Parte 1 Effetti preventivi dei glicosidi del feniletanolo da Cistanche tubulosa sul siero bovino Fibrosi epatica indotta da albumina nei ratti

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Astratto

Sfondo:Cistanche tubulose è una medicina tradizionale cinese a base di erbe ampiamente utilizzata per la regolazione dell'immunità.Glicosidi feniletanolo da cistanche(CPhGs) da questa pianta sono i materiali principalmente efficaci. Lo scopo di questo studio era di valutare gli effetti preventivi e terapeutici dei CPhG sulla fibrosi epatica indotta da BSA nei ratti e sui relativi meccanismi molecolari che coinvolgono le cellule stellate epatiche. Biejiarangan (BJRG), un'altra medicina tradizionale cinese a base di erbe, è stata utilizzata come controllo positivo. Metodi: In esperimenti in vivo, 75 ratti SD sono stati divisi casualmente in 6 gruppi: normale (trattato con acqua distillata), modello (trattato con BSA), farmaco positivo (trattato con BSA più BJRG 60{{29} } mg/kg/giorno) e gruppi trattati con BSA più CPhG (125, 250 e 50{36}} mg/kg/giorno). Gli indici del fegato e della milza, i livelli sierici di aspartato aminotransferasi (AST), alanina aminotransferasi (ALT), acido esadecenoico (HA), laminina (LN), procollagene di tipo III (PCIII), collagene di tipo IV (IV-C), idrossiprolina ( Hyp) e il fattore di crescita trasformante 1 (TGF- 1) sono stati misurati nei fegati di ratto. I gradi istopatologici per la fibrosi epatica sono stati valutati per ciascun gruppo utilizzando H&E e la colorazione tricromica di Masson. L'espressione di TGF- 1, collagene I (Col-I) e collagene III (Col-III) è stata determinata mediante un metodo di colorazione immunoistochimica. Questi effetti sono stati ulteriormente valutati in vitro determinando i livelli di espressione di NF-κB p65 e Col-I mediante analisi PCR quantitative in tempo reale. L'espressione della proteina Col-I è stata anche esaminata mediante western blotting. RISULTATI: Tutti i gruppi di dosaggio (125, 250 e 500 mg/kg/die) di CPhG hanno ridotto significativamente l'indice di fegato e milza, diminuito i livelli sierici di ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C, Contenuto TGF- 1 (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" e="" p="">< 0,01)="" e="" contenuto="" hyp.="" i="" cphg="" hanno="" anche="" alleviato="" notevolmente="" il="" gonfiore="" delle="" cellule="" epatiche="" e="" prevenuto="" efficacemente="" la="" necrosi="" degli="" epatociti="" e="" l'infiltrazione="" delle="" cellule="" infiammatorie.="" i="" risultati="" immunoistochimici="" hanno="" mostrato="" che="" i="" cphg="" hanno="" ridotto="" significativamente="" l'espressione="" di="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 e="" p=""><0,01), col-i="" e="" col-iii.="" gli="" effetti="" in="" vitro="" dei="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" e="" 25="" ug="" ml)="" su="" hsc-t6="" hanno="" mostrato="" che="" i="" cphg="" hanno="" ridotto="" significativamente="" l'espressione="" dell'mrna="" di="" nf-κb="" p65="" e="" col-i="" e="" anche="" i="" cphg="" hanno="" sottoregolato="" l'espressione="" della="" proteina="" col-i.="" conclusioni:="" i="" cphg="" hanno="" un="" significativo="" effetto="" anti-fibrosi="" epatica="" e="" possono="" essere="" usati="" come="" agenti="" epatoprotettivi="" per="" il="" trattamento="" della="" fibrosi="">

Parole chiave: Fibrosi epatica, Cistanche tubulosa, Feniletanolo glicoside, Chemochine BSA, Prevenzione e terapia.

