

Le concentrazioni di TNF-a, IL-1 e IL-10 nel surnatante cellulare BV-2 sono state determinate mediante kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.

Determinazione del metabolismo cellulare mediante analisi HPLC-Q-TOF-MS

Le cellule BV-2 sono state seminate separatamente in un piatto a sei pozzetti (n=6/gruppo). Dopo il trattamento, il mezzo è stato rimosso e le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo. Sono stati quindi immediatamente esposti all'azoto liquido per sopprimere il metabolismo cellulare. Le cellule sono state raccolte con l'80% di metanolo freddo. Per facilitare la precipitazione delle proteine, le cellule sono state vigorosamente agitate su vortice per 1 minuto e centrifugate a 13,000 rpm (15 min, 4oC). La sospensione cellulare è stata essiccata sotto un flusso di azoto. Il residuo essiccato è stato ricostituito in 150 ul di acetonitrile al 25% preraffreddato. Al fine di garantire la stabilità e l'accuratezza dell'analisi della sequenza, ciascun campione cellulare con lo stesso volume (10 ul) è stato combinato come campioni di controllo di qualità. Durante il rilevamento dei metaboliti, questi campioni sono stati iniettati ogni sei campioni per confermarne la stabilità. È stata iniettata un'aliquota 1-ul per HPLC-Q-TOF-MS.

L'analisi è stata eseguita su un sistema HPLC Agilent 1290

connesso con lo spettrometro di massa Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Stati Uniti). La separazione è stata effettuata su una colonna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min 100 mm, 1,7 um). La fase mobile era composta per lo 0,1% da acido formico-acqua (v/v; A) e acetonitrile (B).

La velocità di flusso è stata fissata a {{0}},4 ml/min con la seguente condizione di eluizione del gradiente ottimale: da 0 a 2 min, 5% B; da 2 a 20 min, dal 5 al 95 percento B (modalità ioni positivi); da 0 a 2 minuti, 5 percento B; Da 2 a 20 min, dal 5 al 95 percento B (modalità ioni negativi). I parametri di funzionamento dello spettrometro di massa sono stati impostati come segue: temperatura del gas, 320oC; gas essiccante, 10 L/min; nebulizzatore, 35 psi; VCap, 4,{20}} V; frammentatore, 120 V.

i dati sono stati condotti con MetaboAnalyst8. In combinazione con la letteratura, i metaboliti differenziali (VIP > 1, t-test p < 0.05)="" sono="" stati="" identificati="" su="" hmdb9.="" infine,="" l'analisi="" del="" percorso="" è="" stata="" condotta="" con="">

Misurazione del potenziale della membrana mitocondriale

Il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) è stato rilevato utilizzando la sonda fluorescente JC-1 (Beyotime, Cina) secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule di diversi gruppi sono state risciacquate con PBS e incubate con una soluzione colorante JC-1 per 20 minuti a 37°C. Dopo la colorazione, le cellule sono state lavate due volte utilizzando un tampone di colorazione. Quindi, i segnali fluorescenti sono stati rilevati mediante citometria a flusso (BD Accuri C6).

Misurazione dell'adenosina 5f-trifosfato mitocondriale

La concentrazione di adenosina 5/-trifosfato (ATP) nei mitocondri è stata rilevata da un kit di analisi dell'ATP (Beyotime, Cina). In breve, il mezzo di coltura delle cellule BV-2 di diversi gruppi è stato scartato e le cellule sono state omogeneizzate con tampone di lisi su ghiaccio. Il supernatante ottenuto dopo centrifugazione (12,000 g,

5 min) è stato utilizzato per determinare la concentrazione di ATP. La luminescenza è stata rilevata da EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Gestione di(Il morbo di Alzheimer)

Misurazione del livello di specie reattive dell'ossigeno intracellulare

Il kit di analisi delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) (Beyotime, Cina) è stato utilizzato per misurare il livello di ROS. Le cellule di diversi gruppi sono state incubate con DCFH-DA (10 uM) per 20 minuti a 37oC. Dopo il caricamento della sonda, le cellule sono state lavate tre volte con DMEM. Quindi, i segnali fluorescenti sono stati rilevati mediante citometria a flusso (BD Accuri C6).

