Parte Ⅰ Sviluppo di un test immunologico a flusso laterale di nanoparticelle di europio per il rilevamento di NGAL nelle urine e la diagnosi di danno renale acuto

Astratto

1. Contesto

L'AKI è correlato a gravi esiti avversi e mortalità nei pazienti con malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), pertanto la diagnosi precoce e l'intervento sono indispensabili. La lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (NGAL) è uno dei biomarcatori più promettenti per il rilevamento di danno renale acuto (AKI), ma gli attuali metodi di rilevamento sono inadeguati, quindi sono necessari metodi più rapidi, convenienti e accurati per rilevare NGAL per la diagnosi precoce dell'AKI. Qui, abbiamo stabilito un immunodosaggio a flusso laterale rapido, affidabile e accurato (LFIA) basato su nanoparticelle di europio (EU-NPS) per il rilevamento di NGAL in campioni di urina umana.

2. Metodi

È stato impiegato un saggio di immunofluorescenza sandwich a doppio anticorpo utilizzando nanoparticelle drogate con europio e il coniugato di anticorpi monoclonali NGAL (MAbs) come etichette è stato generato ottimizzando i parametri di fusione elettrica. Ottantatré campioni di urina sono stati utilizzati per valutare l'efficacia dell'applicazione clinica di questo metodo.

3. Risultati

L'intervallo di rilevamento quantitativo di NGAL nell'AKI era {{0}} ng/mL e la sensibilizzazione al rilevamento era 0,36 ng/mL. Il coefficiente di variazione (CV) di intra-dosaggio e inter-dosaggio era rispettivamente del 2.57-4.98 percento e del 4.11-7.83 percento. Nel frattempo, il coefficiente di correlazione tra i test immunologici a fluorescenza laterale basati su nanoparticelle di europio (EU-NPS-LFIA) e l'analizzatore ARCHITECT era significativo (R2=0.9829, n=83, p <0,01).

4. Conclusioni

Pertanto, è stato stabilito un dosaggio quantitativo dell'NGAL per l'AKI più rapido e semplice, che è molto importante e significativo per la diagnosi precoce dell'AKI, suggerendo che il dosaggio può fornire un avviso precoce dell'esito della malattia.

Parole chiave

lipocalina associata alla gelatinasi dei neutrofili (NGAL), anticorpo monoclonale, test immunologico a flusso laterale, danno renale acuto (AKI),Gli effetti di Cistanche.

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introduzione

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) si è ampiamente diffusa su scala mondiale con gravi disastri [1]. Il danno renale acuto (AKI) ha un tasso più elevato di morbilità e mortalità nelle complicanze comuni per malattie critiche e conta circa il 5-7 percento dei pazienti ospedalizzati nel mondo[2].- Diversi studi hanno valutato lo sviluppo di AKI come più fortemente correlato a esiti e tassi di mortalità peggiori di COVID-19, descrivendo l'incidenza di AKI che varia ampiamente dallo 0,5 al 36,6% nei pazienti COVID-19[3]. La diagnosi precoce e trattamenti precisi dell'AKI possono implementare strategie preventive migliori e prevenire il deterioramento della funzione renale e l'insufficienza renale, contenendo efficacemente la progressione dei pazienti ricoverati per COVID-19[4]. Tra questi, la lipocalina associata alla gelatinasi dei neutrofili (NGAL) è stata riconosciuta come uno dei promettenti biomarcatori candidati per il rilevamento dell'AKI. NGAL è una glicoproteina da 25 kDa associata alla gelatinasi dei neutrofili e di solito esiste a un livello inferiore nei tessuti umani come lo stomaco, il colon e il rene, ma la sua espressione è notevolmente aumentata nel siero e nelle urine quando il rene presentava lesioni ischemiche o nefrotossiche [5].

