Parte 2: La malattia renale cronica proteica è associata all'alterata durata della vita, deformabilità e metabolismo dei globuli rossi

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Il danno renale indotto dalla doxorubicina altera la durata della vita, la morfologia e le proprietà biofisiche dei globuli rossi

Venti giorni dopo l'induzione del DIN, in coincidenza con lo sviluppo del ridottofunzione renale(Figura 1b), il colorante fluorescente 5(6)-CFDA, SE,24 che viene rapidamente assorbito nei globuli rossi, è stato iniettato iv per esaminare la velocità di eliminazione dei globuli rossi nei punti temporali indicati in vivo. Gli istogrammi rappresentativi, mostrati nella Figura 4a, indicano la rimozione dei globuli rossi etichettati dalla circolazione e la sostituzione con globuli rossi non etichettati. L'aumento della perdita di globuli rossi era già evidente 3 giorni dopo la somministrazione del colorante e la clearance dei globuli rossi era significativamente più veloce nei topi 129S1/SvImJ con DIN fino al giorno 37. Il giorno 41, il 17% in più di globuli rossi è stato rimosso dalla circolazione in questi topi rispetto a con topi sani (Figura 4b).

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Le immagini tratte da uno striscio di sangue hanno rivelato cambiamenti morfologici nei globuli rossi tratti da topi 129S1/SvImJ con topi DIN (Figura 4c) e Nphs2Dipod (Figura supplementare S4A). Nei topi sani, i globuli rossi mostrano una forma a disco biconcava. Nei topi 129S1/SvImJ con DIN, abbiamo osservato un aumento del numero di stomatociti (stelle rosse), cellule a goccia (triangolo nero), schistociti (punti neri) e cellule microcitiche (freccia nera) (Figura 4c). I topi Nphs2Dipod hanno mostrato una maggiore proporzione di schistociti (punti neri, figura supplementare S4A, immagine in basso, lato sinistro) e le cellule erano policromatiche (figura supplementare S4A, immagine in basso, lato destro).

Per studiare ulteriormente i cambiamenti funzionali dei globuli rossi, le misurazioni della deformabilità al giorno 30 sono state eseguite utilizzando l'ektacitometria.³²La deformabilità dei globuli rossi è stata significativamente ridotta nei topi 129S1/SvImJ con DIN e nei topi Nphs2Dipod, come indicato da un indice di allungamento massimo ridotto (EImax) (Figura 4d e Figura supplementare S4B). Lo stress da taglio per il 50 percento (SS1/2) di EImax (Figura 4e) e, quindi, il rapporto SS1/2 EImax (Figura 4f) è stato significativamente aumentato nei topi 129S1/SvImJ con DIN, indicando globuli rossi più rigidi. SS1/2 di EImax era simile nei topi Nphs2Dipod (Figura supplementare S4C). Il rapporto SS1/2 EImax tendeva ad essere aumentato nei topi Nphs2Dipod rispetto ai topi C57BL/6 sani; la differenza, tuttavia, non ha raggiunto la significatività statistica (P=0,06) (Figura supplementare S4D).

Poiché l'esposizione dei globuli rossi a condizioni extracellulari ipertoniche in vitro imita l'ambiente osmotico che si incontra nel midollo renale, è possibile eseguire un cosmo il giorno 30 e sono stati determinati diversi parametri osmosensibili, come descritto in precedenza.³³ Omin rappresenta l'osmolalità alla minima deformabilità dei globuli rossi, oltre la quale i globuli rossi si lisi con un'ulteriore diminuzione dell'osmolarità. I valori di Omin erano più alti nei topi 129S1/SvImJ con DIN e si spostavano a destra (Figura 5a e d). Una tendenza simile verso un Omin più alto è stata osservata nei topi Nphs2Dipod (Figura supplementare S4E). I valori di Ohyper, che riflettono lo stato di idratazione delle cellule, erano significativamente più alti nei topi 129S1/SvImJ con DIN (Figura 5b) ma erano simili nei topi Nphs2Dipod e nei rispettivi topi di controllo (Figura supplementare S4F). La massima deformabilità (EImax) all'isotonicità è il punto in cui le cellule hanno raggiunto la massima ellitticità. L'EImax all'isotonicità è stato significativamente ridotto nei topi 129S1/SvImJ con DIN (Figura 5c) ma non ha mostrato differenze nei topi Nphs2Dipod rispetto ai topi C57BL/6 sani (Figura supplementare S4G). Nel complesso, questi risultati indicano una ridotta integrità ed elasticità della membrana, ma anche cambiamenti di forma nei topi 129S1/SvImJ e Nphs2Dipod, nonché una maggiore fragilità osmotica dei globuli rossi dei topi 129S1/SvImJ con DIN.