Microscopia elettronica a trasmissione

Le cellule BV-2 sono state seminate in un piatto a sei pozzetti. Il mezzo è stato rimosso e 1 mi di glutaraldeide al 2,5% è stato rapidamente aggiunto a ciascun pozzetto. Quindi, le cellule sono state raccolte e fissate con nuova glutaraldeide al 2,5% a 4oC durante la notte. Dopo la fissazione, la disidratazione e l'inclusione, le cellule sono state osservate con un microscopio elettronico a trasmissione HT7800 (Hitachi, Tokyo, Giappone).

RNA-Seq e analisi dei dati bioinformatici

L'RNA totale dalle cellule BV{{{10}}}} è stato estratto utilizzando il reagente Trizol (Vazyme Biotech, Cina). Tutti i campioni analitici sono stati inviati a Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) per il test della sequenza dell'RNA. I dati sono stati analizzati sulla piattaforma online di Majorbio Cloud Platform10 . RSEM11 è stato utilizzato per quantificare le abbondanze geniche. Essenzialmente, espressione differenziale I dati grezzi sono stati gestiti con il software MassHunter Workstation versione B.07.{5}} (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Stati Uniti). I dati grezzi sono stati pre-elaborati dalla piattaforma XCMS. L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) dell'analisi normalizzata è stata eseguita utilizzando DESeq2/DEGseq/EdgeR con valore Q 0,05; GRADI con|log2FC| > 1 e valore Q 0,05 (DESeq2 o EdgeR)/valore Q 0,001 (DEGseq) sono stati considerati geni espressi significativamente diversi. Inoltre, è stata eseguita l'analisi dell'arricchimento funzionale, inclusi GO e KEGG, per identificare quali DEG erano significativamente arricchiti in termini di GO e percorsi con p-value corretto da Bonferroni 0,05 rispetto al background dell'intero trascrittoma. I dati della sequenza originale sono stati inviati al database dell'archivio di lettura sequenza NCBI.

Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale

L'RNA totale delle cellule BV-2 è stato raccolto utilizzando il reagente di isolamento RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Cina) e la reazione di trascrizione inversa è stata condotta con FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Cina). Le reazioni sono state eseguite secondo il protocollo del produttore. Il cDNA è stato sottoposto a saggi quantitativi in ​​tempo reale di reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) con primer specifici e TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Cina). I primer sono elencati nella Tabella Supplementare 1 e -actina è stata utilizzata come controllo interno. Per l'analisi quantitativa è stato utilizzato il metodo 2-AA CT.

Analisi Western Blot

Le cellule BV-2 sono state lisate dal tampone di lisi RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanchino, Cina) contenente l'1% di cocktail di inibitori della proteasi (Thermo Fisher) per ottenere proteine ​​totali. Le proteine ​​sono state separate dal 10% di SDS-PAGE e trasferite su membrane NC. Dopo il blocco con il 5% di latte scremato/BSA, le membrane sono state incubate con AMPKa (Proteintech), p-AMPKa (Affinity Biosciences), PGC-1a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF- anticorpi kB (ABclonal) o GAPDH (ABclonal) nel 5% di TBST a 4oC durante la notte. Le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (ABclonale) a temperatura ambiente per 1 ora. Per la visualizzazione e la quantificazione sono stati utilizzati il ​​substrato di Western blotting ECL ad alto segno (Tanon, Cina), il sistema di imaging Gel (Tanon, Cina) e il software ImageJ.

Docking molecolare

L'analisi dell'aggancio molecolare è stata eseguita utilizzando il software Autodock (versione 4.2). L'affinità tra ACT e proteine ​​è stata osservata dal software AutodockTools. Le strutture proteiche tridimensionali (3D) di AMPKa (ID PDB: 5g5j) e NF-kB (ID PDB: 4q3j) sono state recuperate dalla Protein Data Bank12.

