Parte 1: L'oligosaccaride 2/-fucosillattosio del latte umano induce la neuroprotezione dall'ictus emorragico intracerebrale
Mar 22, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 e Seong-Jin Yu1,*
1Centro per la ricerca neuropsichiatrica, National Health Research Institutes, Zhunan 35053, Taiwan;
pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);
baee@nhri.edu.tw (E.-KB)
2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Corea; yhsong@aptech.biz (SI);
jongwon.yoon91@gmail.com (JY)
Corrispondenza: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: più 886-37206166 (est. 36710)
Astratto:
L'emorragia intracerebrale (ICH) si verifica quando i vasi sanguigni del cervello si rompono, causando infiammazione e morte cellulare. 2-Il fucosillattosio (2FL), un oligosaccaride del latte umano, ha potenti effetti antiapoptotici e antinfiammatori. Lo scopo di questo studio era di esaminare l'effetto protettivo di 2FL in modelli cellulari e roditori di ICH. L'emina è stata aggiunta a una corticale di ratto primarianeuronalee cocoltura della microglia BV2 per simulare l'ICH in vitro. Le immunoreattività IBA1 e MAP2 sono state utilizzate per determinare l'infiammazione eneuronalesopravvivenza. L'emina ha aumentato significativamente l'IBA1, mentre ha ridotto l'immunoreattività della MAP2. 2FL ha significativamente antagonizzato entrambe le risposte. L'effetto protettivo di 2FL è stato successivamente esaminato in un modello ICH di ratto. La somministrazione intracerebrale di collagenasi di tipo VII ha ridotto l'attività locomotoria in campo aperto. Il post-trattamento precoce con 2FL ha migliorato significativamente l'attività locomotoria. I tessuti cerebrali sono stati raccolti per l'immunoistochimica e l'analisi qRT-PCR. 2FL ha ridotto l'immunoreattività di IBA1 e CD4 nello striato lesionato. 2FL ha sottoregolato l'espressione dei marcatori di stress ER (PERK e CHOP), mentre ha sovraregolato i marcatori dei macrofagi M2 (CD206 e TGF) nel cervello lesionato. Presi insieme, i nostri dati supportano che 2FL ha aneuroprotettivoeffetto contro ICH attraverso l'inibizione dineuroinfiammazionee stress ER. 2FL può avere implicazioni cliniche per il trattamento dell'ICH.
Parole chiave: 2-fucosillattosio; ictus emorragico intracerebrale; infiammazione; reticolo endoplasmatico
effetti dell'estratto di cistanche: cura delle neuro-malattie
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1. Introduzione
L'emorragia intracerebrale (ICH) è una delle principalineurologicodisturbo associato ad alto rischio di morte negli adulti [1,2]. L'ICH costituisce il 10-15% di tutti i casi di ictus acuto [3]. Alcuni studi epidemiologici hanno supportato le disparità di genere nei pazienti con ICH [4] o malattie cerebrovascolari [5]. Una piccola parte dei pazienti con ICH sviluppa la sindrome lacunare emorragica [6]. L'attuale trattamento per ICH si concentra sul controllo dell'emorragia, sulla rimozione del coagulo di sangue e sull'alleviamento della pressione intracranica causata dall'emorragia. Non esiste una terapia farmacologica efficace per ICH.
L'infiammazione gioca un ruolo critico nell'indotto da ICHneurodegenerazione. Dopo l'inizio dell'ICH, le cellule del sangue entrano nel parenchima cerebrale, attivano la microglia e avviano la produzione di citochine proinfiammatorie [7,8]. L'emina, un sottoprodotto dell'emoglobina, provocaneuronalemorte e induce apoptosi e infiammazione [9,10]. Diversi studi hanno supportato l'efficacia del trattamento antinfiammatorio in modelli animali di ICH [11,12]. Abbiamo recentemente dimostrato che il post-trattamento precoce con un antagonista CXCR4 CX807 ha inibito l'infiammazione e migliorato la funzione comportamentale nei ratti ICH sperimentali [13]. Questi dati suggeriscono che la terapia antinfiammatoria può ridurre il danno cerebrale
dopo ICH.