Sfondo

La fibrosi epatica è una risposta di guarigione della ferita a un grave danno epatico che si verifica nella patogenesi dell'epatite cronica indotta da vari fattori. Questi fattori sono infezioni virali, abuso di alcol, colestasi e malattie metaboliche e autoimmuni [1–3]. Il progressivo accumulo di matrice extracellulare (ECM) e il ridotto rimodellamento interrompono la normale architettura del fegato, con conseguente fibrosi epatica [4]. La fibrosi epatica è fondamentale nella malattia epatica cronica e spesso si sviluppa in cirrosi irreversibile e carcinogenesi. Allo stato attuale, non esistono metodi o farmaci efficaci per il trattamento della fibrosi epatica. Pertanto, è urgente trovare un farmaco anti-fibrosi epatica che attenuerà la progressione del danno epatico verso la fibrosi e il cancro.Cistanche tubuloseW (della famiglia delle Orobanchaceae) è una pianta parassitaria ampiamente coltivata nella regione meridionale dello Xinjiang in Cina [5]. Le persone di solito lo usano per rinvigorire i reni, nutrire il sangue, rilassare l'intestino e ritardare la senescenza. È ufficialmente elencato nella farmacopea cinese [6]. C. tubulosa contiene una varietà di componenti attivi. Questi includonoGlicosidi feniletanolo da cistanche(CPhGs), iridoidi e polisaccaridi. Come uno dei tanti componenti attivi inC. tubulosa, i CPhG hanno mostrato convincenti effetti antiossidanti, anti-fatica, neuroprotettivi e antinfiammatori sia in studi in vivo che in vitro [7]. Negli ultimi anni è stato riportato che i CPhGs(Glicosidi feniletanolo da cistanche) hanno effetti epatoprotettivi. I potenziali meccanismi alla base di questi effetti sono lo scavenging dei radicali liberi, la protezione delle membrane epatiche, l'immunoregolazione, l'inibizione dell'apoptosi, l'inibizione dell'espressione di HBsAg e HBeAg e l'inibizione della replicazione del DNA dell'HBV e altri [8-11]. Tuttavia, pochi studi in letteratura affrontano l'effetto della fibrosi antiepatica della grafica. Pertanto, questo studio mirava a studiare l'effetto della fibrosi antiepatica dei GPhC utilizzando un modello di fibrosi epatica indotta da albumina sierica bovina (BSA) nei ratti. I meccanismi molecolari correlati sono stati studiati nelle cellule HSC-T6.

Metodi

Sostanze chimiche e reagenti

Un kit di idrossiprolina (idrolisi alcalina) (lotto: 20140616) è stato acquistato dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Cina). I kit ELISA sandwich Rat TGF- 1 (lotto: 238240615) sono stati acquistati da Lianke Biotech Co., Ltd. (Cina). L'anticorpo di coniglio anti-collagene I (lotto: 140619), l'anticorpo di coniglio anti-collagene III (lotto: 980788 W) e l'anticorpo di coniglio anti-TGF- 1 (lotto: 140619) è stato fornito da Beijing Biosintesi Biotechnology Co., LTD (Cina). Racchiuso con siero di pecora normale (fluido di lavoro) (Lotto: WP141214), PV-6000 (Lotto: WK141225) e kit DAB (Lotto: K136621D) sono stati acquistati da Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Cina) . Il rilevamento degli anticorpi primari è stato eseguito utilizzando 2. Soluzione di anticorpi (Alk-Phos. Coniugato, Anti-coniglio) e 2. Soluzione di anticorpi (Alk-Phos. Coniugato, Anti-topo) (lotto: 272387) acquistati da Invitrogen Company (USA ). L'albumina di siero bovino (BSA) (Lotto: SLBG8239V) è stata acquistata da Sigma (USA). Prima dell'uso, la BSA è stata preparata a 18 g/L in soluzione fisiologica, i batteri sono stati rimossi mediante filtrazione e la BSA è stata conservata a 4 gradi . L'adiuvante incompleto di Freund contenente 1 g di lipidi di pelo di pecora (Lotto: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Cina)) è stato miscelato con 2 g di paraffina liquida (Lotto: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Cina), sterilizzato in un'autoclave a vapore e conservato a 4 gradi Il farmaco positivo BJRG è stato ottenuto come compresse Biejiarangan dalla Mongolia Interna Furui Medical Science Co., Ltd. (Cina).Le scorte di farmaci BJRG sono state preparate dissolvendo Compresse BJRG in acqua distillata ad una concentrazione di 600 mg/kg.

