Parte 1: Il verbascoside protegge le cellule pancreatiche contro lo stress da ER
Mar 05, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, più , Paola Marciani 1, più , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 e Carla Perego 1,*
Astratto:
Prove epidemiologiche sostanziali indicano che una dieta ricca di polifenoli protegge dallo sviluppo del diabete di tipo 2. Il glicoside feniletanoideverbascoside/acteoside, un diffuso composto vegetale polifenolico, ha diverse proprietà biologiche tra cui spiccate attività antiossidanti, antinfiammatorie e neuroprotettive. Lo scopo di questa ricerca era di testare i possibili efetti diverbascosidesulle cellule pancreatiche, un bersaglio mai testato prima. Sono state incubate cellule di topo e umaneverbascoside(0.8–16 uM) per un massimo di cinque giorni e una combinazione di tecniche biochimiche e di imaging è stata utilizzata per valutare la sopravvivenza e la funzione delle cellule in condizioni di induzione dello stress del reticolo endoplasmatico (ER) normale o. Abbiamo trovato un effetto protettivo dose-dipendente diverbascosidecontro lo stress ossidativo nelle cellule clonali e umane. Studi meccanicistici hanno rivelato che il polifenolo protegge le cellule dalle disfunzioni mediate dallo stress ER, modulando l'attivazione del ramo della proteina chinasi RNA-like reticolo chinasi endoplasmatico (PERK) della risposta proteica spiegata e promuovendo la dinamica mitocondriale. Di conseguenza, in queste cellule è stata rilevata una maggiore vitalità, funzione mitocondriale e contenuto di insulina. Questi studi forniscono la prova cheverbascosideaumenta la capacità delle cellule di far fronte allo stress da ER, un importante contributo alla disfunzione e all'insufficienza cellulare nelle condizioni diabetiche e supporta il potenziale terapeutico del verbascoside nel diabete.
Parole chiave:
verbascoside; polifenoli; cellule produttrici di insulina; diabete; UPR; lo stress ossidativo; ER-stress; VANTAGGIO; antinfiammatorio; mitocondri
1. Introduzione
Il diabete è una malattia cronica che colpisce centinaia di milioni di persone [1]. Un'eziologia diversa caratterizza il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D), entrambi caratterizzati dalla mancanza di insulina [2]. L'insulina regola la concentrazione di glucosio plasmatico stimolando l'assorbimento di glucosio nei muscoli e nelle cellule adipose e modulando il metabolismo del glucosio nel fegato. La disponibilità di nutrienti, gli ormoni e gli input neurali regolano la secrezione di insulina pancreatica e mantengono le concentrazioni di glucosio nel sangue entro un intervallo fisiologico [3-5]. Pertanto, la disfunzione cellulare porta al diabete caratterizzato da iperglicemia a digiuno.
Il T2D è una condizione progressiva in cui l'insulino-resistenza e le disfunzioni cellulari sono collegate tra loro e recenti evidenze hanno suscitato interesse nel ruolo primario critico delle cellule nello stato iperglicemico [6,7]. Nei soggetti obesi non diabetici le cellule compensano la resistenza all'insulina con un aumento della secrezione dell'ormone. Tuttavia, in alcuni soggetti, con il peggioramento delle loro condizioni, l'insulinomia diminuisce e il livello di glucosio sale all'iperglicemia [8,9].
