Parte 2: Sortilina carbamilata associata a calcificazione cardiovascolare in pazienti con disea renale cronica

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La sortilina carbamilata altera il legame del ligando

Sortilin è un corecettore per diversi ligandi.8 La carbamilazione della lisina altera significativamente le proprietà della catena laterale della lisina, per cui il gruppo amminico caricato positivamente viene sostituito da un gruppo polare ingombrante, influenzando potenzialmente il legame del ligando. Abbiamo esaminato le interazioni delle sidechain di sortilina lisina più frequentemente modificate trovate incronico renemalattia(sequenza di amminoacidi [sequenza di struttura cristallina]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) e Lys294(261), mediante modellazione in silico per prevedere le possibili conseguenze struttura-funzione della carbamilazione della lisina. Abbiamo usato la struttura cristallina dell'ectodominio sortilina esistente da entrambe le forme legate alla neurotensina a pH neutro (file PDB Q24: 4PO7; Figura 3a) e la forma priva di ligando a pH acido (file PDB: 6EHO; Tabella supplementare S5).

A pH neutro, Lys95(62) forma un ponte salino con Glu609(576) e un legame idrogeno con il gruppo carbonilico a catena principale di Arg90(57). A pH acido, l'interazione con Glu609(576) è più stretta in quanto la distanza tra il gruppo amminico di Lys95(62) e il gruppo carbossilico di Glu609(576) consente ora la formazione di un legame idrogeno, mentre l'interazione con Arg90(57) non è presente. Pertanto, la carbamilazione a Lys95(62) può destabilizzare entrambe le conformazioni di sortilina. Pertanto, la carbamilazione a Lys205 favorirebbe probabilmente la conformazione del pH acido della sortilina. Lys294(261) non ha interazioni sia a pH neutro che acido.

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Infine, a pH neutro, Lys260(227) interagisce con la neurotensina-Tyr11 nel sito legante il ligando nel tunnel b-elica di sortilin. Poiché la struttura acida della sortilina del pH non ha affinità ligando, non troviamo interazioni della catena laterale di Lys260(227) in questa struttura. L'interazione con neurotensinTyr11 sarà influenzata dalla carbamilazione e potrebbe portare ad una minore affinità per la neurotensina. L'interleuchina 6 (IL-6), un noto ligando di sortilina,20 lega la sortilina attraverso la sua coda C-terminale, che contiene un'arginina nella posizione equivalente della neurotensina-Tyr11. Pertanto, la carbamilazione di Lys260(227) potrebbe probabilmente aumentare l'affinità per IL-6, un potenziale contributo alla calcificazione vascolare.

Successivi studi di legame utilizzando la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie e SortCo o SortCarb hanno rivelato un legame più efficiente di IL-6 a SortCarb (KD 1/4 23 nM) rispetto a Q25 con SortCo non modificato (KD 1/4 141 nM), suggerendo la sortilina carbamilata come potenziale partner legante IL-6 (Figura 3b e c). Progranulin, un altro ligando sortilin noto,22 legato a SortCo, ma non è stato possibile rilevare un legame con SortCarb (Figura supplementare S7A e B). Sia SortCo che SortCarb sono legati alla proteina associata al recettore umano fusa a un tag GST,23 ma non alla sola GST, supportando l'integrità strutturale Q26 della sortilina indipendentemente dal suo stato di carbamilazione e dimostrando la specificità del nostro setting sperimentale (Figura supplementare S7C-F).

Successivamente, abbiamo valutato se l'affinità alterata con IL-6 potrebbe influenzare le vie di segnalazione coinvolte nella calcificazione vascolare. Nella calcificazione degli hSMC, l'aggiunta di IL-6 a SortCarb ha promosso l'espressione di mRNA ALPL e RUNX2 (Figura 3d ed e) e l'attività TNAP (Figura 3f), mentre non ha avuto alcun effetto in combinazione con SortCo. Questi dati indicano che la carbamilazione della sortilina aumenta la capacità di legarsi al ligando a IL-6, che causa un aumento della calcificazione delle cellule muscolari lisce.