Analisi statistica

Tutti i dati sono espressi come deviazione standard media e analizzati dal software GraphPad Prism (versione 8.0.1). Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. p < 0.05="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="">

Integratore Cistanche per il morbo di Alzheimer

RISULTATI

ACT-AD prende di mira la rete di interazione e la previsione del percorso

Attraverso il consolidamento di più database sono stati acquisiti 253 target di ACT, mentre sono stati raccolti un totale di 1.697 target relativi ad AD. Dopo la mappatura della rete target, un totale di 70 target sono stati assorbiti nella rete di interazione target ACT-AD (Figura 1A). L'analisi dell'arricchimento KEGG implicava che ACT potrebbe avere un effetto ad ampio spettro e target multiplo (Figura 1B). Ha anche suggerito che l'ACT ha più percorsi, punti target ed elementi in AD(Il morbo di Alzheimer)trattamento. Classificare questi percorsi per ottenere un'interpretazione accurata dei meccanismi. L'ACT potrebbe essere principalmente correlato alla trasduzione del segnale, al sistema endocrino, al sistema immunitario e alla crescita e morte cellulare per svolgere un ruolo di confronto contro l'AD(Il morbo di Alzheimer)(Figura 1C). Vale la pena notare che la stragrande maggioranza di queste vie è correlata alla reazione infiammatoria. Si ipotizza che l'azione antinfiammatoria di ACT possa essere una parte inestricabile del suo ruolo di confronto contro l'AD(Il morbo di Alzheimer).

ACT ha alleviato la discinesia e migliorato la funzione del sistema colinergico nell'AD(Il morbo di Alzheimer)Larve di pesce zebra

Per verificare il modello di rete, l'AD indotto da AlCl3-(Il morbo di Alzheimer)modello in larve di pesce zebra è stato utilizzato per dimostrare l'effetto di ACT. È stato osservato il movimento delle larve di pesce zebra all'interno di cicli luce/buio e sono state registrate le loro tracce di nuoto (Figura 1D). I risultati hanno mostrato che l'ACT aumentava efficacemente l'AS e l'AS del pesce zebra e l'effetto sinergico aumentava con l'aumento delle dosi (Figura 1E). DRR e RE hanno scoperto un confronto più intuitivo di ACT e DPZ (Figura 1F). Di conseguenza, ACT ha alleviato la discinesia, esibendo effetti simili a DPZ.

È generalmente accettato che il sistema colinergico svolga un ruolo importante nei processi di apprendimento e memoria. Pertanto, le attività di AChE e ChAT sono state utilizzate per rivelare l'effetto di ACT. L'esposizione ad AlCl3 nel pesce zebra è stata resa con alterazione colinergica cerebrale (Figura 1G). Era significativo che il trattamento con ACT sopprimesse l'attività di AChE. Inoltre, l'attività di ChAT ha mostrato una diminuzione dopo il trattamento con ACT. Pertanto, ACT ha mostrato un profondo impatto sull'AD indotto da AlCl3-(Il morbo di Alzheimer)larve di pesce zebra.

ACT ha soppresso la polarizzazione M1 e ha promosso la polarizzazione M2 in cellule BV-2 indotte da LPS

Per confermare ulteriormente la rete, l'effetto antinfiammatorio di ACT è stato studiato in vitro utilizzando cellule microgliali BV-2. Dopo il trattamento con LPS per 24 ore, la vitalità delle cellule BV-2 è diminuita significativamente. Fortunatamente, ACT ha aumentato la vitalità cellulare delle cellule BV-2 indotte da LPS (Figura 2A). Inoltre, è stata osservata la morfologia delle cellule BV-2. Dopo 24 ore di stimolazione LPS, ha mostrato che le cellule BV-2 hanno subito uno stato di polarizzazione M1. I cambiamenti morfologici sono stati prevenuti dal co-trattamento ACT (Figura 2B).

Inoltre, i risultati hanno indicato che, a differenza delle cellule BV-2 stimolate da LPS, le cellule BV-2 co-trattate con ACT hanno significativamente soppresso TNF-a, IL-1 e NO (Figura 2C) espressioni nel surnatante cellulare. Queste sono citochine proinfiammatorie classiche come indicatori della polarizzazione della microglia M1. Analogamente ai risultati dell'ELISA, i risultati della qPCR hanno scoperto che il TNF-a, l'ossido nitrico sintasi (iNOS),

Le espressioni dell'mRNA di IL-1 e CD86 sono state significativamente inibite dal trattamento con ACT rispetto al gruppo LPS (Figura 2D).