Il glucosio è il modulatore più importante delle funzioni cellulari. La stimolazione del glucosio influenza la regolazione dei geni e l'espressione delle proteine coinvolte in molte funzioni cellulari come la glicolisi, la sintesi e la secrezione dell'insulina [10]. La secrezione di insulina indotta dal glucosio si basa sul metabolismo ossidativo per produrre adenosina trifosfato (ATP) e fisiologicamente viene prodotto un basso livello di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Tuttavia, le -cellule non sono molto ben dotate di enzimi scavenger e questa debolezza le rende molto suscettibili allo stress ossidativo [11,12]. Con l'aumento dello stress ossidativo, la produzione di insulina da parte delle cellule diminuisce e le cellule producono citochine che innescano il danno cellulare attraverso l'infiammazione e l'apoptosi [13]. È interessante notare che, sebbene la ridotta massa cellulare sia stata precedentemente attribuita alla morte cellulare, studi recenti suggeriscono un ruolo importante della dediferenziazione cellulare [14,15]. È diventato chiaro che diverse fasi portano al T2D. Gli insulti metabolici e ossidativi causano stress del reticolo endoplasmatico (ER) che porta al declino della sintesi e della secrezione di insulina, i processi infiammatori seguono il rilascio di citochine e la perdita di cellule può verificarsi attraverso l'apoptosi e la dediferenziazione. Questa conoscenza è fondamentale per sviluppare adeguate strategie di trattamento, poiché lo stress ossidativo e l'infiammazione possono essere contrastati e la plasticità delle cellule pancreatiche consente la possibilità di ripristinare le cellule staminali in cellule come dimostrato nei topi [16].
Recentemente, la vulnerabilità delle cellule allo stress ossidativo ha spinto con successo l'uso di antiossidanti nella dieta per prevenire il diabete [17]. Tra gli alimenti antiossidanti più interessanti, l'olio d'oliva è noto per le sue proprietà benefiche fin dagli antichi greci. L'olio d'oliva contiene una buona quantità di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e diversi polifenoli come tirosolo, idrossitirosolo, oleuropeina e verbascoside.
Verbascoside, noto anche come acteoside, è un glicoside feniletanoide estratto da Olea europea, piante della specie Verbascum e altre 23 famiglie di piante [18–20]. Può anche essere ottenuto da sottoprodotti dell'olio d'oliva (è arricchito nelle acque reflue del frantoio derivate dalla lavorazione del frutto delle olive) o essere prodotto mediante approcci di ingegneria metabolica e biologia sintetica [21].
Non sono stati ancora riportati dati sulla biodisponibilità del verbascoside nell'uomo. Studi condotti su topi, cellule SKBR3 e Caco-2 suggeriscono che potrebbe essere possibile che il verbascoside non metabolizzato attraversi la barriera intestinale, circoli nel plasma sanguigno ed eserciti effetti antiossidanti [20,22,23]. A differenza della maggior parte dei polifenoli vegetali, il verbascoside agisce principalmente sulle cellule attraverso la modulazione della trascrizione genica di una varietà di enzimi e fattori regolatori, con effetti antiossidanti e antinfiammatori [24-30].
Sebbene siano noti molti effetti benefici del verbascoside per la salute umana, non ci sono dati sui suoi effetti sulle cellule pancreatiche. Poiché lo stress ossidativo e l'infiammazione sono alla base della patogenesi del T2D, abbiamo studiato se il trattamento con verbascoside potrebbe migliorare la vitalità delle cellule e
funzione in condizioni che inducono stress ER e abbiamo caratterizzato i meccanismi molecolari della sua azione. I nostri dati rivelano che il verbascoside previene lo stress ossidativo e l'infiammazione delle cellule modulando l'attivazione della risposta proteica spiegata e promuovendo la dinamica mitocondriale, con conseguente aumento della vitalità cellulare e del contenuto di insulina.