I test immunologici a flusso laterale (LFIA) sono stati considerati test di screening desiderati per la loro semplicità, analisi in situ e facilità di lavoro[6]. L'LFIA con microparticelle fluorescenti è già stato utilizzato per il rilevamento di vari patogeni microbici e diversi marcatori di infiammazione[7, 8]. Diverse nuove nanoparticelle sono state generalmente applicate per migliorare la sensibilità di LFIA, tra cui nanoparticelle di carbonio, punti quantici, coloranti fluorescenti, nanoetichette magnetiche e nanoparticelle di europio (EU-NPS)[9]. L'UE-NPS come vettore può migliorare 100-il contrasto della sensibilità rispetto alle nanoparticelle d'oro colloidale marcate in LFIA[10]. L'EU-NPS ha una lunga durata di fluorescenza ed è disponibile anche con una dimensione media delle particelle nell'intervallo 75-100 nm, l'ampio spostamento di Stokes che di solito è superiore a 200 nm contribuisce a evitare l'interferenza della luce diffusa causata dalla misurazione della luce di eccitazione. Gli EU-NPS hanno un'ampia banda di eccitazione, quindi è vantaggioso aumentare l'energia di eccitazione, il picco di emissione nitido, il fondo basso e l'alta risoluzione, utilizzati di recente nei test immunologici a sandwich della diagnostica medica[11].

Qui, abbiamo stabilito un nuovo metodo con EU-NPS come etichette di LFIA per la misurazione rapida, sensibile e precoce di NGAL nelle urine sulla base di due anticorpi monoclonali (MAbs) 1G1 e 2F4 che vengono scoperti dal nostro laboratorio. Il metodo è un saggio di immunofluorescenza sandwich a doppio anticorpo che utilizza il coniugato EU-NPS e MAbs come etichette. Il mAb 1G1 è stato coniugato con EU-NPS e il mAb 2F4 è stato utilizzato per catturare il complesso antigenico EU-NPS-1G1-nella linea T. I nostri risultati hanno mostrato che EU-NPS-LFIA potrebbe essere utilizzato per il rilevamento precoce di NGAL nelle urine e consentire un miglioramento nel trattamento dei pazienti con AKI.

Cistanche tubulosa

Metodi

1. Espressione e purificazione di NGAL

La sequenza del gene NGAL umano di Genbank (NP{{0}}.2) è stata sintetizzata dal Beijing Institute of Genomics (BGI) e ha aggiunto gli enzimi di restrizione HindIII e XhoI a entrambe le estremità. I plasmidi sono stati digeriti con HindIII e XhoI e quindi clonati nel vettore pSecTag2A. I plasmidi costruiti sono stati sequenziati per confermare senza mutazione e poi trasformati in cellule ovariche di criceto cinese (CHO) dalla LipofectamineTM2000. Dopo 8 giorni, il supernatante cellulare è stato raccolto dopo aver filtrato un filtro da 0,45 μm. La proteina NGAL -6 × His espressa è stata purificata con la colonna Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) e le diverse frazioni sono state raccolte e valutate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Il kit di quantificazione delle proteine ​​dell'acido bicinconinico (BCA) ha misurato la concentrazione di proteine.

La proteina ricombinante purificata è stata sottoposta a SDS-PAGE al 12 percento, quindi adsorbita su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Dopo che la membrana è stata bloccata in tampone tris con una soluzione all'1% di Tween-20 (TBST) contenente il 5% di latte scremato a temperatura ambiente (TA) per 2 ore, incubate con tag anti-6×His coniugato con HRP anticorpo (1:5000) al buio per 1 ora a temperatura ambiente, visualizzato con benzidina dopo essere stato lavato con TBST e visualizzato dal sistema di rilevamento del blotting Bio-Rad Western (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israele).