Materiali vegetali

C. tubulosa(famiglia Orobanchaceae) è stata acquistata dalla regione di Minfeng dello Xinjiang in Cina. Il materiale è stato autenticato dal ricercatore Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica dello Xinjiang. I campioni di voucher sono stati depositati presso l'Istituto di Materia Medica dello Xinjiang.

Preparazione di CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche)

Rizomi di rizomi essiccati e affettatiC. tubulosa(6.0 kg) sono stati estratti consecutivamente a riflusso tre volte con il 70 percento di etanolo e il solvente è stato rimosso per ottenere l'estratto di etanolo. Gli estratti di etanolo sono stati purificati utilizzando la resina AB-8 per ottenere i glicosidi del feniletanolo (CPhG). Le soluzioni madre di CPhG utilizzate per diversi gruppi di dosaggio negli studi sugli animali (500 mg/kg, 250 mg/kg e 125 mg/kg, rispettivamente) sono state sciolte in 0,5 percento (5 g/L) di carbossimetilcellulosa (sale di sodio).

Quantificazione dei CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche)

Il contenuto di due componenti (echinacoside e acteoside) nei CPhG è stato determinato mediante HPLC utilizzando un metodo precedentemente riportato (Zhang et al. 2004) [12]. L'HPLC è stato eseguito utilizzando un HPLC Shimadzu LC-10A dotato di un rilevatore UV. La colonna HPLC era una colonna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). La fase mobile isocratica era costituita da acido acetico metanolo-acetonitrile-1 (15:10:75, v/v/v). L'eluizione è stata di 40 minuti e la velocità di flusso è stata mantenuta a 0,6 mL/min. La temperatura della colonna è stata mantenuta costante a 30 gradi. Il rilevamento UV era a 334 nm.

Animali e linea cellulare HSC-T6

[Grado SPF] ratti maschi adulti sani Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) sono stati acquistati dallo Xinjiang Medical University Animal Center, licenza n.: SCXK (Nuovo) 2011–0004. I ratti sono stati nutriti con cibo privo di patogeni specifici (SPF). Tutte le procedure relative agli esperimenti sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale del Primo Ospedale Affiliato della Xinjiang Medical University. I ratti sono stati alloggiati in gabbie in condizioni ambientali controllate (25 gradi e un ciclo luce/buio di 12 ore) e hanno avuto libero accesso al cibo in pellet standard per topi e all'acqua del rubinetto. I ratti sono stati acclimatati prima del trattamento. Una linea cellulare stellata epatica di ratto immortalata, HSC-T6, è stata ottenuta da Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Cina). Le cellule HSC-T6 sono state coltivate in Modified Eagle's Medium (High Glucose) di Dulbecco (DMEM, Pechino, Cina) integrato con il 10% di siero bovino fetale (Gibco, Sud America), 100 IU/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina (Pechino , Cina) in un'incubatrice umidificata a 37 gradi con il 5% di CO2.

