PARTEⅠ: Nuovi effetti protettivi dell'estratto di Cistanche tubulosa contro la retinopatia degenerativa indotta dalla luce blu a bassa luminanza
Mar 04, 2022
Contatto: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
School of Pharmacy, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Department of Ophthalmology, Taipei Medical University, Taipei, Department of Pharmacology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicina, Università di Medicina di Taipei, Taipei, Ph.D. Programma in ricerca e sviluppo di biotecnologie, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan
Astratto
Contesto/obiettivi:La fototossicità indotta dalla luce a diodi a emissione di luce blu (BLL) svolge un ruolo importante nelle malattie oculari e provoca la degenerazione della retina e l'apoptosi nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano (RPE).Estratto di Cistanche tubulosa (CTE)è una medicina tradizionale cinese con molte proprietà benefiche protettive; tuttavia, pochi studi hanno esaminato i ruoli protettivi oculari della CTE. In questo studio, abbiamo studiato i meccanismi alla base degli effetti della CTE sull'apoptosi indotta da BLL in vitro e in vivo. Metodi: le cellule RPE sono state applicate nell'attuale studio in vitro e la vitalità cellulare è stata determinata da un 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-yl)-2,{{6} }saggio del bromuro di difeniltetrazolio. L'espressione proteica correlata all'apoptosi è stata determinata mediante analisi western blot e colorazione con immunofluorescenza. Ratti Brown Norway sono stati usati per esaminare l'esposizione al BLL disponibile in commercio in vivo. La colorazione dell'ematossilina e dell'eosina, la deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labelling (TUNEL) e i saggi western blot sono stati utilizzati per esaminare la deformazione morfologica della retina. Risultati: CTE ha inibito significativamente il danno RPE indotto da perossido di idrogeno, tertbutil idroperossido, sodio azide e BLL. Inoltre, CTE ha ridotto l'espressione di marcatori apoptotici come la caspasi scissa-3 e la colorazione TUNEL dopo l'esposizione a BLL inattivando le vie apoptotiche, come mostrato tramite la colorazione immunofluorescente. Inoltre, CTE ha inibito la fosforilazione indotta da BLL della chinasi N-terminale c-Jun, delle chinasi 1/2 correlate al segnale extra e p38 nelle cellule RPE. In vivo, la somministrazione orale di CTE ha salvato 60-giorni periodici decrementi indotti dall'esposizione BLL nello spessore retinico e ridotto il numero di cellule TUNEL-positive nel modello di ratto marrone Norvegia. Conclusione: CTE è un potenziale agente profilattico contro la fototossicità indotta da BLL
introduzione
Gli studi sulla degenerazione maculare legata all'età (AMD) hanno riportato che l'8,7% della popolazione mondiale soffre di questa malattia [1]. L'AMD è una malattia neurodegenerativa che causa deformazione dei fotorecettori, atrofia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), apoptosi delle cellule gangliari e perdita della vista centrale nella popolazione anziana e sta diventando un onere sociale globale. L'AMD è classificata in forma secca o umida [2, 3]. I miglioramenti nella tecnologia hanno portato le persone a trascorrere più tempo utilizzando i moderni dispositivi digitali e, di conseguenza, le persone sono esposte alle emissioni di luce blu (BL) per lunghi periodi. Tuttavia, il problema della fototossicità indotta da BL nella retina non è ben studiato. La sovraesposizione a BL a lunghezza d'onda corta (450–495 nm) provoca la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), come i radicali superossido e idrossile, che causano un aumento del consumo di ossigeno e inducono danni al DNA mitocondriale. L'accumulo di ROS provoca stress ossidativo e un ampio accumulo di addotti retinoidi, che danneggiano ulteriormente la retina [4]. La ricerca ha dimostrato che lo stress ossidativo è un fattore di primo piano nella patogenesi dell'AMD secca [5]. Inoltre, l'irradiazione BL diminuisce l'espressione degli enzimi antiossidanti retinici, come la superossido dismutasi e la catalasi, mediando le interazioni della proteina Bax/Bcl-2 e promuovendo la produzione endogena di ROS. Pertanto, le cellule RPE e i mitocondri del segmento esterno dei fotorecettori soffrono di lesioni indotte dall'irradiazione BL [6, 7]. Oltre alla generazione di ROS, l'irradiazione BL attiva le protein chinasi attivate da mitogeni (MAPK), che svolgono un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare e nell'apoptosi. le proteine pro-apoptotiche correlate all'apoptosi dipendenti dai mitocondri, come Bax e caspase-3, sono attivate dall'irradiazione della luce a diodi emettitori di BL (BLL) tramite la c-Jun N-terminal chinasi (JNK) e le vie p38 in RPE e cellule gangliari retiniche [8]. Inoltre, la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)/Akt e le vie antiossidanti dipendenti dal fattore 2 (Nrf2) correlate al fattore nucleare eritroide 2-sono componenti del sistema di difesa delle cellule RPE [{{34} }].