2. Generazione e purificazione di MAbs

Nella prima immunizzazione, le femmine di topo BALB/c (età di 6 settimane, un totale di 10) sono state immunizzate con 50 µg di NGAL-6×His proteina ricombinante emulsionata in uguale dose di adiuvante di Freund completo e accessional immunizzati sono stati realizzati con proteine ​​emulsionate in adiuvante di Freund incompleto. Due iniezioni ipodermiche sul dorso dei topi e successive iniezioni intraperitoneali distanziate di 21 giorni. I campioni di siero sono stati raccolti una settimana dopo la terza iniezione e il titolo dell'antisiero è stato determinato con un saggio immunoenzimatico indiretto (ELISA)[12]. Tre giorni prima della fusione, i topi hanno eseguito l'immunizzazione di richiamo con 50 µg di NGAL-6×His diluito con NaCl allo 0,9%.

Le cellule isolate della milza di topi immunitari e le cellule del mieloma SP2/0 si sono mescolate con un rapporto di 3:1 per fondersi in una camera di fusione con elettrodo di platino LF498-3 (BEX Co., Ltd, Giappone) come descritto in letteratura[13]. In breve, la cella mista è stata lavata due volte con 10 mL di tampone per elettrofusione (0.3 M mannitolo, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH 7.2), e risospese a una concentrazione di 2 × 107 cellule/ mL. La fusione è stata completata utilizzando una tensione di corrente alternata di 50 V a 0,8 MHz per 20 s, una tensione di impulso di corrente continua di 450 V di 2 ripetizioni per 0,5 s e la post-fusione è stata di 50 V a 0,8 MHz per 7 sec. Infine, la sospensione cellulare trattata elettricamente è stata spostata dalla camera di fusione in 4,5 mL di RPMI 1640 preriscaldato (20 percento di siero bovino fetale) per 30 minuti a 37 gradi, quindi coltivata in 96-pozzetti e incubata con il 5 percento di CO2 a 37 gradi. Dopo 24 ore, ipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) è stata integrata in ciascun pozzetto. I supernatanti della coltura cellulare sono stati sottoposti a screening mediante ELISA dopo 9 giorni di fusione e il numero calcolato di cloni di ibridomi era. I topi BALB/c che sono stati iniettati in anticipo con olio di paraffina sono stati inoculati con 1 × 106 di cellule di ibridoma NGAL, l'ascite è stata purificata dalla colonna di proteina A.

3. Identificazione di MAbs

Le sottoclassi di immunoglobuline degli anticorpi sono state analizzate utilizzando il kit di identificazione delle sottoclassi di anticorpi. L'ELISA indiretto ha vagliato i MAbs specifici utilizzando NGAL ricombinante purificato {{0}}×His protein e PCT- 6×His protein. L'interazione tra antigene e anticorpi è stata determinata con il sistema BIAcore T200 (GE Healthcare, Stoccolma, Svezia) in tampone HBS-EP (0,005% di tensioattivo P20, Hepes 10 mM, pH 7,4, EDTA 3 mM, 150 mMNaCl). L'antigene NGAL è stato adsorbito su chip di biosensori CM5 raggiungendo 400-480 unità di risposta (RU) mediante un kit di accoppiamento amminico. Gli anticorpi (2F4 e 1G1) sono stati diluiti nel tampone HBS-EP sono stati passati lentamente sul chip con 50 µL/min per 5 minuti, rispettivamente, e successivamente il tampone HBS-EP è stato iniettato sul chip per monitorare la fase di dissociazione per 4 min . I chip del sensore sono stati rigenerati con soluzione di glicina (pH 3.0) dopo la fase di dissociazione. Per ogni analita passato sul chip, le risposte specifiche dal canale di flusso dell'antigene potrebbero sottrarre risposte non specifiche dal canale di flusso di controllo. Le curve di legame di saturazione adattate sono state tracciate in base alle concentrazioni di analita per le risposte di legame all'equilibrio per calcolare KD.