Danno epatico indotto da BSA e trattamenti

Settantacinque ratti SD sono stati divisi casualmente in sei gruppi: normale (trattato con acqua distillata), modello (trattato con BSA), farmaco positivo (trattato con BSA più BJRG 600 mg/kg/giorno) e trattato con BSA più CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/giorno). I gruppi trattati con BSA più CPhG (125, 250, 500 mg/kg/giorno) avevano 13 ratti in ciascun gruppo e l'altro gruppo aveva 12 ratti in ciascun gruppo. Il modello di danno epatico indotto da BSA è suddiviso in sensibilizzazione primaria seguita da un attacco immunologico) [13]. Fatta eccezione per il gruppo normale, agli altri gruppi sono state somministrate iniezioni sottocutanee multiple con 0,5 ml (9 mg/ml) di adiuvante incompleto di BSA Freund il giorno 1, il giorno 15, il giorno 22, il giorno 29 e il giorno 36 per la sensibilizzazione primaria. Sette giorni dopo la quinta iniezione, il sangue è stato ottenuto attraverso il plesso venoso retinico del ratto e testato per gli anticorpi dell'albumina sierica. L'anticorpo BSA nel siero di ratto è stato rilevato mediante un metodo di doppia diffusione agar. L'iniezione d'attacco è stata eseguita somministrando 0,4 ml di BSA in soluzione fisiologica attraverso la vena caudale in ratti BSA positivi agli anticorpi due volte a settimana per dieci volte. Le concentrazioni e i tempi delle iniezioni erano 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 e 10.00 g/L al giorno 46, giorno 50, giorno 53, giorno 57, giorno 60, giorno 64, giorno 67, giorno 71, giorno 74 e giorno 78, rispettivamente. Nel gruppo normale, è stata utilizzata soluzione salina normale per iniezioni immunologiche primarie (sensibilizzazione) e secondarie (attacco) anziché BSA e altre condizioni erano le stesse del gruppo modello. Al gruppo normale è stata somministrata per via orale acqua distillata con una dose di 10 ml/kg/giorno. Al gruppo modello è stata somministrata per via orale 10 ml/kg/giorno di una soluzione di CMC-Na allo 0,5%. Al gruppo positivo del farmaco è stato somministrato per via orale 600 mg/kg/die di BJRG. I CPhG trattati con BSA più (125,

250 e 500 mg/kg/die) ai gruppi sono stati somministrati per via orale 125, 250 e 500 mg/kg/die di CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche), rispettivamente. Il dosaggio giornaliero dei ratti è continuato per due settimane dopo l'ultima iniezione. Dopo il periodo sperimentale, i ratti sono stati fatti digiunare per 12 ore prima del 10% di cloralio idrato e quindi immediatamente soppressi. Campioni di siero sono stati raccolti da ciascun ratto e utilizzati immediatamente. I fegati sono stati raccolti per due scopi: (1) conservazione in azoto liquido per i kit Hyp e (2) fissazione in formaldeide al 10 percento per esami istologici e immunoistochimici. L'intera durata degli studi sugli animali è stata di 93 giorni.

Indici di fegato e milza

Il fegato e la milza sono stati sezionati mediante laparotomia e lavati con soluzione salina normale a 4 gradi. Dopo aver assorbito l'acqua in eccesso con carta da filtro, il fegato e la milza sono stati pesati per calcolare gli indici corrispondenti: peso relativo dell'organo=massa dell'organo (g)/massa corporea individuale (g) × 100 percento [14].

Esperimenti cellulari

Le cellule HSC-T6 sono state piastrate in una 96-piastra a pozzetti. Inizialmente, le cellule sono state coltivate con DMEM contenente l'10 percento di FBS per 48 ore. Il mezzo è stato quindi sostituito con DMEM senza FBS per far morire di fame le cellule per 12 ore. Le cellule sono state quindi coltivate con DMEM che conteneva 5,0 ng/mL di TGF- 1 (senza FBS) per 24 ore. Infine, diverse concentrazioni di CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml e 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml e 1,5 ug/ml) ed echinacoside (500 ug/ml, 250 ug/ml e 125 ug/ml) sono stati condotti nella piastra in pozzetti quadruplicati e incubati per 48 h.

