Parte 1: L'echinacoside inibisce il rilascio di glutammato sopprimendo l'ingresso di Ca2 dipendente dalla tensione e la proteina chinasi C nei terminali nervosi cerebrocorticali di ratto

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 e Su Jane Wang 3,*

Astratto:

Il sistema glutamatergico può essere coinvolto negli effetti delle terapie neuroprotettive.Echinacoside, un glicoside feniletanoide estratto dall'erba medicinale cineseHerba Cistanche, ha effetti neuroprotettivi. Questo studio ha studiato gli effetti diechinacosidesul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina nei terminali nervosi cerebrocorticali di ratto (sinaptosomi). L'echinacoside ha inibito il rilascio di glutammato Ca2 più -dipendente, ma non Ca2 più -indipendente, 4-aminopiridina evocato in modo concentrazione-dipendente. L'echinacoside ha anche ridotto l'4-aumento evocato dall'aminopiridina della concentrazione di Ca2 libero citoplasmatico più, ma non ha alterato il potenziale della membrana sinaptosomiale. L'effetto inibitorio dell'echinacoside sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina è stato prevenuto dall'o-conotossina MVIIC, un bloccante ad ampio spettro dei canali Cav2.2 (tipo N) e Cav2.1 (tipo P/Q). , ma era insensibile al Ca2 più gli inibitori del rilascio intracellulari dantrolene e 7-cloro-5-(2-clorofenile)-1,5-diidro-4 ,1-benzodiazepina-2(3H)-one (CGP37157). Inoltre, l'echinacoside ha ridotto la 4-fosforilazione indotta dall'aminopiridina della protein chinasi C e gli inibitori della protein chinasi C hanno abolito l'effetto dell'echinacoside sul rilascio di glutammato. Secondo questi risultati, suggeriamo che l'effetto inibitorio dell'echinacoside sul rilascio evocato di glutammato sia associato a una ridotta entrata di Ca2 più voltaggio-dipendente e alla successiva soppressione dell'attività della protein chinasi C.

Parole chiave:echinacoside; rilascio di glutammato; terminali nervosi cerebrocorticali; canali Ca2 plus dipendenti dalla tensione; proteina chinasi C

1. Introduzione

Echinacosideè un importante glicoside feniletanoide presente inErbaCistanche, una nota medicina tradizionale cinese usata per trattare la dimenticanza, l'impotenza e la stitichezza cronica [1].Echinacosidepossiede varie bioattività come antiossidante, antinfiammatoria, antitumorale, epatoprotettiva e immunomodulazione [2-4]. In particolare, l'echinacoside ha effetti neuroprotettivi; per esempio, può proteggere dallo stress ossidativo o dalla neurotossicità indotta da neurotossine nei neuroni corticali primari del ratto, nelle cellule SH-SY5Y del neuroblastoma umano e nelle cellule del feocromocitoma (PC12) [5–8]. Inoltre, l'echinacoside attenua il danno cerebrale e migliora la funzione cognitiva in modelli animali di morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer e occlusione dell'arteria cerebrale media [9-12]. Tuttavia, il meccanismo attraverso il qualeechinacosideinduce neuroprotezione non è completamente compreso.

La neuroprotezione è un complesso processo di conservazione della struttura e della funzione neuronale in caso di insulti tossici. La riduzione dell'eccitotossicità del glutammato è considerata un potenziale meccanismo coinvolto nella neuroprotezione cerebrale. Il glutammato, un neurotrasmettitore di aminoacidi eccitatori, ha un ruolo cruciale in diverse funzioni cerebrali [13]. Tuttavia, l'iperattivazione dei recettori del glutammato sotto alte concentrazioni di glutammato provoca sovraccarico di Ca2 intracellulare, disfunzione mitocondriale, produzione di radicali liberi e morte neuronale [14,15]. Questo processo patologico è implicato in numerosi disturbi cerebrali tra cui ischemia cerebrale, trauma cranico, epilessia e malattie neurodegenerative [16,17]. Pertanto, gli inibitori che bloccano la trasmissione fisiopatologica glutamatergica sono considerati potenziali farmaci neuroprotettivi. Esempi notevoli di questi sono gli antagonisti del recettore del glutammato [18,19]; tuttavia, gli studi clinici per questi farmaci hanno fallito a causa della minore efficacia e degli effetti collaterali indesiderati o addirittura citotossici [20,21]. Oltre al blocco diretto del recettore del glutammato, l'inibizione del rilascio del glutammato può essere una strategia efficace per la neuroprotezione. Diversi neuroprotettori (p. es., memantina e riluzolo) possono ridurre il rilascio di glutammato nei tessuti cerebrali di ratto [22-24].