2. Materiali e metodi
2.1. Cultura cellulare e materiali
Cellule tc3 di topo (gentilmente fornite dal Prof. Hanahan—Dipartimento di Biochimica e Biofisica, Università della California, San Francisco, CA [31]) sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italia) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale di vitello inattivato al calore (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italia), 1% (v/v) di penicillina-streptomicina (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italia) e 1% (v/v) L-glutammina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italia). Gli isolotti umani di Langerhans sono stati isolati a Milano (Niguarda Ca' Granda) da donatori cadaverici multiorgano secondo la procedura descritta da Ricordi et al. [32]; sono stati coltivati in terreno di coltura RPMI contenente 5,5 mmol/L di glucosio, 10% di siero bovino fetale inattivato al calore, 0,7 mM di glutammina, 50 unità/mL di penicillina e 50 ug/mL di streptomicina (EuroClone, SpA, Pero MI, Italia). Sono state utilizzate quattro diverse preparazioni di isole, la purezza delle isole era dell'80 ± 10 percento. L'isolamento degli isolotti e gli studi sugli isolotti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'ospedale Niguarda Ca' Granda di Milano (11.12.2009). Le cellule tc3 sono state trattate con 0,8, 1,6 e 16 uM di verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), acido cafeico e idrossitirosolo (gentile dono del Prof. Dell'Agli, Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, Università degli Studi di Milano, Milano, Italia) in terreno RPMI completo per 5 giorni, mentre isole umane con verbascoside 16 uM. Come controlli sono state utilizzate cellule trattate con metanolo/etanolo. Al fine di indurre stress ossidativo, le cellule sono state trattate con H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM in mezzo RPMI completo per 20 minuti prima dell'analisi, mentre il trattamento con tunicamicina 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) per 7 ore è stato eseguito per indurre stress ER.
2.2. Rilevazione della vitalità cellulare mediante test MTT
Le cellule sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti e cinque giorni dopo il trattamento con verbascoside sono state incubate con 0,5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol{{7} }yl){8}},5-diphenyltetrazolio bromuro) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) per 4 ore in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 oC. Dopo l'incubazione, le cellule sono state risospese delicatamente in 100 ul di DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italia) e l'assorbanza a 540 nm è stata rilevata con un lettore di micropiastre (Benchmark, lettore di micropiastre, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i dati sono stati espressi come aumento di piega rispetto ai campioni di controllo.
2.3. Rilevazione della morte cellulare mediante citometria a flusso
Cinque giorni dopo l'incubazione con 16 uM di verbascoside, le cellule sono state staccate per 7 minuti di incubazione con tripsina/EDTA, raccolte e centrifugate; il pellet è stato risospeso delicatamente in sali bassi di tampone fosfato. Le cellule sono state colorate con conteggio MuseTM e reagente di vitalità (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) seguendo il protocollo del produttore e analizzate mediante citometria a flusso. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i dati sono stati espressi come percentuale di cellule morte sul totale.
2.4. Generazione ROS
I ROS intracellulari sono stati valutati con DCFDA (2/,7/-diclorofuoresceina diacetato) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), una sonda permeabile alla membrana che diventa fluorescente quando legata a ROS [34]. Le cellule tc3 sono state precaricate con 15 uM DCFDA in tampone Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 e 2 mM CaCl2)
integrato con 11 mM di glucosio per 1 ora a 37 oC. Il contenuto di ROS è stato rilevato per 30 minuti sia in condizioni basali che di stress con un lettore di micropiastre (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Svizzera). I valori medi e le deviazioni standard sono stati basati su tre esperimenti indipendenti.
2.5. macchia occidentale
Le cellule tc3 sono state raccolte e solubilizzate in bufer RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0,5% deossicolato) aggiunto con aprotinina (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) e inibitori di Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) per 40 min a 4 oC. La concentrazione proteica è stata determinata mediante saggio Bradford [35] utilizzando il reagente Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug di proteine sono state risolte con SDS-PAGE al 10% e trasferite su membrane di nitrocellulosa (Millipore, Burlington MA, USA). Gli anticorpi primari sono stati applicati per 2 ore nel tampone bloccante con il 5% di latte scremato o soluzioni di BSA al 5%; sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: topo anti{24}}actina (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), topo anti-acroleina (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), topo anti-BIP (gentile dono del Prof. Borgese Nica, Istituto di Neuroscienze, CNR, Milano, Italia), coniglio anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), topo anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), coniglio anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), topo anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), coniglio anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), coniglio anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), pecora anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), coniglio anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), coniglio anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) e coniglio anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Gli anticorpi secondari coniugati con HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) sono stati utilizzati con diluizione 1:5000. Le proteine sono state rilevate utilizzando il sistema di rilevamento ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italia) utilizzando il sistema Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Germania) e la densità di banda è stata quantificata dal software Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i dati sono stati espressi come aumento di piega rispetto ai campioni di controllo.