Analisi PCR in tempo reale

Il livello di espressione dell'mRNA di NF-κB, p65 e collagene I è stato determinato mediante PCR in tempo reale. Per determinare le espressioni di mRNA nelle cellule HSC-T6, le cellule (4 × 105 cellule) sono state seminate in piastre a sei pozzetti con 3 ml di DMEM con il 10 percento di FBS e incubate per una notte a 37 gradi e 5 percento di CO2, dopodiché il terreno di coltura cellulare sono stati modificati in DMEM senza siero. Successivamente, i CPhG(Glicosidi feniletanolo da cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml e 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml e 1,5 ug/ml) ed echinacoside (500 ug/ml , 250 ug/ml e 125 ug/ml) sono stati aggiunti ai pozzetti. Dopo 48 ore di incubazione con CPhG o composizioni monomeriche, l'RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen, USA) e agitato vigorosamente con cloroformio per 15 s. Dopo essere rimasto a temperatura ambiente per 3 minuti, il lisato è stato centrifugato a 12,000 × g per 15 minuti a 4 gradi. L'RNA nella fase acquosa è stato precipitato con isopropanolo e la fase acquosa superiore è stata trasferita in una nuova provetta per microcentrifuga. L'RNA è stato precipitato aggiungendo 0,75 percento di etanolo, dopodiché la provetta per microcentrifuga e centrifugata a 12,{20}} × g a 4 gradi per non più di 5 minuti. Il supernatante è stato rimosso e l'RNA è stato essiccato a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Insiemi specifici di primer (Sangon, Shanghai, Cina) utilizzati per l'amplificazione di actina di ratto [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] e NF I geni -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] sono stati progettati utilizzando Batch Primer 3. I primer forward (fw) e reverse (rv) erano i seguenti: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). I risultati sono stati normalizzati all'mRNA del gene housekeeping -actina come controllo interno e sono presentati come livelli di mRNA relativi. Le reazioni sono state eseguite con 8 μL di iQ SYBR Green Supermix, 1 μL di coppia di primer 10 pM, 8,5 μL di acqua distillata e 2,5 μL di cDNA. Ciascuna reazione a catena della polimerasi è stata eseguita nelle seguenti condizioni: 95 gradi per 3 minuti, quindi 40 cicli di 10 s a 95 gradi, 30 s a 55 gradi e 10 s a 55 gradi – 95 gradi per l'estensione, seguiti da una singola misurazione della fluorescenza . I risultati finali sono stati descritti con i relativi valori ({56}}ΔΔCt). Il calcolo e l'analisi sono stati eseguiti dal sistema di rilevamento PCR in tempo reale iQ5.

Analisi Western blot

I livelli di espressione proteica del collagene I (Abcam, Cambridge, Regno Unito, art. n.: ab34710) sono stati determinati mediante Western blotting [con -actina (Lotto: 60008-1-lg; Proteintech, Cina) come controllo delle pulizie. Gli estratti di cellule intere sono stati preparati utilizzando il tampone di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Thermo Scientific, USA) con cocktail di inibitori della proteasi Halt all'1% (Thermo Scientific, USA) e cocktail di inibitori della fosfatasi Halt all'1% (Thermo Scientific, USA). La concentrazione proteica è stata misurata e quantificata con il metodo Bradford [18]. La proteina (10-50 ug) è stata separata su un gel SDS-PAGE al 10% e trasferita su membrane PVDF (Millipore, USA). Le membrane sono state bloccate per 1 ora a temperatura ambiente con BSA al 5% e gli anticorpi primari (anticorpo anti-colla gen I, diluizione 1:200 o mAb murino di -actina, diluizione 1:5000) sono stati incubati a 4 gradi durante la notte. Il corrispondente Alk-Phos. gli anticorpi secondari coniugati sono stati incubati a temperatura ambiente. Infine, le membrane sono state lavate tre volte con soluzione fisiologica 1 × Tris–HCl con Tween 20 allo 0,1% e i segnali sono stati scansionati e visualizzati dal sistema di imaging GEL DOC XR (Bio-Rad). L'analisi densitometrica è stata eseguita sulle proteine ​​di interesse e normalizzate in -actina dal software GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -actin è stato utilizzato come controllo interno.