Considerando il ruolo del glutammato nell'eccitotossicità e il profilo neuroprotettivo dell'echinacoside, il presente studio ha utilizzato terminali nervosi isolati (sinaptosomi) purificati dalla corteccia cerebrale di ratto per studiare l'effetto dell'echinacoside sul rilascio di glutammato e ha ulteriormente esplorato i potenziali meccanismi. La preparazione del terminale nervoso isolato è un modello consolidato per lo studio della regolazione presinaptica del rilascio di neurotrasmettitori da parte dei farmaci in assenza di effetti postsinaptici [25]. Utilizzando questo modello, abbiamo valutato l'effetto dell'echinacoside sul rilascio di glutammato, sul potenziale di membrana, sull'afflusso presinaptico di Ca2 più e sull'attività della protein chinasi C. Secondo la nostra revisione della letteratura, questo è il primo rapporto che documenta il meccanismo attraverso il quale l'echinacoside inibisce il rilascio endogeno di glutammato a livello presinaptico.

2. Risultati

2.1. EchinacosideInibisce 4-il rilascio di glutammato evocato da aminopiridina dai terminali nervosi cerebrocorticali di ratto riducendo l'esocitosi vescicolare

La Figura 1 illustra l'effetto dipendente dalla concentrazione dell'echinacoside sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina dai sinaptosomi cerebrocorticali di ratto purificati. Nei sinaptosomi incubati con 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopiridina ha evocato un rilascio di glutammato di 7,4 ± {{1{{20}}}},1 nmol/mg/5 min, che è stato ridotto di 1, 5, 10, 30 e 50 uM di echinacoside a 6,5 ​​± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0,1 o 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min, rispettivamente (F(5,24)=67.1, p=0. 000). Il valore IC50 per l'inibizione mediata da echinacoside del 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina, derivato da una curva dose-risposta, era 24 uM. Inoltre, il rilascio di glutammato evocato da 1 mM 4-aminopiridina in una soluzione extracellulare priva di Ca2 contenente 300 uM di glicole etilenico bis(-etere etilico)-N,N,N/,N/-acido tetraacetico (EGTA) era 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),

e questo componente indipendente dal Ca2 più del 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina non è stato influenzato dall'echinacoside 20 uM (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; Figura 1). Nei sinaptosomi trattati con 0.1 uM bafilomicina A1, un inibitore del trasportatore vescicolare [26], 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina è stato ridotto significativamente (2,2 ± 0,2 nmol/mg/ 5 min; FA (2,12)=249.518, p=0.000). In presenza di bafilomicina A1, l'echinacoside 20 uM non è riuscito a inibire significativamente il rilascio di glutammato (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; Figura 1). Al contrario, 10 µM di DL-treo-beta-benzil-ossiaspartato (DL-TBOA, un inibitore della ricaptazione del glutammato) [27], ha aumentato il 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina a 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Anche in presenza di DL-TBOA, l'echinacoside 20 uM ha inibito 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.000; Figura 1).