I globuli rossi vengono riprogrammati metabolicamente durante la malattia renale proteinurica nei topi

Per comprendere meglio gli adattamenti molecolari associati ai cambiamenti nell'abbondanza e nella morfologia dei globuli rossi in funzione del danno renale, i globuli rossi dei topi 129S1/SvImJ con topi DIN e Nphs2Dipod sono stati analizzati mediante metabolomica basata sulla spettrometria di massa (Figura 6a e Figura supplementare S5A). Utilizzando questo approccio, sono stati determinati i livelli relativi di 256 metaboliti per topi 129S1/SvImJ e topi Nphs2Dipod. Per analizzare questi dati in modo sistematico, sono state eseguite analisi multivariate, inclusa l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali e l'analisi del clustering gerarchico. È interessante notare che l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali dei metabolomi dei globuli rossi da entrambi i modelli ha rivelato modelli di clustering simili.

In particolare, sebbene i campioni al momento dell'induzione del modello fossero raggruppati insieme a campioni sani di tutti i punti temporali, i campioni di topi nefrotici si raggruppavano indipendentemente dai campioni di controllo sani insieme al componente 1 (Figura 6b e Figura S5B supplementare). In linea con i modelli di clustering evidenti nei 2 modelli, l'analisi di clustering gerarchico dei dati metabolomici per ciascun modello ha evidenziato tendenze simili per i metaboliti coinvolti nella gestione dello stress ossidativo, nonché per nucleotidi, aminoacidi, acilcarnitine e acidi grassi (Figura 6c e le figure supplementari S5C, S6 e S7). Ad esempio, i livelli di allantoina, un catabolita purinico e marker di stress ossidativo nei globuli rossi,³⁴ e il glutatione ridotto si sono entrambi accumulati in modo significativo nel tempo in entrambi i modelli murini nefrotici, indicando la continua generazione di specie reattive dell'ossigeno e l'attivazione del sistema antiossidante del glutatione (Figura 6d e Figura S5D supplementare). Allo stesso modo, i livelli del pantotenato precursore del coenzima A (CoA) si sono accumulati nel tempo (Figura 6e e Figura supplementare S5E).

Modelli simili erano evidenti nei livelli degli acidi grassi liberi acido esadecenoico (C16:1), acido ottadecenoico (C18:1) e acido docosapentaenoico (C22:5), sebbene ogni modello avesse modelli temporali unici (Figura 6f e Figura supplementare S5F).

Oltre agli acidi grassi, hanno risposto anche le acilcarnitine, tra cui idrossiottanoil-carnitina (AC C8-OH), idrossidecanoil-carnitina (AC C10-OH) e dodecanoil-carnitina (AC C12:1). all'induzione della nefropatia proteinurica in entrambi i modelli (Figura 6g e Figura supplementare S5G).

Presi insieme, questi risultati suggeriscono che sull'induzione del proteinuricomalattie renaliin 2 modelli murini simili, livelli aumentati di stress ossidativo possono causare danni alle catene aciliche sui lipidi di membrana. Poiché i globuli rossi sono privi della capacità di sintetizzare nuovi lipidi, fanno uso di un sistema che dipende dalla rimozione mediata dalla fosfolipasi delle catene aciliche danneggiate e dalla sostituzione con acidi grassi non danneggiati. Denominato ciclo di Lands,35 questo sistema dipende dall'attivazione della catena acilica mediante coniugazione con CoA, che stabilisce un equilibrio con l'acilcarnitina per la sostituzione della membrana36 (Figura 6h e Figura supplementare S5H).