2.6. Potenziale della membrana mitocondriale
Le cellule tc3 e le isole umane di Langerhans sono state incubate con 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italia) o 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milano, Italia) per 30 minuti a 37 oC; Le intensità di fluorescenza sono state rilevate con il lettore di micropiastre TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em per MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em per MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Svizzera). Le cellule sono state incubate con 500 uM di H2O2 per 20 minuti e l'intensità della florescenza è stata rilevata come descritto in precedenza. I valori medi e le deviazioni standard sono stati basati su tre diversi esperimenti.
2.7. Morfologia e dinamica mitocondriale
Le cellule tc3 sono state precaricate con 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italia) in tampone Krebs-Ringer di glucosio 11 mM a 37 oC per 30 min. I campioni sono stati posizionati in una camera di imaging e i campi casuali sono stati ripresi utilizzando il filtro rodano del microscopio Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Germania). Per valutare la morfologia mitocondriale, sono stati analizzati i seguenti parametri utilizzando il software di analisi di particelle ImageJ: area (um2), circolarità (4mArea2/Perimetro2) e diametro massimo di Feret (um) [37].
Per gli esperimenti time-lapse, l'imaging unicellulare è stato eseguito a 1 fotogramma al secondo per 30 s in condizioni di stress ossidativo o di controllo. Per misurare la distanza cumulativa mitocondriale (um2), le immagini sono state prima corrette per lo sbiancamento fotografico, quindi i video sono stati analizzati utilizzando un plug-in Image-Pro Plus esistente (tracciamento degli oggetti) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Fino a dodici
le cellule sono state riprese in tre esperimenti indipendenti e i dati sono stati presentati come valori medi e deviazioni standard.
2.8. Secrezione di insulina
Isole umane isolate di Langerhans sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 20 isole per pozzetto e, dopo 5 giorni di trattamento, il contenuto di insulina e la secrezione sono stati misurati nel basale (glucosio 3,3 mM) e stimolati (glucosio 16,7 mM ) condizioni mediante un test immunologico ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Svezia).
2.9. Analisi statistiche
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism 8.0 su repliche biologiche indipendenti. Le medie tra due gruppi sono state valutate utilizzando il test t di Student a due code e un valore p < 0.05="" è="" stato="" preso="" come="" prova="" di="" significatività="" statistica.="" le="" medie="" tra="" tre="" o="" più="" gruppi="" sono="" state="" confrontate="" mediante="" l'analisi="" della="" varianza="" (anova),="" seguita="" da="" più="" test="" di="" confronto="" post-hoc="" (tukey).="" il="" test="" statistico="" utilizzato,="" i="" valori="" p="" esatti="" e="" il="" numero="" di="" repliche="" (n)="" sono="" indicati="" nelle="" singole="" legende="" delle="" figure.="" le="" barre="" di="" errore="" nelle="" figure="" mostrano="" la="" media="" ±="" sd="" o="" la="" media="" ±="" se,="" come="">
3. Risultati
3.1. Il verbascoside migliora la vitalità cellulare
Poiché non c'erano dati sull'effetto del verbascoside sulle cellule, abbiamo eseguito il test MTT per valutare la vitalità cellulare e, come mostrato nella Figura 1A, è stata osservata una tendenza dose-dipendente positiva. Quindi, per ulteriori studi, abbiamo selezionato la concentrazione di 16 uM che statisticamente si è dimostrata efficace per migliorare la vitalità delle cellule. Mediante la citometria a flusso abbiamo studiato l'impatto di cinque giorni di incubazione del verbascoside sulla sopravvivenza delle cellule in condizioni basali e dopo 2{{21} } min di pretrattamento con 500 uM H2O2. Nella condizione basale, il verbascoside non ha alterato la sopravvivenza cellulare, suggerendo che l'aumentata vitalità cellulare osservata nel test MTT potrebbe essere dovuta a una migliore attività mitocondriale. Considerando che, dopo l'esposizione a H2O2, il pretrattamento con 16 µM di verbascoside ha ridotto significativamente la morte cellulare indotta da stress ossidativo (Figura 1B, C). Il verbascoside è una molecola complessa che può essere modificata da enzimi idrolizzanti [18]. Per verificare se i metaboliti del verbascoside potessero essere responsabili dell'effetto protettivo osservato, le cellule tc3 sono state trattate con idrossitirosolo e acidi cafeico (0,8 e 16 uM) per 5 giorni. Entrambi i metaboliti non hanno migliorato la vitalità cellulare, al contrario è stato rilevato un effetto citotossico, più rilevante dopo l'esposizione a H2O2, per la concentrazione di 16 uM (Figura S1). Questa scoperta dimostra che il verbascoside e non i suoi metaboliti esercita l'effetto protettivo nei confronti del trattamento con H2O2.