2.2 L'echinacoside riduce la concentrazione di Ca2 più citosolico ma non altera il potenziale della membrana sinaptosomiale

La depolarizzazione del sinaptosoma causata da 1 mM 4-aminopiridina ha aumentato la concentrazione di Ca2 più (p=0.000; Tabella 1). L'applicazione di 20 uM di echinacoside non ha influenzato significativamente la concentrazione basale di Ca2 più (t(8)=0.06, p=0.95) ma ha ridotto significativamente l'aumento di 4-aminopiridina indotto Ca2 più concentrazione (t(10)=6.16, p=0.000). Inoltre, 1 mM 4-aminopiridina è aumentata in 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina ioduro [DiSC3(5)] fluorescenza (p=0.000). L'aggiunta di 20 uM di echinacoside non ha alterato il potenziale di membrana a riposo (t(8)=0.976, p=0.36) né ha modificato significativamente l'aumento di 4-aminopiridina mediato da DiSC3 (5) fluorescenza (t(8)=-0.014, p=0.99; Tabella 1).

2.3 L'afflusso ridotto di Ca2 più attraverso i canali Cav2.2 (tipo N) e Cav2.1 (tipo P/Q) può essere associato all'inibizione del rilascio di 4- glutammato evocato dall'aminopiridina da parte dell'echinacoside

La Figura 2 mostra che 2 uM di o-conotossina MVIIC, un Ca2 più un bloccante dei canali di tipo N e P/Q, ha ridotto il rilascio di glutammato evocato da 4-aminopiridina da 7,4 ± {{10}}. da 2 a 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). In presenza di o-conotossina MVIIC, l'effetto di 20 uM di echinacoside sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina non era significativo (1.8 2± più 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolene (10 uM), un inibitore del rilascio intracellulare di Ca dall'endoplasma

reticulum [28], ridotto 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, pag=0.000). Tuttavia, in presenza di dantrolene, 20 uM di echinacoside possono comunque inibire significativamente il rilascio di glutammato (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Risultati simili sono stati osservati utilizzando 100 uM di 7-cloro-5-(2-clorofenia)-1,5-diidro-4,1-benzotiazepina -2(3H)-one (CGP37157), un bloccante permeabile alla membrana dello scambio mitocondriale Na più /Ca2 più. Nelle cinque preparazioni sinaptosomiche esaminate, 20 μM di echinacoside combinato con 100 μM di CGP37157 hanno ridotto 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina del 48,3% ± 5,2% (F(2,13) ​​= 136.79, p {{ 49}}.{50}}), simile all'inibizione da parte dell'echinacoside da solo (46,2% ± 2,3%; p=0.89; Figura 2).

2.4 EchinacosideInibisce 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina mediante segnalazione attraverso la proteina chinasi C

Come illustrato nella Figura 3, 10 uM 2-[1-(3-dimetilamminopropil)indolo-3-il]-3-(indolo-3-il) maleimmide (GF109203X), un inibitore generale della proteina chinasi C [29], ha ridotto il 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). Nei sinaptosomi trattati con GF109203X, 20 uM di echinacoside hanno ridotto 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina solo del 5,5% ± 1,8% (p=0,89), meno di quello del solo echinacoside (42,4% ± 2,3 percentuale ; p=0.000). Risultati simili sono stati ottenuti con 5,6,7,{38}}tetraidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3 ,4-c]carbazolo{47}}propanenitrile (Go6976), un selettivo per le isoforme Ca2 più-dipendenti della protein chinasi C ( , I, II, y) [29]. In presenza di 3 μM di Go6976, 20 μM di echinacoside hanno ridotto il rilascio di glutammato dell'11,9% ± 2,9% (p=0.59), indicando una riduzione significativa rispetto a quella del solo echinacoside (42,4% 2,3%; p {{ 65}}.000; Figura 3). Al contrario, la rottlerin 3 uM, un inibitore della protein chinasi C6 indipendente dal Ca2 più [30], non ha alterato significativamente il rilascio di glutammato evocato da 4-aminopiridina (1 mM) (p=0.45). Tuttavia, in presenza di rottlerin, 20 uM di echinacoside hanno effettivamente causato un'inibizione media del 37,1% ± 5,6% del rilascio (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), simile a quello del solo echinacoside (p=0.41; Figura 3). Inoltre, l'inibitore della protein chinasi attivato dal mitogeno 2-(2-ammino-3-metossifenile)-4H-1-benzopirano-4-one) (PD98059 ) (50 μM) e l'inibitore della proteina chinasi A N-[2-(p-bromocinnamilamino)etil]-5-isochinolinesulfonamide (H89) (100 μM) ha ridotto il 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina (p=0.000). Anche in presenza di PD98059 o H89, 20 uM di echinacoside hanno effettivamente ridotto il rilascio (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; Figura 3).