I pazienti con CKD proteinurici con anemia mostrano una maggiore morte dei globuli rossi

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min per 1,73 m2) e 15 pazienti con insufficienza renale cronica con proteinuria del range nefrosico e GFR<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Le caratteristiche del paziente sono mostrate nella Tabella 1. Anemia associata a malattie renali, come definita da una concentrazione di emoglobina<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

I globuli rossi umani di pazienti con sindrome nefrosica primaria e CKD avanzata hanno mostrato alterazioni morfologiche, come osservato nei modelli murini (Figure 4c e 7j-l e Figura supplementare S4A). Sebbene la morfologia dei globuli rossi fosse normale nei controlli, i pazienti anemici con sindrome nefrosica primaria e pazienti con insufficienza renale avanzata avevano un numero maggiore di cellule a goccia (triangoli neri) ed echinociti (croci nere) (Figura 7k e l). Inoltre, le cellule bersaglio si sono verificate in pazienti nefrosici primari con anemia e in pazienti con insufficienza renale cronica avanzata (croci rosse; Figura 7k e l). Tutti i gruppi di pazienti, compresi i pazienti nefrotici primari senza anemia, avevano una maggiore percentuale di sferociti (frecce blu; Figura 7j-l). Per analizzare la deformabilità dei globuli rossi umani, è stata eseguita l'ektacitometria. Rispetto ai controlli sani, la massima deformabilità (EImax) è stata ridotta nei pazienti con insufficienza renale cronica avanzata (Figura 7h); L'EImax tendeva ad essere più basso nei pazienti con una sindrome nefrosica primaria senza raggiungere una significatività statistica (Figura 7h). I parametri SS1/2, Omin, Ohyper ed EImax all'isotonicità non erano significativamente diversi tra i controlli sani, i pazienti nefrotici primari e i pazienti con insufficienza renale cronica avanzata (Figura supplementare S8A–D).

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DISCUSSIONE

Il presente studio rivela nuovi meccanismi fisiopatologici che portano all'anemia associata a malattie renali in 2 modelli murini di proteinemalattie renalicon gravemente menomatofunzione renale. Il nostro studio dimostra che in questi modelli, l'anemia è il risultato di una ridotta durata della vita dei globuli rossi innescata dall'esposizione a PS e dalla clearance fagocitica accelerata. È interessante notare che l'anemia in questi topi si è sviluppata nonostante l'eritropoiesi stimolata, suggerendo che una ridotta durata della vita dei globuli rossi, attraverso l'aumento della morte delle cellule dei globuli rossi, potrebbe essere una spiegazione alternativa per questi risultati. Contrariamente ai pazienti con insufficienza renale cronica con anemia (Figura 77), entrambi i modelli murini erano caratterizzati da un aumento della concentrazione plasmatica di EPO. Ciò può essere ipotizzato dalla conservazione della capacità di secrezione di EPO in questi modelli che probabilmente risparmiano le cellule che secernono EPO situate nell'interstizio del rene. L'aumento della secrezione di EPO in questi modelli, tuttavia, non invalida la conclusione che la morte delle cellule dei globuli rossi sia un attore importante nella patogenesi dell'anemia associata a malattia renale. Al contrario, la stimolazione dell'eritropoiesi mediante l'aumento della secrezione di EPO può essere considerata un meccanismo compensatorio dell'aumento della morte dei globuli rossi indotto dainsufficienza renalein questi modelli. In questo senso, è stata recentemente osservata un'aumentata eritropoiesi extramidollare con aumento del volume della milza in un altro modello murino proteinurico con anemia.³⁸