La carbamilazione della sortilina è associata a calcificazione vascolare incronicorenemalattiasulla base dei nostri dati che i residui di sortilina carbamilata sono risultati associati acronicorenemalattiae calcificazione, abbiamo poi studiatocronicorenemalattiapartecipanti allo studio CARVIDA, in cui le scansioni tomografiche computerizzate hanno quantificato il CAC. Come i partecipanti allo studio CARE FOR HOMe, la maggior parte dei partecipanti a CARVIDA aveva 2 e 3 PTM, con residui di lisina 95 e 260 frequentemente colpiti (Figura supplementare S8A). Rispetto ai pazienti senza residui carbamilati, i pazienti con 1 residuo di sortilina carbamil-lisina erano più anziani (P 1/4 0,002), avevano eGFR più basso (P 1/4 0,008), erano più frequentemente (ex) fumatori (P 1/4 0,023) e avevano un volume cac cac significativamente più alto (P< 0.001;="" figure="" 4a="" and="" supplementary="" table="">

Ln-(CAC+1) al basale correlato con la presenza e l'aumento di sortilina carbamilata post-traduzionale (Tabella supplementare S7). Inoltre, Ln-(CAC þ 1) è stato anche associato al sesso maschile, diabete mellito, farmaci antidiabetici e ipolipemizzanti, età più elevata, IL-6 sierico ed emoglobina A1c e lipoproteine ad alta densità eGFR e sierose (Tabella supplementare S7). Tuttavia, l'associazione tra i residui di sortilina carbamilata e il basale Ln-(CAC þ 1) è rimasta significativa dopo l'aggiustamento per tutte le variabili sopra menzionate (P 1/4 0,029; Tabella 3).

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Successivamente, abbiamo valutato se la presenza di residui carbamilati ha un impatto sulla progressione del CAC. La presenza di sortilina carbamilata (vs. nessuna carbamilazione) ha aumentato la progressione della CAC (P 1/4 0,047). Nel dettaglio,cronicorenemalattiai pazienti con sortilina carbamilata (n 1/4 33) hanno mostrato una progressione CAC significativamente aumentata in un tempo mediano di follow-up di 4,4 anni (Figura 4b), con un aumento annuale del volume mediano di CAC di 30,32 Q27 (intervallo interquartile 1/4 84,0) (Figura 4C). Al contrario,cronicorenemalattiai pazienti senza carbamilazione di sortilina (n 1/4 8) hanno rivelato una variazione annuale del volume mediano di CAC di 1,63 (intervallo interquartile 1/4 8,54) e nessuna progressione cac significativa nel periodo di follow-up (Figura 4b e c). Dopo aggiustamento per le covariate associate alla progressione della CAC (volume CAC al basale, età, sesso, indice di massa corporea, eGFR, diabete mellito, IL-6 sierico, lipoproteine sieriche ad alta densità e farmaci ipolipemizzanti), lo stato di carbamilazione non era più associato alla progressione del CAC (P 1/4 0,286).

I pazienti con residuo di carbamil-lisina 260 hanno mostrato il più alto aumento del volume di CAC rispetto ai pazienti senza residui carbamilati o residui di carbamil-lisina diversi da 260 (Figura supplementare S8B).

Nel complesso, i dati indicano che la sortilina carbamilata post-traduzionale è associata al volume di CAC e alla sua progressione nei pazienti concronicorenemalattia.

DISCUSSIONE

In vari studi sperimentali in vitro e in vivo e 2 coorti prospettiche indipendenti, dimostriamo che i pazienti concronicorenemalattiamostrano un modello specifico di residui di sortilina lisina carbamilata post-traduzionale nella circolazione, che può anche essere rilevata nella parete vascolare. Inoltre, la carbamilazione della sortilina è stata associata a CAC incronicorenemalattiapazienti, indipendentemente dall'età,renee altri fattori di rischio per la calcificazione. Meccanicamente, potremmo dimostrare che la carbamilazione della sortilina aumenta la sua capacità di legare IL-6 e agisce direttamente sulle cellule vascolari per promuovere la calcificazione vascolare (Figura 4d). Nel complesso, questo studio ha rivelato un nuovo fattore di rischio non tradizionale per la calcificazione, che potenzialmente contribuisce all'elevato onere dicardiovascolaremalattie incronicorenemalattia.