Il latte materno umano contiene elementi nutritivi e diversi ingredienti bioattivi critici [14], ad esempio oligosaccaridi del latte umano (HMO) [15]. Il 2′-fucosillattosio (2FL) è un importante oligosaccaride nel latte materno. La somministrazione orale di 2FL è miglioratamemoriae apprendimento nei ratti [16,17]. Inoltre, 2FL ha soppresso l'espressione e l'infiammazione di CD14 indotta da lipopolisaccaridi negli enterociti umani [18]. Abbiamo recentemente segnalato che 2FL è stato attenuatoneuroinfiammazionein un cervello che soffre di ictus ischemico [19]. Questi dati suggeriscono che il 2FL è un potente agente antinfiammatorio e può, quindi, essere utile per il trattamento dell'ICH.
Lo scopo di questo studio era di esaminare le azioni protettive neurali di 2FL in modelli cellulari e animali di ICH. L'emina è stata utilizzata per simulare l'ICH nella coltura cellulare [20]. Abbiamo dimostrato che 2FL ha antagonizzato l'attivazione della microglia mediata dall'emina. La collagenasi di tipo VII è stata utilizzata per generare ICH focale nei ratti adulti [13]. Abbiamo scoperto che 2FL mitigava significativamente l'attivazione della microglia indotta da ICH, l'infiltrazione di linfociti CD4 più e lo stress ER nel cervello lesionato e migliorava la funzione comportamentale. I nostri dati supportano che 2FL ha aneuroprotettivoeffetto contro ICH.
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2. Risultati
2.1. 2FL ridotta neurodegenerazione mediata da emina nei neuroni corticali primari e cocoltura della microglia BV2
L'effetto protettivo del 2FL è stato esaminato per la prima volta in un modello cellulare di emorragia cerebrale. corticale primarianeuronalee le coculture di microglia BV2 sono state trattate con emina (10 uM) per 48 ore (vedi sequenza temporale nella Figura 1E). Hemin attenuatoneuronalemarcatore MAP2 (Figura 1A), mentre ha aumentato il marcatore della microglia IBA1 (Figura 1B). Queste risposte sono state entrambe antagonizzate da 2FL (1 uM, Figura 1A, B). Le immunoreattività di MAP2 e IBA1 sono state ulteriormente analizzate misurando la densità di pixel di specifici marcatori. Come mostrato nella Figura 1C, D, l'emina ha ridotto significativamente l'immunoreattività della MAP2 (Map2-ir) e ha aumentato l'IBA1-ir (p < 0.00="" 1,="" anova="" unidirezionale,="" n="6" in="" ciascun="" gruppo).="" queste="" risposte="" sono="" state="" significativamente="" antagonizzate="" da="" 2fl="" (map2:="" p=""><0,001, f2,14="115.863;" iba1:="" p=""><0,001, f2,{28}}.644,="" anova="">
F
Figura 1. Ilneuroprotettivoeffetto di 2FL in una corticale primarianeuronee cocoltura della microglia BV2. (A) Le microfotografie rappresentative dimostrano che l'emina ha ridotto l'immunoreattività MAP2 (-ir). La co-somministrazione con 2FL ha antagonizzato la perdita di MAP-ir mediata dall'emina. (B) Hemin ha aumentato l'IBA1-ir. Co-somministrazione con 2FL IBA ridotto1-ir. (C,D) La densità dei pixel di MAP2-ir o IBA{{10}}ir è stata analizzata utilizzando il software NIS Elements AR 5.11. (C) 2FL significativamente antagonizzata perdita di MAP2-ir mediata dall'emina. (D) 2FL ha attenuato significativamente l'attività IBA1 indotta dall'emina. (E) Cronologia dell'esperimento. * p < 0,05.="" barra="" della="" scala="100">
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2.2. Post-trattamento con attività locomotoria migliorata 2FL nei ratti ICH