Nei pazienti con insufficienza renale cronica proteinurica e concomitante anemia, abbiamo anche osservato un aumento della percentuale di globuli rossi che espongono PS insieme a livelli più elevati di specie reattive dell'ossigeno e ceramide. Ciò suggerisce che la morte accelerata dei globuli rossi potrebbe essere coinvolta nella patogenesi dell'anemia associata a malattia renale nell'insufficienza renale cronica umana. Le concentrazioni plasmatiche di EPO e l'indice di produzione dei reticolociti non sono aumentati nei pazienti anemici con insufficienza renale cronica, indicando una ridotta eritropoiesi che, insieme alla morte dei globuli rossi, dovrebbe aggravare l'anemia associata a malattia renale. Le ragioni della perdita della secrezione di EPO del rene nell'insufficienza renale cronica umana rimangono poco chiare. Sorprendentemente, sebbene non tutti i pazienti con GFR normale presentassero anemia, quelli con GFR ridotto erano tutti anemici, indicando un effetto di CKD avanzato e di lunga data. In particolare, il relativo deficit di EPO nell'insufficienza renale cronica può essere superato utilizzando la nuova classe di inibitori della prolilidrossilasi,³⁹suggerendo il rilevamento perturbato dell'ossigeno come possibile causa di iposecrezione di EPO.

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I nostri dati dimostrano una ridotta deformabilità dei globuli rossi in entrambi i modelli murini di nefropatia proteinurica, che può essere direttamente correlata a livelli elevati di Ca2þ citoplasmatico.⁴⁰ Insieme, questi meccanismi potrebbero agire di concerto per facilitare l'induzione della morte delle cellule dei globuli rossi e la rimozione dei globuli rossi senescenti e danneggiati dalla circolazione sanguigna.¹⁵Inoltre, abbiamo osservato la riprogrammazione metabolica in queste cellule, indicativa dello stress ossidativo e del rimodellamento dei lipidi di membrana. Sebbene il CoA e l'acil-CoA non siano stati misurati direttamente in questi campioni, vengono attivamente convertiti nei globuli rossi in acilcarnitine dalla carnitina palmitoil transferasi.³⁶I livelli accumulati di quest'ultima classe di composti indicano l'attivazione di questi meccanismi nella nefropatia, poiché questi metaboliti non vengono facilmente trasportati attraverso le membrane dei globuli rossi.⁴¹ A ulteriore supporto, abbiamo osservato l'accumulo in entrambi i modelli di precursori di CoA, incluso il pantotenato, che viene assorbito⁴²e metabolizzato⁴³dai globuli rossi, parallelamente all'aumento degli acidi grassi liberi e alla diminuzione della carnitina libera. È interessante notare che in precedenza abbiamo scoperto che queste alterazioni si verificano in associazione con livelli soprafisiologici di Ca2þ intracellulare.¹⁶Sebbene quei risultati siano stati generati ex vivo, riportiamo qui risposte simili in vivo. Inoltre, le acilcarnitine sono in grado di modulare direttamente le proprietà della membrana⁴⁴e correlano con la deformabilità dei globuli rossi^,45, così come l'emolisi osmotica e ossidativa.⁴⁶La carnitina libera non coniugata, favorisce la deformabilità della membrana attraverso la mediazione delle interazioni tra proteine ​​di membrana.⁴⁷ Le nostre osservazioni di livelli significativamente ridotti di carnitina nei globuli rossi di topi con nefropatia, presumibilmente a causa dell'aumento del consumo per la generazione di acilcarnitine, possono contribuire ai parametri reologici alterati che abbiamo osservato in parallelo.