La Figura 4 mostra che 1 mM 4-aminopiridina ha aumentato la fosforilazione della protein chinasi C nei sinaptosomi (t(4)=-6.871, p=0.002). Quando i sinaptosomi sono stati pretrattati con 20 uM di echinacoside per 10 minuti prima dell'aggiunta di 4-aminopiridina, 4-la fosforilazione indotta dall'aminopiridina della proteina chinasi C è diminuita considerevolmente (F(2,6)=29.202 , p=0.001).

2.5 L'inibizione del rilascio di glutammato mediata da echinacoside non coinvolge un recettore dell'acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABAA)

Nella Figura 5, è stato confrontato l'effetto dell'echinacoside sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina in assenza o in presenza di SR95531 (un antagonista del recettore GABAA). Inoltre, 100 μM di SR95531 non hanno alterato significativamente il rilascio di glutammato 4- evocato dall'aminopiridina (1 mM). Nei sinaptosomi trattati con SR95531-, l'applicazione di 20 uM di echinacoside ha determinato un'inibizione del 43% sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), che non era significativamente diverso dall'inibizione prodotta dal solo echinacoside (40 percento; p=0.000). Un risultato simile è stato ottenuto con un altro antagonista del recettore GABAA, la bicucullina (50 uM). Il rilascio misurato in presenza di bicucullina ed echinacoside era significativamente diverso da quello ottenuto in presenza di sola bicucullina (p=0.000).

3. Discussione

In questo studio,echinacoside, un composto attivo in HerbaCistanche, inibiva 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina nei terminali nervosi della corteccia cerebrale di ratto. I possibili meccanismi alla base delechinacoside-l'inibizione mediata del rilascio di glutammato viene ulteriormente studiata e discussa qui.