L'effetto protettivo di 2FL è stato successivamente esaminato in un modello animale di ICH. A un totale di 14 ratti maschi adulti è stata somministrata stereotassicamente una dose bassa (0,5 unità/uL × 1 ul) di collagenasi di tipo VII per indurre un'emorragia cerebrale nello striato destro. 2FL (400 mg/kg/die, ip, n=7) o veicolo (soluzione fisiologica, ip, n=7) sono stati somministrati ogni giorno per 5 giorni, a partire da 1 giorno dopo l'ictus (consultare la sequenza temporale in figura 2G). Quindi, 2 ore dopo l'ultima 2FL o iniezione del veicolo il giorno 5, gli animali sono stati collocati individualmente in camere di attività a infrarossi per 30 minuti. Il comportamento locomotore in campo aperto è stato esaminato per 30 minuti. Abbiamo scoperto che 2FL ha aumentato significativamente l'attività verticale (VACTV, Figura 2A), la distanza totale percorsa (TOTDIST, Figura 2B), il tempo verticale (VTIME, Figura 2C), l'attività orizzontale (HACTV, Figura 2D), il tempo di movimento (MOVTME, Figura 2E ) e il numero del movimento (MOVNO, Figura 2F). Le statistiche dettagliate (ANOVA a due vie più test Newman-Keuls (NK) post hoc) sono elencate nella Tabella 1.
Figura 2. Il post-trattamento con 2FL migliora le funzioni neurali nei ratti ICH. Ratti adulti sono stati trattati con collagenasi di tipo VII su D0 (G, sequenza temporale). 2FL o veicolo sono stati somministrati sistematicamente ogni giorno per 5 giorni. Il comportamento locomotore è stato esaminato su D5. 2FL ha migliorato significativamente (A) attività verticale, (B) distanza totale percorsa, (C) tempo verticale, (D) attività orizzontale, (E) tempo di movimento e (F) movimento
numero. n {{0}} in ogni gruppo. * p < 0.05,="" anova="" a="" due="" vie;="" #="" p="">< 0,05,="" test="" nk="" post="">
Tabella 1. Differenze significative nei comportamenti locomotori tra ICH più veh e ICH più 2FL.
2.3. Trattamento post-trattamento precoce con attivazione microgliale ridotta 2FL nella regione peri-lesionata
Otto ratti ICH (2FL, n=4; Veh, n=4) sono stati sottoposti a eutanasia e perfusi per l'immunoistochimica IBA1 dopo il test comportamentale il giorno 5. La tipica IBA1-ir è illustrata nella Figura 3 . IBA1-ir è stato potenziato nell'area perilesionata nello striato (Figura 3B), rispetto ai siti corrispondenti nello striato controlaterale non lesionato (Figura 3A) nei ratti con ictus che hanno ricevuto veh. Ad un ingrandimento elevato, nell'area lesionata sono state trovate cellule microgliali deramificate o ameboidi (Figura 3B, inserto), mentre nello striato non lesionato sono state trovate microglia a riposo che esibivano una morfologia ramificata (Figura 3A, inserto). Il trattamento con 2FL ha ridotto l'IBA1-ir e ha parzialmente ripristinato la ramificazione morfologica della microglia (Figura 3C, inserto). L'IBA1-è stato quantificato e mediato su tre sezioni cerebrali consecutive con una commessura anteriore visualizzata in tutti gli animali. 2FL ha ridotto significativamente l'IBA1-o nel cervello ICH (Figura 3D, p < 0.001,="" f2,12="50.357," anova="">
Figura 3. Il 2FL post-trattamento precoce ha ridotto l'attivazione della microglia nello striato lesionato. Gli animali hanno ricevuto il veicolo o 2FL dopo l'iniezione di collagenasi dal giorno 1 al giorno 5. Gli animali sono stati sacrificati il giorno 5. Nello striato lesionato è stata riscontrata un'immunoreattività IBA1 potenziata con morfologia deramificata (B vs. A). Il trattamento con 2FL ha ridotto l'immunoreattività dell'IBA (C vs. B). (D) 2FL ha ridotto significativamente l'immunoreattività dell'IBA1 nel cervello lesionato. * p < 0.05,="" test="" anova="" più="" nk="">