analisi statistica

Il test di normalità di Shapiro-Wilk e il test di omogeneità della varianza di Levene sono stati applicati per verificare la normalità e You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Pagina 4 di 13omogeneità della varianza. L'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey è stata utilizzata per identificare differenze statistiche di dati disomogenei e normalmente distribuiti. Il test non parametrico di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per analizzare dati non normalmente distribuiti o omogenei. I risultati sono stati espressi come media ± DS. La significatività è stata fissata a P < 0.05.="" tutti="" i="" dati="" sono="" stati="" analizzati="" dal="" software="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Risultati

Determinazione quantitativa dei CPhG

I CPhG in C. tubulosa contengono due glicosidi dell'alcol feniletilico, echinacoside e acteoside e il loro contenuto nei CPhG è stato determinato mediante analisi HPLC (Fig. 1) in 42,71 ± 0,42 percento e 14,27 ± {{7 }}.18 percento, rispettivamente.

Indici di fegato e milza

Come è stato mostrato nella Tabella 1, gli indici del fegato e della milza del gruppo modello erano elevati in modo significativo [P <0.01, p=""><0,05]. gli="" indici="" di="" fegato="" e="" milza="" del="" farmaco="" positivo="" bjrg="" e="" cphg="" a="" diversi="" gruppi="" di="" dosaggio="" sono="" stati="" significativamente="" ridotti="" rispetto="" al="" gruppo="" modello="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," rispettivamente].="" gli="" indici="" del="" fegato="" e="" della="" milza="" erano="" inferiori="" a="" quelli="" del="" gruppo="">

Effetti dei CPhG sulle attività di ALT, AST e marcatori di fibrosi epatica

Nel presente studio, i livelli sierici degli enzimi epatici AST e ALT erano significativamente aumentati nel gruppo modello, riflettendo il danno epatocellulare nei ratti con fibrosi epatica indotta da BSA. Tuttavia, gli esperimenti.

ha mostrato che il trattamento con BJRG (600 mg/kg) e CPhG (125, 250 e 5{{10}}0 mg/kg) ha ridotto significativamente l'AST [PAST < 0.0{{60}}1,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001="" ,="" rispettivamente]="" e="" livelli="" di="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," rispettivamente]="" nei="" ratti="" con="" fibrosi="" epatica="" .="" (tavolo="" 2).="" i="" livelli="" di="" ha,="" ln,="" pc="" e="" iv-c="" nei="" ratti="" modello="" erano="" significativamente="" aumentati="" [pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0,002," piv-c="">< 0,001,="" rispettivamente].="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" modelli,="" i="" livelli="" di="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," rispettivamente],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," rispettivamente],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," rispettivamente]="" e="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" rispettivamente]="" nei="" ratti="" sono="" stati="" notevolmente="" ridotti="" da="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" e="" cphg="" a="" diversi="" gruppi="" di="" dosaggio="" (125,="" 250="" e="" 500="" mg/kg)="" (tabella="" 3).="" il="" contenuto="" di="" hyp="" e="" il="" tgf-="" 1="" il="" contenuto="" di="" collagene="" è="" stato="" rilevato="" anche="" misurando="" i="" livelli="" di="" hyp="" nel="" tessuto="" epatico.="" come="" mostrato="" in="" tabella="" 4,="">il livello nel gruppo modello era significativamente più alto rispetto al gruppo normale, ma era notevolmente diminuito nel gruppo BJRG e nei diversi gruppi di dosaggio di CPhGs. La concentrazione epatica di TGF{{0}} del gruppo modello nei ratti è stata significativamente aumentata [P < 0.001].="" rispetto="" al="" gruppo="" modello,="" i="" livelli="" di="" tgf-="" 1="" del="" farmaco="" positivo="" e="" dei="" diversi="" gruppi="" di="" dosaggio="" di="" cphg="" sono="" stati="" notevolmente="" ridotti="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" rispettivamente].="" i="" risultati="" sono="" riassunti="" nella="" tabella="">

Esame istopatologico

Le osservazioni di sezioni di tessuto epatico normali colorate con H&E e tricromo di Masson mostrano lobuli epatici e sinusoidi epatici distinti. La struttura del tessuto epatico nei ratti modello era disordinata e il tessuto epatico e i sinusoidi epatici sono stati sostituiti da una grande quantità di tessuto connettivo. Tuttavia, nel gruppo di trattamento sono stati rilevati una citoarchitettura più normale e meno tessuto connettivo rispetto a quelli del gruppo modello.