3.1 Meccanismi alla base dell'inibizione del rilascio di glutammato mediata da echinacoside

Il rilascio di glutammato evocato da 4-aminopiridina comprende due componenti: un componente Ca2 plus-dipendente fisiologicamente rilevante, che viene prodotto attraverso l'esocitosi delle vescicole sinaptiche contenenti glutammato; e una componente indipendente dal Ca2 più, che ha origine da una prolungata depolarizzazione che causa uno spostamento mediato dal potenziale di membrana dello stato stazionario del trasportatore del glutammato verso l'esterno, influenzando così l'efflusso di glutammato citosolico [31]. Qui, abbiamo osservato che l'echinacoside non ha inibito significativamente 4-il rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina in presenza di un mezzo privo di Ca2 plus (rilascio indipendente di Ca2 plus). Inoltre, l'inibizione osservata mediata da echinacoside del 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina è stata efficacemente prevenuta dalla bafilomicina A1 (che esaurisce il contenuto di glutammato delle vescicole sinaptiche), ma non dal DL-TBOA (che inibisce in modo non selettivo tutti gli aminoacidi eccitatori sottotipi di trasportatore). Questi risultati suggeriscono che l'echinacoside influenza l'esocitosi Ca2 plus -dipendente del rilascio di glutammato senza influenzare l'efflusso citosolico Ca2 plus -indipendente del glutammato attraverso l'inversione del trasportatore del glutammato della membrana plasmatica del nervo terminale. Nei terminali sinaptici, l'inibizione del canale Na più o l'attivazione del canale K più stabilizza l'eccitabilità della membrana e di conseguenza riduce l'ingresso di Ca2 più evocato e il rilascio di neurotrasmettitori [32,33]. Pertanto, il potenziale meccanismo alla base dell'inibizione del rilascio di glutammato mediata da echinacoside comporta una riduzione dell'eccitabilità sinaptosomiale. Tuttavia, questa possibilità è insostenibile sulla base di due osservazioni: (1) 4-la depolarizzazione del potenziale di membrana evocata dall'aminopiridina, misurata con il colorante sensibile al potenziale di membrana DiSC3(5) non è stata influenzata dall'aggiunta di echinacoside; e (2) l'echinacoside non ha influenzato il 4-rilascio di glutammato Ca2 più aminopiridina-indipendente, un componente del rilascio che dipende solo dal potenziale di membrana [31]. Se l'effetto non è causato dalla soppressione dell'eccitabilità sinaptosomiale, può manifestarsi attraverso una riduzione dell'attività dei canali Ca2.2 (tipo N) e Cav2.1 (tipo P/Q) Ca2 plus accoppiata con esocitosi del glutammato nel terminali nervosi [34–36]. Utilizzando fura-2, dimostriamo che l'echinacoside riduce significativamente l'4-aumento della concentrazione di Ca2 più evocato dall'aminopiridina. Inoltre, i nostri dati mostrano che l'effetto inibitorio dell'echinacoside sul 4-rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina è diminuito dal 42,4% 2,3% al 12,1% 3,9% dopo l'esposizione a un bloccante di Cav2.2 (tipo N) e Cav2 .1 Canali Ca2 plus (tipo P/Q). Inoltre, abbiamo osservato che l'echinacoside continuava a inibire significativamente il 4- rilascio di glutammato evocato dall'aminopiridina in presenza di inibitori del rilascio intracellulare di Ca2 più. Questi risultati indicano che la soppressione simultanea dell'attività del canale Ca2. Tuttavia, l'attivazione combinata di Cav2.2 (tipo N) e Cav2.1 (tipo P/Q) più l'attività del canale Ca2 non ha potuto bloccare completamente l'azione dell'echinacoside. Quindi, altri tipi non identificati di canali Ca2 plus o altre vie presinaptiche possono essere coinvolti nell'inibizione. Ad esempio, i recettori GABAA sono presenti a livello presinaptico e la loro attivazione ha dimostrato di inibire l'afflusso di Ca2 più e il rilascio di glutammato [37]. Nel presente studio, gli antagonisti del recettore GABAA SR95531 e la bicucullina non hanno bloccato l'inibizione del rilascio di glutammato mediata da echinacoside, suggerendo che i recettori GABAA non sono coinvolti nella riduzione dell'attività del canale Ca2 più voltaggio-dipendente e nella successiva inibizione del rilascio di glutammato. L'ingresso di Ca2 più attraverso i canali Ca2 più voltaggio-dipendenti attiva diverse protein chinasi associate al rilascio di glutammato nelle terminazioni nervose tra cui la protein chinasi attivata dal mitogeno, la protein chinasi C e la protein chinasi A. Qui dimostriamo che gli inibitori della protein chinasi C hanno antagonizzato efficacemente l'echinacoside -inibizione mediata del rilascio di glutammato; tuttavia, l'inibitore della proteina chinasi attivata dal mitogeno PD98059 o l'inibitore della proteina chinasi A H89 erano inefficaci. Inoltre, la 4-fosforilazione indotta dall'aminopiridina della proteina chinasi C è diminuita nei sinaptosomi dopo il pretrattamento con echinacoside a una concentrazione efficace per inibire il rilascio di glutammato. Pertanto, la via di segnalazione dell'inibizione del rilascio del glutammato mediata da echinacoside può coinvolgere la proteina chinasi C. La proteina chinasi C è un importante sistema di segnalazione intracellulare che è presente a livello presinaptico e ha un ruolo cruciale nell'esocitosi dei neurotrasmettitori. Ad esempio, diverse proteine ​​sinaptiche coinvolte nel traffico o reclutamento delle vescicole sinaptiche e nell'esocitosi, come il substrato della chinasi C miristoilato ricco di alanina, sono fosforilate dalla proteina chinasi C [38,39]. Questo processo di fosforilazione può essere aumentato dall'ingresso di Ca2 più stimolato dalla depolarizzazione, che facilita il rilascio di glutammato [40]. Quindi, possiamo ragionevolmente ipotizzare che l'effetto inibitorio dell'echinacoside sull'ingresso di Ca2 più osservato qui possa ridurre l'attività della protein chinasi C e di conseguenza il rilascio di glutammato.

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