3.2. Il verbascoside modula l'omeostasi redox ed esercita un effetto antinfiammatorio nelle cellule
Abbiamo dapprima confermato nelle cellule tc3 gli effetti antinfiammatori e antiossidanti del verbascoside osservati in altri tipi cellulari [24,29,34]. L'attività di scavenging del verbascoside ROS è stata valutata con cellule tc3 marcate con la sonda cellulare permeabile specifica per ROS DCFDA (2/,7/-diclorofuoresceina diacetato). Come mostrato nella Figura 2A, è stata rilevata una significativa diminuzione del contenuto di ROS dopo il pretrattamento con verbascoside, sia in condizioni di stress basale che ossidativo.
Le analisi Western blot hanno rivelato una significativa diminuzione dei marcatori dello stress ossidativo acroleina e dell'espressione 4-idrossinonenale (HNE) nelle cellule trattate con verbascoside. Inoltre, abbiamo riscontrato un aumento dell'espressione della superossido dismutasi (SOD1), suggerendo che il verbascoside esercita la sua attività antiossidante probabilmente con due meccanismi diversi, direttamente come scavenger di ROS e indirettamente inducendo l'espressione di enzimi antiossidanti (Figura 2B, C).
L'effetto antinfiammatorio del verbascoside sulle cellule è stato valutato valutando l'attivazione della via NFKB, la più importante via pro-infiammatoria in queste cellule [38]. Con l'analisi western blot abbiamo riscontrato una ridotta espressione dell'inibitore del fattore nucleare kappa B (IKB ) e del fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer (NFKB) e una significativa diminuzione della fosforilazione di NFKB nelle cellule pretrattate, a sostegno dell'ipotesi di l'efficacia del verbascoside per ridurre l'infiammazione cellulare (Figura 2D,E).
3.3. Il verbascoside modula la risposta proteica spiegata delle cellule
Abbiamo quindi analizzato in profondità il meccanismo molecolare attraverso il quale il verbascoside esercita ruoli antiossidanti e antinfiammatori, concentrandoci sul reticolo endoplasmatico che sta emergendo come un sensore chiave dei segnali metabolici e di stress nelle cellule. In condizioni di stress, l'organello monta una risposta omeostatica, nota come risposta proteica spiegata (UPR), volta a recuperare la funzione ER; tuttavia, l'eccessiva attivazione di questa via provoca l'apoptosi [39,40].
I marker di un aumento dello stress ER sono la sovraregolazione delle proteine chaperon e l'attivazione della risposta UPR. L'analisi Western blotting delle cellule trattate con verbascoside ha rivelato livelli ridotti delle due chaperonine heat shock protein 70 (HSP70) e della proteina immunoglobulinica legante (BIP) (Figura 3A, B). Inoltre, sono state rilevate una significativa riduzione dell'espressione della proteina chinasi RNA-like ER chinasi (PERK) e una ridotta fosforilazione del suo efettore a valle, il fattore di inizio della traduzione eucariotica 2 (eIF2).