MAb anti-NGAL purificati sono stati analizzati in SDS-PAGE al 12 percento in condizioni non riducenti e condizioni riducenti. In breve, il campione è stato miscelato con 5 x tampone non riducente o 5 x tampone di caricamento proteico e caricato su SDS-PAGE al 12%. La specificità dei MAb anti-NGAL è stata determinata mediante Western Blot. Le proteine ​​NGAL sono state fatte al 12% di SDS-PAGE, quindi adsorbite su una membrana PVDF che è stata attivata mediante immersione in metanolo per 15 secondi e quindi sottoposta alle condizioni di elettroforesi a 100 V per 2 ore. Dopo il blocco in tampone Tris-HCl con soluzione Tween-20 all'1% (TBST) contenente il 5% di latte scremato a temperatura ambiente per 2 ore, la membrana è stata incubata con MAb anti-NGAL di topo come anticorpi primari a 4°C. Il giorno successivo, la membrana è stata lavata con TBST e incubata con IgG HRP coniugata con anti-topo al buio per 1,5 ore a temperatura ambiente. Infine, la membrana è stata visualizzata dal sistema di rilevamento Western blot di chemiluminescenza potenziata (ECL).

4. Saggi di immunoassorbimento enzimatico competitivo (ELISA)

Due MAbs sono stati testati per la capacità di riconoscere epitopi unici su NGAL mediante cELISA. MAb è stato coniugato con HRP utilizzando il kit di etichettatura degli anticorpi HRP (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), la cui concentrazione di lavoro è stata testata mediante ELISA diretto. {{0}}pozzetti Le piastre per microtitolazione sono state rivestite con 2 µg/mL di antigene NGAL durante la notte a 4 gradi, quindi MAb non marcato (0,2 µg/pozzetto, 2 µg/pozzetto) è stato legato in modo competitivo con il rapporto di diluizione ottimale di MAb marcato con HRP e incubato per 1 ora a 37 gradi. La reazione enzimatica è apparsa con perossido di idrogeno dal substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e interrotta da acido solforico 2 M in tutti i pozzetti. L'assorbanza (OD450 nm) è stata determinata da un lettore di micropiastre Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc). Gli effetti bloccanti degli MAbs sono stati calcolati utilizzando la seguente equazione: 100×[1-OD_450nmdi (HRP-MAb più MAb)/OD450 nm di HRP-MAb]. Due MAb hanno riconosciuto epitopi diversi se sono stati osservati effetti di blocco in più del 40 per cento.

Estratto di cistanche

5. Coniugazione di EU-NPS

Gli anticorpi monoclonali anti-NGAL 1G1 e 2F4 sono stati coniugati covalentemente a EU-NPS con la procedura standard dei Bangs Laboratories. In breve, 100 µL di EUNPS sono stati aggiunti a 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) e disperso mediante ultrasuoni, vibrato per 15 minuti a temperatura ambiente in presenza di {{40}}.08 M N-idrossisulfosuccinimide (NHS) e 0,05 M 1-({{19 }}Dimetilamminopropil)-3-etil carbodiimmide cloridrato (EDC). L'EUNPS attivato è stato lavato con tampone di accoppiamento (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) e fatto reagire con 0,3 mg di anticorpo per 2,5 ore a temperatura ambiente. Il composto coniugato con europio è stato incubato in 1000 µL di tampone bloccante (10% BSA, 20% tween-20, 0,05 M Tris-HCl) per 1 ora, aggiunto a 1000 µL di soluzioni madre (10% BSA, 20% trealosio, 20 percentuale tween-20, 0,05 M Tris-HCl ) da conservare a 4 gradi .

6. Lo sviluppo della LFIA

Le strisce LFIA consistevano in una membrana di nitrocellulosa, tampone coniugato, tampone campione e tampone assorbente. Le membrane in fibra di vetro sono state immerse nel tampone bloccante (20 percento trealosio, 10 percento BSA, 20 percento tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) per 1,5 ore. La concentrazione di 1 mg/mL di MAbs (2F4 o 1G1) è stata applicata sulla linea di test (TL) della membrana di nitrocellulosa e l'IgG anti-topo di capra 1 mg/mL è stata applicata sulla stessa membrana NC a una distanza di 4 mm da formare una linea di controllo qualità (CL), il volume di nebulizzazione dello strumento erogatore è stato impostato a 1 µL/cm. La membrana e il tappetino in fibra di vetro sono stati essiccati per 48 ore a 45 gradi prima di essere testati. Le diverse particelle coniugate EU-NPS-1G1 e EU-NPS-2F4 sono state rivestite sul pad coniugato e il segnale di fluorescenza è stato misurato da un analizzatore immunofluorescente (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Prelievo di campioni di urina e pazienti