Estratto di Cistanche tubulosa (CTE)contiene derivati del glicoside feniletanoide ed è stato usato come medicina tradizionale cinese per decenni. Echinacoside, acteoside e isoacteoside sono i tre principali composti attivi della CTE caratterizzati da proprietà neuroprotettive, di potenziamento della memoria, immunoregolazione e anti-fibrosi epatica [13, 14]. L'echinacoside è uno scavenger di ROS e protegge dall'apoptosi indotta dallo ione 1-metil-4- fenilpiridinio (MPP plus ) in modelli animali di malattia di Parkinson [15, 16]. L'acteoside protegge dalla neurotossicità{10}}indotta dall'amiloide e riduce l'infiammazione stimolata dai lipopolisaccaridi, attribuibile alla traslocazione di Nrf2 dal citoplasma al nucleo e al legame con gli elementi di risposta antiossidanti. Le attuali terapie disponibili per l'AMD umida, come pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab e aflibercept, sono utilizzate per inibire l'eccessiva angiogenesi [17, 18]. Tuttavia, non esistono trattamenti efficaci per l'AMD secca, a causa delle molteplici complicanze patologiche di questa malattia.
In questo studio, dimostriamo gli effetti protettivi della CTE nelle cellule RPE e nei ratti Brown Norway (BN). Inoltre, abbiamo applicato l'esposizione BLL a bassa luminanza a lungo termine a modelli sia in vitro che in vivo per valutare gli effetti protettivi della CTE. Abbiamo scoperto che CTE ha ridotto l'espressione delle proteine correlate all'apoptosi dopo l'esposizione a BLL. Inoltre, CTE ha ridotto il numero di cellule terminali deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labelling (TUNEL) - cellule positive nella retina dei ratti BN dopo l'esposizione a lungo termine a BLL a bassa luminanza. Questo studio fornisce ulteriori approfondimenti sui nuovi effetti anti-apoptotici della CTE e informazioni su una nuova strategia per il trattamento della degenerazione retinica.
Estratto di Cistanche tubulosa (CTE): glicoside feniletanoide
Materiali e metodi
Sostanze chimiche e prodotti
CTE è stata generosamente fornita da Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Taiwan). I kit di rilevamento della morte cellulare in situ (cat. n. 11-684-817-910) sono stati acquistati da Roche (Mannheim, Germania).
Coltura cellulare RPE
Le cellule RPE (ARPE{{0}} e ATCC® CRL-2302™) sono state acquistate dall'American Type Culture Collection (Manassas, VA) e coltivate nel mezzo Eagle's modificato di Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) integrato con l'10 percento di siero bovino fetale in un'atmosfera umidificata con il 5 percento di CO2 a 37 gradi . Le cellule ARPE-19 al passaggio 19–30 sono state mantenute su piastre di coltura cellulare di 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgio). Dopo il passaggio con acido tripsina-etilendiammina tetraacetico allo 0,05 percento (Gibco), le cellule sono state ripiagate con un rapporto 1:4. Prima del test, le cellule ARPE-19 sono state seminate su 48-piastre a pozzetti (Orange Scientific) per analisi di vitalità cellulare a una densità di 1,0 × 105 cellule/mL e su piastre di 6-cm (Orange Scientific ) per analisi di western blotting a una densità di 2,0 × 105 cellule/mL per 24 ore. Dopo che le cellule ARPE-19 hanno raggiunto l'80% di confluenza, sono stati eseguiti i seguenti esperimenti.