Colorazione H&E

Nel gruppo normale, è stata osservata l'integrità strutturale del lobulo epatico senza aree portali anormali e sinusoidi epatici. I cordoni epatici erano disposti in modo ordinato, con il nucleo rotondo e chiaro. I nuclei si trovano al centro della cellula, con abbondante citoplasma. Solo l'area portale presenta una piccola quantità di tessuto fibroso (Fig. 2a). Nel gruppo modello, la struttura lobulare è stata gravemente danneggiata. Le cellule del fegato hanno mostrato una lieve degenerazione acquosa, per lo più degenerazione a palloncino e/o degenerazione grassa. Sono state inoltre osservate la formazione di infiltrazione di cellule infiammatorie, un'estesa iperplasia del tessuto fibroso, la formazione di un gran numero di setto fibroso, lobuli divisi e una significativa proliferazione delle cellule del fegato. Queste osservazioni hanno confermato il successo dell'istituzione del modello animale di fibrosi epatica con danno immunitario del ratto (Fig. 2b). Rispetto al gruppo modello, si è verificata una riduzione dell'infiltrazione di cellule infiammatorie nei diversi CPhG. Sono stati anche osservati meno necrosi e degenerazione grassa delle cellule epatiche, nonché un alleviamento della fibrosi. I CPhG hanno attenuato significativamente la patologia della fibrosi epatica indotta da BSA nei ratti, alleviato il gonfiore delle cellule del fegato e prevenuto efficacemente la necrosi degli epatociti e l'infiltrazione di cellule infiammatorie, suggerendo che i CPhG esercitano un effetto protettivo sulla fibrosi epatica del ratto indotta da BSA. (Fig. 2c–f). Colorazione tricromica di Masson Nel gruppo normale, il tessuto epatico era normale. L'area del portale epatico mostrava un piccolo numero di fibre di collagene blu e il tessuto epatico era normalmente strutturato (Fig. 3a). Rispetto al tessuto epatico del gruppo normale, il tessuto fibroso proliferava dal lembo centrale e si espandeva nel parenchima epatico. Fibre di collagene estese e legate e

avvolgeva l'intero lobulo e circondava la vena centrale. Questi effetti, insieme alla fibrosi degli epatociti, al danno strutturale lobulare, alla fibrosi periportale e alla formazione di pseudolobuli (Fig. 3b) hanno fornito la prova che il modello è stato stabilito. Rispetto al gruppo modello, le fibre di collagene nel gruppo di controllo positivo del farmaco erano leggermente estese verso l'esterno dall'area portale periferica (Fig. 3c). Rispetto al gruppo modello, le fibre di collagene nei diversi gruppi di dosaggio di CPhGs erano significativamente ridotte, la proliferazione delle fibre era inibita e la proliferazione del tessuto fibroso all'interno del parenchima epatico era significativamente ridotta. Questi risultati hanno suggerito che i CPhG proteggessero i ratti dalla fibrosi epatica indotta da BSA (Fig. 3d-f).

Colorazione immunoistochimica

È importante sottolineare che l'espressione del collagene di tipo I e del collagene di tipo III svolgono ruoli essenziali nello sviluppo della fibrosi epatica e la loro generazione e deposizione nel tessuto epatico potrebbe fungere da determinante importante dell'efficacia della fibrosi antiepatica. I risultati sono riassunti nella tabella 5

Collagene di tipo I

Il gruppo normale esprimeva collagene di tipo I principalmente nei vasi sanguigni e nell'area portale. Il gruppo modello fibrosi vascolare di tipo I di collagene altamente espresso nelle aree portali. Nello spazio di Disse, la colorazione del collagene di tipo I è stata osservata come striature o come una distribuzione irregolare. Setti fibrosi racchiusi in collagene per formare pseudolobulo. In questi esperimenti, si sono formati meno setti fibrosi per BJRJ (600 mg/kg) e diversi gruppi di dosaggio di CPhGs (125, 250 e 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 e P Col I=0.044, rispettivamente]. I risultati semiquantitativi hanno rivelato che l'espressione del loro collagene di tipo I era significativamente inferiore rispetto al gruppo modello (Fig. 4).