La carbamilazione proteica può essere mediata dal cianato, che si sviluppa durante la decomposizione spontanea dell'urea o è generato dall'ossidazione del tiocianato catalizzato dalla mieloperossidasi nei siti di infiammazione.24 Abbiamo dimostrato checronico renemalattiapazienti con livelli di urea più elevati a causa della riduzionereneha mostrato più residui di carbamilazione della sortilina rispetto ai controlli sani. Tuttavia, non abbiamo trovato alcuna associazione tra i livelli totali e l'attività della mieloperossidasi e della carbamilazione della sortilina, suggerendo l'uremia come un fattore primario per la carbamilazione della sortilina incronicorenemalattia. Inoltre, i nostri dati dimostrano che l'età, l'NT-proBNP e una minore assunzione di antagonisti dell'aldosterone sono associati a più residui carbamilati. I nostri dati sono coerenti con i rapporti precedenti che identificavano l'invecchiamento come un mediatore significativo della carbamilazione proteica.25 È stato dimostrato che i farmaci antipertensivi idroclorotiazide e amlodipina influenzano i livelli di omocitrullina, un amminoacido correlato al ciclo dell'urea e un prodotto derivato dalla carbamilazione.26 Se l'assunzione di antagonisti dell'aldosterone abbassa l'omocitrullina e quindi riduce i residui carbamilati incronicorenemalattiapazienti, non è noto. Drechsler et al. hanno dimostrato una correlazione tra albumina carbamilata sierica e NTproBNP, che era associata a insufficienza cardiaca nella dialisi-dipendentecronicorenemalattia27 Non è noto se la carbamilazione di sortilina possa anche servire come fattore di rischio per l'insufficienza cardiaca, ma l'aumento della calcificazione coronarica con effetti dannosi potenzialmente successivi sulla funzione cardiaca potrebbe spiegare l'associazione tra residui di sortilina carbamilata e livelli di NTproBNP nel nostro studio.

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Studi recenti hanno identificato il ruolo della sortilina nella patogenesi dei disturbi vascolari e metabolici, ma si sono concentrati principalmente sull'espressione tissutale della sortilina piuttosto che esplorare la funzione della forma solubile.7 La sortilina circolante può avere origine dallo spargimento cellulare del loro dominio luminale, come dimostrato in vitro, 28-30, e dalle vescicole extracellulari secrete piene di sortilina.9,31 La carbamilazione porta ad alterazioni nella carica, proprietà strutturali e funzionali delle proteine, mediando la perdita di funzione e le risposte cellulari e molecolari potenzialmente fisiopatologiche.5 Abbiamo stabilito per la prima volta uno specifico modello di carbamilazione dei residui di lisina della sortilina circolante incronicorenemalattia, utilizzando un approccio mirato alla SM e ha previsto le alterazioni funzionali e strutturali mediante la modellazione in silico. Proponiamo che la carbamilazione della lisina favorisca la conformazione acida del pH della sortilina, influenzando l'affinità del ligando pH-dipendente della sortilina. Precedenti studi sulla struttura cristallina hanno dimostrato che a pH 5,5, che rappresenta un ambiente simile a quello degli endosomi tardivi, la sortilina subisce cambiamenti conformazionali e formazione di dimeri, rendendo noti i siti di legame non disponibili per il legame del ligando.32,33

La lisina 260 forma un legame idrogeno a una tirosina di neurotensina all'interno del tunnel dell'elica b, suggerendo che anche altri ligandi che si legano in modo simile alla neurotensina sarebbero interessati. La nostra indagine ha rilevato una maggiore affinità di IL-6 con la sortilina carbamilata, suggerendo la partecipazione alle vie di segnalazione di IL-6. Diversi studi hanno suggerito che IL-6 può contribuire alla calcificazione vascolare incronicorenemalattia.22,34,35 ruolo funzionale nella patologia vascolare calcifica. La sortilina carbamilata solubile ha promosso la calcificazione vascolare in vitro ed ex vivo aumentando i geni bersaglio osteogenici, l'attività del TNAP e la mineralizzazione della matrice. Inoltre, l'aggiunta di IL-6 alla sortilina carbamilata ha ulteriormente aumentato i geni bersaglio osteogenici e l'attività del TNAP.