Trattamento farmacologico e test di vitalità cellulare
Le cellule RPE al passaggio 19-30 sono state seminate su 48-piastre a pozzetti e co-trattate per 24 ore con diverse concentrazioni di CTE, perossido di idrogeno (H2O2), terz-butil idroperossido (t-BHP) e sodio azide ( NaN3). Le cellule sono state quindi coltivate con 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) a una concentrazione finale di 1 mg /mL e incubato per 30 min. A ciascun pozzetto è stato quindi aggiunto dimetilsolfossido (200 µl) per dissolvere le cellule. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di test di immunoassorbimento enzimatico dello spettrofotometro Sunrise™ (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). I valori sono stati corretti per l'assorbanza di fondo sottraendo gli spazi vuoti appropriati. I dati provengono da cinque saggi indipendenti.
Protocollo di esposizione BL in vitro
La sorgente luminosa e le piastre cellulari sono state poste a 25 cm di distanza, come descritto nel nostro precedente studio [19]. La luminanza è stata misurata con un esposimetro (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL ha raggiunto il picco a 460 nm (60 lux) per il tempo indicato (0–48 h), a seconda del disegno sperimentale.
macchia occidentale
Dopo 0-48-h co-trattamento con esposizione a CTE e BLL, le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata e risospese in un tampone di lisi del test di radioimmunoprecipitazione (1% Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etilenglicole-bis (-amminoetiletere)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico, 1 mM NaF e cocktail di inibitori della proteasi/fosfatasi). Il lisato cellulare è stato ottenuto mediante centrifugazione a 12, 000 × g per 35 minuti e il surnatante è stato raccolto per determinare le concentrazioni proteiche tramite il reagente Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Uguali quantità di campioni proteici sono state separate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 10-12% e quindi trasferite su una membrana di polivinilidene difluoruro. Dopo che la membrana è stata bloccata con latte scremato al 5% e incubata in soluzione fisiologica tamponata con Tris con Tween 20 (TBST) per 1 ora, è stato eseguito l'immunoblotting con anticorpi primari specifici per caspasi scissa-3, fosfo-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, fosfo-extracellulare chinasi correlata al segnale (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, proteina associata a Fas con dominio della morte (FADD), caspasi-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligando (Abcam, Cambridge, Regno Unito) e b-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Le macchie sono state quindi incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (1:6000 in TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzando un kit di chemiluminescenza potenziato (Millipore, Billerica, MA), l'intensità delle bande su ciascuna macchia è stata analizzata con il software Image J dopo la normalizzazione in b-actina.
Immunofluorescenza
Le cellule RPE sono state fissate con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti. Triton X-100 in PBS (0,2 percento) è stato quindi aggiunto alle cellule per 15 minuti, seguito da siero bovino fetale al 5% in PBS per 30 minuti; le cellule sono state quindi incubate con un anticorpo anti-caspasi{9}} a un rapporto 1:250 per 24 ore (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Un anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra (Dylight 594) è stato utilizzato con un rapporto di 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). I nuclei cellulari sono stati colorati con 4′-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). I cambiamenti nella fluorescenza sono stati osservati con un sistema di imaging al microscopio spettrale confocale laser CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Singapore).