Tipo di collagene III

Il collagene di tipo III era debolmente espresso nel gruppo normale e le aree periferiche che circondano il portale e le vene epatiche mostravano una piccola quantità di giallo fine invece di fibre continue (Fig. 5a). Nel gruppo modello, le fibre di collagene mostravano corde larghe e spesse, indicando una forte espressione, localizzate principalmente nelle aree del tessuto portale e fibroso (Fig. 5b). Le fibre di collagene di BJRJ (600 mg/kg) e diversi gruppi di dosaggio di CPhG (125, 250 e 500 mg/kg) erano filamentose e distribuite attorno alla vena centrale e alle aree portali. Rispetto al gruppo modello, le fibre di collagene erano significativamente ridotte, la colorazione era pallida e sottile e la colorazione immunoistochimica era debolmente positiva (Fig. 5c-f). Questi risultati semiquantitativi mostrano che le cellule espresse positivamente nei gruppi di dose positivi e diversi [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 e P Col III=0.037, rispettivamente] erano diversi da quelli del gruppo modello.

TGF- 1

C'era poca espressione di TGIF{{0}} nelle cellule epatiche di ratto normale. L'espressione era limitata a un piccolo numero di cellule interstiziali (Fig. 6a). Nel gruppo modello, l'espressione di TGF- 1 era ampiamente distribuita nell'area portale, negli spazi fibrosi, nelle cellule stellate epatiche, nelle cellule infiammatorie, nella parete sinusoidale e nel citoplasma. Una particolare area portale ha mostrato un'espressione fortemente positiva con colorazione giallo-brunastra (Fig. 6b). C'era una piccola quantità di espressione nell'area portale e setti fibrosi di BJRJ (600 mg/kg) e diversi gruppi di dosaggio di CPhG (125, 250 e 500 mg/kg). L'entità della colorazione positiva in questi gruppi è stata significativamente ridotta rispetto a quella del gruppo modello. La colorazione nelle cellule interstiziali nei setti fibrosi e nel citoplasma delle cellule infiammatorie è stata ridotta (Fig. 6c-f). I risultati semiquantitativi hanno rivelato che BJRJ e diversi gruppi di dosaggio di CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" rispettivamente]="" erano="" significativi="" rispetto="" al="" gruppo="" modello.="" come="" accennato="" in="" precedenza="" nell'articolo,="" il="" tgf-="" 1="" è="" una="" citochina="" importante="" nella="" fisiopatologia="" del="">

fibrosi, stimolando la produzione di matrice extracellulare [19]. Abbiamo dimostrato che il livello di TGF- 1 è aumentato nel gruppo modello in modo coerente con la gravità della fibrosi epatica. I livelli di espressione di TGF- 1 nel fegato erano coerenti con i livelli sierici di TGF- 1. Ciò indica che i CPhG possono ridurre significativamente la fibrosi epatica dovuta all'espressione di TGF- 1 partecipando alla sintesi e alla degradazione dell'ECM. L'espressione di collagene di tipo I, collagene di tipo III e TGF- 1 può rilevare il processo patologico della fibrosi epatica. I loro livelli di espressione nei gruppi di trattamento sono stati significativamente ridotti e hanno dimostrato che i CPhG possono migliorare l'attività della collagenasi, mantenendo l'equilibrio dinamico della sintesi e della degradazione dell'ECM del fegato, ritardando e prevenendo così la formazione della fibrosi epatica.