La carbamilazione è stata associata ad alterazione della matrice extracellulare,36 stress ossidativo,25 disfunzioni endoteliali,37 e aterosclerosi,38 tutti coinvolti nell'inizio e nella progressione della calcificazione. Sebbene Mori et al. abbiano riferito che la carbamilazione proteica promuove la calcificazione vascolare attraverso la carbamilazione delle proteine mitocondriali,6 non sono state identificate proteine bersaglio specifiche. Un recente studio ha dimostrato che la carbamilazione dell'uromodulina ha provocato una perdita delle sue proprietà anticalcifiche in vitro. 39 Entrambi gli studi hanno utilizzato Western blot per rilevare la carbamilazione in generale. Abbiamo dimostrato che la sortilina carbamilata in vitro imita il modello specifico di modificazione della lisina in vivo trovato incronicorenemalattiapazienti che usano la SM. Pertanto, il nostro studio fornisce indizi su meccanismi specifici di connessionecronicorenemalattia, carbamilazione proteica, IL-6 e calcificazione.

In precedenza, alti livelli sierici di sortilina erano associati sia alla calcificazione dell'aorta addominale che alla calcificazionecardiovascolareeventi indipendenti dai tradizionali fattori di rischio di Framingham in una coorte di uomini di età compresa tra > 50 anni.10 Nei pazienti con dolore toracico a rischio da basso a intermedio, i livelli di sortilina non si associavano alla gravità della malattia coronarica.40 In questo studio, abbiamo potuto dimostrare che i pazienti concronicorenemalattiahanno livelli di sortilina più elevati rispetto ai controlli con normalerenefunzione. I livelli di Sortilin non sono aumentati con diminuzionereneuna volta che un paziente ha avuto uncronicorenemalattiacon eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">renefunzione. Allo stesso modo, Kalim et al. non hanno riportato alcuna associazione tra i livelli di albumina totale e carbamilata incronicorenemalattia41 Carbamilazione di Sortilin, derivante da compromissionerenefunzione, potrebbe aumentare ulteriormente la calcificazione vascolare correlata acronicorenemalattia-disturbi minerali associati. Il nostro studio ha diversi punti di forza e limiti. I punti di forza includono l'analisi dei dati ottenuti in vitro, ex vivo e in pazienti utilizzando diversi approcci sperimentali. L'attenta caratterizzazione dei pazienti concronicorenemalattia, compresi questionari standardizzati per valutare le caratteristiche dei partecipanti, visite di studio di persona condotte da infermieri qualificati e misurazioni di molti valori di laboratorio e calcificazione, è un particolare punto di forza dello studio. La piccola coorte può sembrare limitare il nostro studio; tuttavia, abbiamo usato indipendentecronicorenemalattiacoorti con dati di follow-up per la calcificazione per convalidare lo stato di carbamilazione di sortilina da parte di SM mirata laboriosa. I risultati clinici sono stati fatti in tedescocronicorenemalattiae può quindi limitare la generalizzabilità dei risultati ad altri paesi o etnie. Infine, sebbene il disegno dello studio abbia permesso l'aggiustamento per molti importanti fattori confondenti, il confondimento residuo, come in qualsiasi studio osservazionale, non può essere del tutto escluso.

Effetti della cistanche: prevenire l'insufficienza renale

Conclusione

In conclusione, questo è il primo studio che dimostra aminoacidi specifici che sono modificati post-traduzionalmente nella sortilina circolante. I nostri dati suggeriscono che la presenza dicronicorenemalattiapromuove la carbamilazione della sortilina circolante e che la sortilina carbamilata presenta proprietà procalcifiche, come dimostrato in vitro, ex vivo e dalla presenza nel tessuto calcificato. La carbamilazione di sortilina è stata associata a CAC, anche dopo aggiustamento per età,renee molti altri fattori di rischio, suggerendo che la prevenzione della carbamilazione della sortilina potrebbe ridurre il rischio dicardiovascolarecalcificazione e quindicardiovascolarecomplicanze in pazienti concronicorenemalattia. Pertanto, i nostri risultati indicano la sortilina carbamilata come un contributo alcardiovascolarecarico di malattia incronicorenemalattiaPazienti.

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REFERENZE

Questa fonte è di Vera Jankowski, IMCAR, Facoltà di Medicina, RWTH Università di Aquisgrana, Aquisgrana, Germania, ecc.