2.4. 2FL CD4 mitigato più infiltrazione linfocitaria nei cervelli lesionati
La somministrazione di collagenasi ha migliorato l'infiltrazione di CD4 più linfociti nello striato lesionato (Figura 4B). Quasi nessuna cellula CD4 è stata trovata nello striato non lesionato (Figura 4A). L'infiltrazione di cellule CD4 nello striato lesionato è stata mitigata dal trattamento con 2FL (Figura 4C vs. Figura 4B; p <{9}}.001, f2,{12}}.485,="" anova="" unidirezionale,="" figura="">
Figura 4. Post-trattamento con 2FL ridotto CD4 più l'infiltrazione di linfociti nel cervello lesionato. Le microfotografie rappresentative dimostrano l'immunoreattività del CD4 in (A) lo striato non lesionato e (B) lo striato lesionato da un veicolo ricevente di ratto a basso (calibrazione=50 um) e ad alto ingrandimento (inserto, calibrazione=10 um), così come (C) lo striato lesionato di un ratto che riceve 2FL. (D) 2FL ha ridotto significativamente la CD{{10}}ir nel cervello lesionato (* p < 0,001,="">
modo ANOVA).
2.5. 2FL ha alterato in modo differenziale l'espressione dei marker infiammatori M1 e M2 nei cervelli ICH
I tessuti striatali sono stati raccolti da otto ratti (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) il giorno 5. L'espressione dei marcatori infiammatori M1/M2 è stata esaminata mediante qRT-PCR. ICH ha aumentato significativamente l'espressione del marcatore M1 CD86 (Figura 5A, p=0.005) e dei marcatori M2 CD206 e TGF (Figura 5B, C, p=0.005). 2FL non ha alterato l'espressione di CD86 (Figura 5A, p=0.356, ANOVA a due vie). Tuttavia, ha sovraregolato significativamente l'espressione di CD206 (Figura 5B) e TGF nel lato lesionato (p <0,05, test="">
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2.6. 2FL ha alterato l'espressione dello stress ER e dei marcatori apoptotici nei cervelli ICH
L'espressione dello stress ER e dei marcatori apoptotici è stata esaminata in otto ratti (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL ha ridotto significativamente l'espressione di PERK (Figura6A, p {5}}.016), IRE1 (Figura6B, p {9}}.018), CHOP (Figura6C, p=0.032) e SigmaR1 (Figura6D, p=0.017) nello striato lesionato. 2FL non ha alterato l'espressione di BIP (Figura6E, p=0.841) e ATF6 (Figura6F, p=0.403). Inoltre, l'espressione della caspasi3 è stata significativamente ridotta di 2FL (Figura 6G, p=0.029, t-test).
Figura 5. 2FL sovraregolato l'espressione dei marcatori M2 nei cervelli ICH. ICH ha aumentato significativamente l'espressione di (A) marker M1 CD86 e marker M2 (B) CD206 e (C) TGF (# p=0.005, a due vie ANOVA). (A) 2FL sovraregolava significativamente l'espressione di (B) CD206 e (C) TGF, ma non (A) CD86, nello striato lesionato (* p <0,05, test="">
Figura 6. 2FL ha soppresso l'espressione dello stress ER e dei marcatori apoptotici. L'espressione di (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 e (G) caspase3 è stata significativamente inibita da 2FL nei cervelli emorragici. L'espressione di (E) BIP e (F) ATF6 non è stata alterata da 2FL. * p < 0.05.="" er,="" reticolo="" endoplasmatico;="" perk,="" chinasi="" er="" simile="" alla="" proteina="" chinasi="" r;="" ire1,="" enzima="" 1="" che="" richiede="" inositolo;="" chop,="" proteina="" omologa="" della="" proteina="" legante="" il="" potenziatore="" ccaat;="" sigmar1,="" recettore="" sigma="" 1;="" atf6,="" attivando="" il="" fattore="" di="" trascrizione="">