I nostri risultati suggeriscono meccanismi comuni che portano alla morte dei globuli rossi nei topi con deficit sia di DIN che di podocina, che possono essere correlati sia alla proteinuria del range nefrosico sia, cosa più importante, allo sviluppo di graviinsufficienza renalenei modelli murini osservati dal giorno 20 in poi. Nell'uomo, l'insufficienza renale cronica avanzata con GFR ridotta è un forte predittore di anemia,⁴⁸e la stimolazione della morte dei globuli rossi potrebbe essere correlata all'ambiente uremico. Bisogna riconoscere che nella CKD avanzata, molti fattori e squilibri possono entrare in gioco e promuovere l'anemia associata a malattie renali. Il contributo della proteinuria pesante alla stimolazione della morte dei globuli rossi rimane poco chiaro, ma, sebbene non dimostrato, potrebbe coinvolgere fattori che si perdono nelle urine, come la transferrina o altri che regolano il metabolismo dei globuli rossi.⁴⁹Finora, l'attuale trattamento dell'anemia associata a malattie renali si concentra sull'aumento dell'eritropoiesi mediante la sostituzione del ferro o dell'EPO,⁵⁰mediante l'applicazione di stabilizzatori proteici del fattore inducibile dall'ipossia orale,⁵¹o mediante somministrazione orale o endovenosa di ferro.⁵²Tuttavia, questi trattamenti non considerano un aumento della morte dei globuli rossi. In un precedente studio trasversale su pazienti in emodialisi e dialisi peritoneale, abbiamo riscontrato che i pazienti con una percentuale maggiore di globuli rossi che espongono al PS sono stati trattati con dosi di EPO più elevate.¹⁴ Pertanto, il miglioramento della morte delle cellule dei globuli rossi promette di essere un possibile approccio terapeutico nel trattamento dell'anemia associata a malattie renali. In questo contesto, l'effetto inibitorio di vari agenti farmacologici sulla morte dei globuli rossi53 richiede ulteriori studi sull'uomo e sugli animali.

In conclusione, il metabolismo cellulare alterato contribuisce alla disfunzione dei globuli rossi, all'aumento della morte dei globuli rossi e quindi all'anemia nei modelli murini di CKD proteinurica, nonostante l'aumento dei livelli sierici di EPO. I risultati di questo studio possono in parte spiegare i meccanismi dell'anemia associati all'insufficienza renale cronica nell'uomo.

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CHIARIMENTI

Sebbene non correlati al contenuto degli articoli, ADA e TN sono i fondatori di Omix Technologies, Inc. Tutti gli altri autori non hanno dichiarato interessi in competizione.

INFORMATIVA DATI

I dati saranno resi disponibili su ragionevole richiesta.

RINGRAZIAMENTI

Gli autori riconoscono l'esperta assistenza tecnica di Andrea Janessa. Questi studi sono stati supportati da una sovvenzione della Fondazione tedesca per la ricerca a RB (BI 2149/2-1) e FA (AR 1092/2-2). LS è stato sostenuto da una borsa di studio Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) dalla facoltà di medicina dell'Università di Tubinga. SMQ è stato supportato da risorse di Canadian Blood Services. Come condizione per il finanziamento del governo canadese, questo rapporto deve contenere l'affermazione "Le opinioni qui espresse non rappresentano necessariamente il punto di vista del governo federale del Canada".

CONTRIBUTI D'AUTORE

RB e FA hanno progettato lo studio. La raccolta dei dati è stata eseguita da RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M e BF.

Le analisi statistiche sono state condotte da RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M e ADh; e le figure sono state generate da RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF e ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

e FA ha interpretato i dati. Il manoscritto è stato scritto, rivisto e curato da RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ e FA.

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File supplementare (PDF)

Materiali e metodi supplementari.

Figura S1. Disegno sperimentale degli studi nei topi 129S1/SvImJ e Nphs2Dipod.

Figura S2. Eliminazione dell'espressione della podocina e segni distintivi della sindrome nefrosica nei topi Nphs2Dipod.

Figura S3. Ridotto tasso di sopravvivenza dei globuli rossi nella sindrome nefrosica sperimentale nei topi Nphs2Dipod.

Figura S4. Morfologia alterata e ridotta deformabilità dei globuli rossi nei topi Nphs2Dipod.

Figura S5. La metabolomica indica l'accumulo di stress ossidativo e l'attivazione del rimodellamento dei lipidi di membrana all'interno dei globuli rossi nei topi Nphs2Dipod.

Figura S6. La metabolomica indica un metabolismo alterato all'interno dei globuli rossi ottenuti da topi 129S1/SvImJ.

Figura S7. La metabolomica indica un metabolismo alterato all'interno dei globuli rossi ricevuti dai topi Nphs2Dipod.

Figura S8. Lo stress da taglio a metà della massima deformabilità dei globuli rossi (RBC) e la sensibilità osmotica dei globuli rossi non sono significativamente differenti nella sindrome nefrosica primaria e nei pazienti avanzati con malattia renale cronica (CKD).

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