Colorazione TUNEL
I frammenti di DNA, che possono essere rilevati da un test TUNEL, sono un segno distintivo significativo dell'apoptosi. Abbiamo utilizzato un kit di rilevamento della morte cellulare in situ (Cat. No. 11-684-817-910; Roche) per misurare la morte cellulare RPE programmata per apoptosi secondo il protocollo del produttore. In breve, abbiamo fissato le cellule RPE con paraformaldeide al 4% e abbiamo etichettato le rotture del filamento di DNA in una reazione enzimatica per rilevare le cellule TUNEL-positive, che si presentavano con una colorazione verde fluorescente. Le cellule colorate sono state quindi scansionate e analizzate con un sistema di imaging Tissue FAXS-plus (TissueGnostics, Vienna, Austria). Diecimila eventi sono stati contati nella regione RPE gated e abbiamo analizzato le immagini per il numero di cellule TUNEL-positive con il software TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).
Esperimenti sugli animali
Ratti maschi BN (300–350 g di peso corporeo) sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) e tenuti per 2–3 mesi. I ratti sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12-h/12-h a 26 ± 1 grado, rapporto di umidità relativa del 35–47% e accesso ad libitum all'acqua e al cibo. I ratti non trattati sono stati mantenuti al buio per fungere da controlli. I protocolli di studio sono stati approvati dall'Institutional Animal Care Use Committee della Taipei Medical University (numero di approvazione: LAC-2016-0442). Tutte le procedure sperimentali che comportano l'uso di animali sono conformi alle dichiarazioni dell'Associazione per la ricerca sulla vista e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca sperimentale oftalmica e visiva.
Modello di ratto indotto da BLL di degenerazione retinica
Abbiamo utilizzato un modello periodico di degenerazione retinica indotto dall'esposizione BLL a lungo termine a bassa luminanza, come descritto nel nostro studio precedente [19]. In breve, i ratti BN sono stati divisi in tre gruppi: un gruppo di controllo, che è stato tenuto al buio; un gruppo esposto a BLL, che è stato esposto a BLL periodico al buio senza dilatazione della pupilla (460 nm, 150 lux) per 3 ore al giorno per 60 giorni; e un gruppo trattato con CTE più esposto a BLL, che è stato pretrattato con CTE (100 mg/kg di peso corporeo) per 14 giorni e quindi co-trattato con esposizione periodica al BLL per 3 ore al giorno per 60 giorni. Tutti i ratti sono stati riportati nelle colonie animali e al termine del periodo sperimentale è stato ripreso il normale ciclo luce/buio (250 lux, 12 h/12 h).
analisi statistica
Differenze significative sono state calcolate utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test post hoc di Tukey e dal test di confronti multipli. La significatività statistica è stata determinata dai valori p di<>
Cistanche tubulosa prodotti
Risultati
CTE protegge le cellule RPE dai danni da stress ossidativo
Per valutare la citotossicità della CTE tramite il test MTT, alle cellule RPE sono state applicate diverse concentrazioni di CTE ({{{{20}}}}–500 ug/mL). Il trattamento con CTE non ha avuto effetti tossici evidenti sulla vitalità cellulare RPE a nessuna delle concentrazioni testate (Fig. 1A). Pertanto, negli esperimenti successivi sono stati utilizzati 50 e 100 ug/mL di CTE. Per studiare gli effetti anti-apoptotici della CTE, diversi induttori ossidativi (H2O2, t-BHP e NaN3) sono stati co-somministrati con CTE alle cellule RPE per 24 ore. H2O2, NaN3 e t-BHP hanno ridotto la vitalità cellulare e danneggiato le cellule RPE in modo dose-dipendente (barre tagliate, Fig. 1B, 1C e 1D); la vitalità cellulare era significativamente inferiore nelle cellule trattate con 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 e 0,3 mM t-BHP rispetto al gruppo di controllo.
Tuttavia, il co-trattamento con 50 e 100 ug/mL di CTE ha attenuato il danno cellulare RPE indotto da H2O2-, NaN3- e t-BHP e ha invertito la diminuzione della vitalità cellulare (barre nere, Fig 1B, 1C e 1D). I dati di cui sopra suggeriscono che CTE salva le cellule RPE dal danno da stress ossidativo.