Inoltre, abbiamo misurato il livello di polarizzazione della microglia M2 mediante ELISA (Figura 2C) e qPCR (Figura 2E) e i risultati hanno indicato che ACT ha aumentato significativamente i livelli di espressione dei marcatori correlati alla microglia M2 (IL-10, CD206, TGF- e Argomento-1). In una parola, questi risultati hanno mostrato che l'ACT ha soppresso la polarizzazione della microglia M1 e ha promosso il fenotipo M2.

Polarizzazione M1/M2 regolata dall'ACT tramite l'inibizione del percorso NF-kB

L'analisi trascrittomica è stata eseguita da RNA-seq per esplorare il meccanismo di ACT nelle cellule BV-2 da un livello generale. PCA ha illustrato che i gruppi di controllo, LPS e ACT potrebbero essere ben distinti (Figura 3A). Ha rivelato 899 geni espressi in modo differenziale (DEG) tra il gruppo di controllo e il gruppo LPS e 49 DEG tra il gruppo LPS e ACT

gruppo (Figura 3B). Coerentemente, l'analisi di arricchimento GO (Figura 3C) e KEGG (Figura 3D) ha scoperto che l'effetto di ACT era coinvolto nel percorso NF-kB. L'insieme dei geni associati alla via NF-kB è stato ulteriormente confermato e la loro omeostasi è stata sicuramente influenzata da LPS. Come previsto, ACT ha influenzato significativamente le loro espressioni (Figura 3E).

La via NF-kB è una via classica per regolare la progressione dell'infiammazione, con conseguente rilascio di fattori pro-infiammatori. Per ottenere il supporto meccanicistico, la proteina chiave del percorso NF-kB è stata valutata mediante Western blot. La stimolazione LPS ha portato all'attivazione di NF-kB, associata alla promozione della polarizzazione M1. Coerentemente con l'analisi RNA-seq, ACT ha inibito la fosforilazione NF-kB stimolata da LPS (Figura 3F). Pertanto, ACT può alleviare la polarizzazione M1 indotta da LPS tramite il percorso NF-kB nelle cellule BV-2.

ACT alterata la biosintesi dell'arginina, nonché la biosintesi del pantotenato e del CoA

La previsione di rete di ACT ha rivelato che era correlata al metabolismo dell'arginina (Arg) e della prolina (Figura 1B). RNA-seq ha dimostrato che i percorsi interessati da ACT includevano anche la biosintesi dell'Arg, nonché la biosintesi del pantotenato e del CoA (Figura 3D). È stato suggerito che i disturbi del metabolismo delle cellule BV-2 indotti dalla stimolazione LPS siano associati alla polarizzazione M1 (Orihuela et al., 2016). Così,

Il metaboloma cellulare non mirato mediante HPLC-Q-TOF-MS è stato utilizzato per identificare l'effetto di ACT sul metabolismo cellulare. PCA e PLS-DA (Figura 3G) hanno illustrato che i gruppi di controllo, LPS e ACT potrebbero essere ben distinti in base ai metaboliti intracellulari. I livelli di vari metaboliti nelle cellule BV-2 indotte da LPS sono stati modificati dopo il trattamento con ACT (Figura 3H). Rispetto al gruppo di controllo, c'erano 11 metaboliti che cambiavano significativamente nel gruppo LPS (Tabella Supplementare 2), mentre 14 metaboliti erano nettamente alterati dopo il trattamento di ACT (Tabella Supplementare 3), coinvolgendo 11 vie metaboliche (Figura 3I). L'effetto di ACT consisteva principalmente nella regolazione del metabolismo degli aminoacidi, del metabolismo dei nucleotidi, del metabolismo energetico e del metabolismo dei cofattori e delle vitamine. È interessante notare che le vie metaboliche ottenute dal metaboloma erano coerenti con la previsione della rete e l'RNA-seq, inclusa la biosintesi dell'Arg, nonché la biosintesi del pantotenato e del CoA. Quanto sopra ha mostrato che l'ACT potrebbe regolare la biosintesi dell'Arg, nonché la biosintesi del pantotenato e del CoA nelle cellule BV- 2 stimolate da LPS.

Estratto di Cistanche anti-Il morbo di Alzheimer

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