Un totale di 83 campioni di urina umana da pazienti AKI sono stati raccolti dall'ospedale affiliato dell'Università medica di Jilin. Le linee guida etiche sono state rigorosamente rispettate durante l'esperimento e sono state fornite dall'ospedale affiliato della Jilin Medical University (n.2018-LW029). Tutti i soggetti hanno ricevuto il consenso informato orale e scritto in cinese per lo studio dei campioni di urina. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti dalla Dichiarazione dei principi etici di Helsinki. L'età media dei pazienti di 62 anni variava da 20 a 80 anni che non erano stati infettati da COVID-19 e gli stadi AKI 1-3 sono stati classificati secondo i criteri AKI per il miglioramento della malattia renale [14]. I campioni di urina sono stati raccolti per l'analisi NGAL fino a 12 ore prima della diagnosi di AKI ea intervalli frequenti dopo l'operazione in vari momenti (12, 24, 48 ore). Per ridurre al minimo i potenziali fattori confondenti, i campioni di urina sono stati analizzati rapidamente presso il laboratorio di chimica clinica, inclusa la biochimica delle urine (concentrazioni proteiche totali < 1 g/dL, urea < 12 g/dL, glucosio < 1 g/dL, creatinina urinaria < 1 g/dL , albumina < 2,5 g/dL, pH 4.5-9.0) ed eseguito in duplicato. Entro 30 min dalla raccolta del campione, sono stati centrifugati a 3000 rpm a 4 gradi per 15 min. Un minimo di 100 µL di supernatante è stato dispensato in contenitori sterili e conservato a -80 grado per ulteriori analisi, per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

La misurazione dei livelli di NGAL è stata eseguita utilizzando un kit di reagenti NGAL urinari ARCHITECT (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Irlanda) utilizzando un formato sandwich non competitivo con rilevamento del segnale chemiluminescente. L'NGAL urinario è stato riconosciuto da un anticorpo antimicotico che era legato in modo covalente a particelle paramagnetiche nel reagente per microparticelle e dal coniugato di un secondo anticorpo anti-NGAL associato all'acridinio. Seguendo le istruzioni del produttore, il test di calibrazione è stato eseguito nell'intervallo di 0- 1500 ng/mL ed è stata misurata la concentrazione di NGAL.

8. Test e analisi di campioni clinici

Le concentrazioni seriali dell'antigene standard NGAL (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 e 3000 ng/mL) sono state preparate utilizzando FBS per rafforzare reazioni specifiche del bioconiugato, ciascuna concentrazione ha fatto tre repliche. Dopo che i campioni clinici sono stati aggiunti ai tamponi campione, i risultati dell'intensità di fluorescenza sulla linea T (HT) e sulla linea C (HC) sono stati registrati dal lettore. Il rilevamento quantitativo è stato completato dal rapporto HT/HC per eliminare efficacemente le differenze tra le strisce (T e C) e gli effetti della matrice standard dei campioni matematici[15]. La curva standard è stata tracciata rispetto a ciascuna concentrazione di NGAL e al rapporto HT/HC.

9. Analisi statistica

L'analisi di regressione di Passing-Bablok e il grafico di BlandAltman sono stati eseguiti mediante l'analisi della varianza (ANOVA) del software MedCalc e SPSS 17.0. Tutti i dati sono stati mostrati come valori medi con deviazione standard (media ± SD).

Pillole di cistanche

Riferimenti

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Moli Yin1, Yuanwang Nie2, Hao Liu2, Lei Liu1, Lu Tang1, Yuan Dong2, Chuanmin Hu1 e Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, Cina.

2 Academy of Laboratory, Jilin Medical University, 132013 Jilin, Cina.