CTE inibisce la morte cellulare RPE indotta da BLL
Nel nostro studio precedente, abbiamo scoperto che BLL è citotossico per le cellule RPE, il che era attribuibile ai cambiamenti nell'espressione di Bcl-2 e Bax. Nel presente studio, abbiamo ulteriormente esaminato gli effetti protettivi della CTE sul danno cellulare RPE indotto da BLL. Abbiamo posizionato due piastre LED elettriche blu in un'incubatrice per colture cellulari. La distanza tra la sorgente luminosa e le piastre cellulari era di 25 cm e l'intensità BLL era di 60 lux, misurata con un esposimetro (Fig. 2A). Un test MTT ha dimostrato che l'esposizione al BLL per diversi periodi di tempo (6-48 h) ha causato la morte delle cellule RPE in modo dipendente dal tempo (Fig. 2B). Le riduzioni indotte da BLL della vitalità cellulare dopo 24 e 48 ore sono state significativamente attenuate quando le cellule sono state co-trattate con CTE (100 ug/mL) (Fig. 2C). Questi dati suggeriscono che CTE protegge le cellule RPE dalla fototossicità indotta da BLL.
CTE inibisce l'apoptosi indotta da BLL nelle cellule RPE regolando le vie Bcl-2/Bax e Fas/FasL
Sulla base dei potenziali effetti protettivi della CTE nelle cellule RPE, abbiamo ulteriormente studiato il possibile coinvolgimento della CTE in questo processo. Sono state esaminate due vie di segnalazione apoptotica, ovvero le vie Bax/Bcl{{0}} e Fas/Fas ligando (FasL) e le relative proteine (p. es., pro-caspasi-8 e pro-caspasi -3; Fig. 3A e 3B). È stato riscontrato che l'esposizione BILL (6–48 h) sovraregola l'espressione proteica di Bax/Bcl-2, FasL e FADD in modo dipendente dal tempo (Fig. 3A). Inoltre, BLL ha sottoregolato l'espressione proteica di procaspasi-3 e procaspasi-8, risultando in più forme di scissione di caspasi-3 e caspasi-8 dopo l'esposizione a BLL, il che è coerente con il nostro studio precedente [19]. Per valutare ulteriormente gli effetti protettivi della CTE, sono state applicate diverse concentrazioni di CTE alle cellule RPE esposte a BLL (Fig. 3B). Dopo 48-h esposizione al BLL, CTE (50 µg/mL) ha ridotto il rapporto Bax/Bcl-2. Inoltre, CTE (100 µg/mL) ha ridotto l'espressione proteica di FasL e FADD, ma ha aumentato significativamente i livelli di procaspasi-8 e procaspasi-3 (Fig. 3C e 3D). Gli studi hanno dimostrato che l'attivazione della caspasi-3 è un marker di apoptosi nelle cellule RPE [20]. Per confermare ulteriormente gli effetti protettivi della CTE, abbiamo eseguito la colorazione immunofluorescente della caspasi scissa-3. È stato riscontrato che l'esposizione a BILL per 48 h induce la scissione e la traslocazione della caspasi-3 nel nucleo, con conseguente apoptosi delle cellule RPE (frecce gialle, Fig. 4A). Tuttavia, quando le cellule esposte a BLL sono state co-trattate con CTE (100 μg/mL), l'espressione indotta da BLL della caspasi scissa-3 è stata inibita. Per comprendere meglio gli effetti anti-apoptotici della CTE, abbiamo utilizzato la colorazione TUNEL per rilevare frammenti di DNA nelle cellule RPE. Dopo 48-h esposizione BLL, le cellule TUNEL-positive sono aumentate da 1,78 ± 0,36 percento a 23,82 ± 0,33 percento; questo effetto è stato attenuato dal co-trattamento con CTE (da 23,82 ± 0,33 percento a 2,22 ± 0,11 percento; Fig. 4B, 4C e 4D). Questi risultati indicano che il trattamento con CTE protegge fortemente le cellule RPE dall'apoptosi indotta da BLL mediando le vie Bax/Bcl-2 e FasL/FADD.
CTE inibisce la fosforilazione indotta da BLL delle proteine di risposta allo stress nelle cellule RPE
Precedenti studi hanno dimostrato che le vie MAPK, come ERK, JNK e p38 MAP, sono attivate nelle cellule RPE e nella retina dopo l'esposizione alla luce ultravioletta o BL [21, 22]. Pertanto, per studiare gli effetti regolatori della CTE sulla via di risposta allo stress MAPK dopo l'esposizione a BLL, è stato applicato CTE di 100 μg/mL alle cellule RPE con diversi tempi di esposizione a BLL (Fig. 5A). L'analisi Western blot ha indicato che ERK, JNK e p38 fosforilati sono stati attivati dopo l'esposizione a BLL, ma significativamente inibiti in seguito al co-trattamento con CTE nelle cellule RPE (Fig. 5B). I risultati di cui sopra indicano che CTE inibisce il danno cellulare RPE indotto da BLL, che potrebbe essere associato all'inibizione di MAPK nelle cellule RPE.
CTE salva il danno retinico indotto da BLL dopo un'esposizione periodica a lungo termine in un modello di ratto
Per valutare gli effetti protettivi della CTE, abbiamo esposto i ratti BN a un'esposizione a lungo termine a BLL per 60 giorni e abbiamo valutato gli effetti della CTE. Come mostrato nello schema presentato in Fig. 6A, i ratti BN sono stati divisi in tre gruppi: gruppo di controllo, gruppo esposto a BLL e gruppo CTE più BLL (Fig. 6A). Nel gruppo CTE più BLL, i ratti BN sono stati continuamente integrati con CTE (100 mg/kg di peso corporeo) mediante sonda gastrica una volta al giorno per 14 giorni prima dell'esposizione al BLL. Il giorno 0, i ratti BN sono stati co-trattati con CTE (100 mg/kg di peso corporeo) ed esposti a BLL per 3 ore al giorno per 60 giorni. Dopo 60 giorni di esposizione al BLL, gli animali sono stati sacrificati per l'analisi western blot e la colorazione immunoistochimica. Nel gruppo CTE più BLL, l'espressione della proteina procaspasi-3 negli omogenati dell'occhio di ratto era maggiore dopo il trattamento con CTE rispetto al gruppo BLL (Fig. 6B e 6C). Questi dati illustrano che la CTE previene la fototossicità retinica e l'apoptosi indotta da BLL a bassa luminanza a lungo termine inibendo l'attivazione della caspasi scissa-3. La colorazione immunoistochimica ha fornito ulteriori prove sugli effetti protettivi della CTE sulla struttura e sulle vie fisiologiche della retina (Fig. 7). Inoltre, dopo l'esposizione al BLL abbiamo scoperto che lo strato neuronale interno era diminuito e abbiamo osservato deformazioni morfologiche allo strato neuronale esterno (ONL), incluso il segmento interno/segmento esterno sia nella retina centrale che periferica, il che è coerente con il nostro studio precedente ( Fig. 7B). È importante sottolineare che la CTE ha impedito la deformazione delle cellule RPE, il danno cellulare neuronale e l'assottigliamento generale della retina nel gruppo CTE più BLL (Fig. 7C). Inoltre, non abbiamo osservato cellule TUNEL-positive nella retina centrale e periferica di ratti normali (Fig. 8Ab e 8Bb). Al contrario, dopo l'esposizione al BLL per 60 giorni, le cellule TUNEL-positive sono state rilevate frequentemente nell'ONL della retina centrale e periferica (Fig. 8Ae e 8Be). La colorazione DAPI dell'ONL della retina centrale è stata notevolmente ridotta nel gruppo BLL (Fig. 8Ad). Tuttavia, la presenza di cellule TUNEL-positive è stata attenuata e la colorazione DAPI della retina centrale e periferica ONL è stata aumentata nel gruppo CTE più BLL (Fig. 8Ai e 8Bi).
Cistanche tubulosa prodotti