PARTE Ⅰ: Effetti delle condizioni ambientali sul numero di nefroni
Mar 20, 2022
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PARTE Ⅰ: Effetti delle condizioni ambientali sul numero di nefroni: modellizzazione della malattia materna e regolazione epigenetica nello sviluppo renale
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.
1. Introduzione
Lo sviluppo fetale è influenzato dall'ambiente in utero e un ambiente avverso può predisporre a malattie come ipertensione, malattie cardiovascolari e malattie renali croniche più avanti nella vita [1-4]. Una serie di disturbi intrauterini può comportare una riduzione della dotazione di nefroni e una funzione renale compromessa nella prole. Nei roditori, le condizioni che portano a una riduzione del numero di nefroni alla nascita includono restrizione della crescita intrauterina (IUGR), dieta materna a basso contenuto proteico, farmaci (inclusi corticosteroidi o farmaci antinfiammatori non steroidei), mutazioni monogenetiche e bassi livelli di vitamina A, nonché diabete materno e carenza di ferro [5-10]. Negli esseri umani, attualmente non esiste un metodo non invasivo per misurare i numeri di nefroni. Tuttavia, studi postmortali hanno dimostrato una correlazione negativa tra il numero di nefroni e la pressione sanguigna [4,11]. Inoltre, è noto che le condizioni intrauterine associate a un numero ridotto di nefroni come IUGR sono associate a tassi aumentati di ipertensione e CKD[12].
Gli esperimenti in vivo in cui condizioni intrauterine avverse sono indotte artificialmente in animali gravidi si sono dimostrati preziosi per l'individuazione e la descrizione delle alterazioni renali indotte nella prole. Tuttavia, qualsiasi intervento sperimentale durante la gestazione porta a complesse alterazioni della fisiologia materna, placentare e fetale che possono a loro volta influenzare l'ambiente dei metanefroi in via di sviluppo. Le tecniche di modellazione ex vivo aggirano questo problema consentendo lo studio dello sviluppo del rene completamente separato dall'influenza dell'animale madre, della placenta o di altri organi del feto. Colture isolate di metanefroi su un'interfaccia aria media sono state inizialmente eseguite da Trowell nel 1950 [13] e successivamente sono state perfezionate mediante coltura di reni su membrane filtranti [14], fornendo una base per condizioni di coltura a singola variabile.
In sintesi, c'è un numero crescente di prove che suggeriscono che gli insulti prenatali associati a un basso numero di nefroni sono rilevanti per i fattori di rischio per l'ipertensione e CKD. Al fine di sviluppare strategie preventive per garantire un'adeguata dotazione di nefroni alla nascita, è necessaria una comprensione meccanicistica dei fattori che influenzano lo sviluppo renale e la nefrogenesi. Nel presente lavoro, la coltura di organi metanefrici è stata utilizzata per modellare diversi aspetti della regolamentazione ambientale per studiarne gli effetti sulla crescita renale e le possibili implicazioni per la funzione renale a lungo termine e utilizzata per lo screening dei regolatori epigenetici utilizzando piccoli composti approvati dalla FDA.
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2. Risultati
2.1. Uso di colture di organi metanefrici per studiare l'effetto delle condizioni ambientali sullo sviluppo renale
Per modellare condizioni ambientali avverse, i reni degli embrioni del giorno embrionale (E) 12.5 sono stati coltivati all'interfaccia a media aria (Figura 1A). Per facilitare il monitoraggio del nefrone e dello sviluppo glomerulare, Six2. Cre e Pod. Sono stati utilizzati rispettivamente topi reporter a doppia fluorescenza Cre (Figura 1B, C). Una condizione comune durante la gravidanza è la febbre, che colpisce più del 10% delle gravidanze durante le prime 16 settimane di gestazione [15]Il calore è un teratogeno ben caratterizzato e l'ipertermia durante la gravidanza ha dimostrato di portare all'aborto fetale, ritardo della crescita, e difetti dello sviluppo, come agenesia renale, ipoplasia e basso peso alla nascita in diverse specie [16-21]. Per valutare l'impatto di condizioni ipertermiche prolungate e febbrili sulla crescita dei reni e sulla formazione di nefroni, i reni sono stati isolati e mantenuti a 37 o 40 gradi (Figura 1D). Dopo 7 giorni di coltura, i reni coltivati a 40°C erano, in media, il 18,36% più piccoli delle loro controparti coltivate in condizioni fisiologiche (Figura 1E). Tuttavia, non è stata trovata alcuna differenza significativa nel numero di glomeruli per rene tra i gruppi (Figura 1F). Tuttavia, la ridotta crescita complessiva dei reni dimostra un effetto negativo dell'aumento della temperatura sulla crescita metanefrica.
Con circa il 19% delle donne in gravidanza che soffrono di anemia da carenza di ferro [22], la carenza di ferro è una delle condizioni più diffuse con il potenziale di disturbare lo sviluppo renale [23]. Dati in vivo hanno dimostrato che la crescita renale, il numero glomerulare e l'assorbimento renale di ferro sono ridotti durante le gravidanze affette da carenza di ferro materna [24]. Al fine di valutare l'impatto della riduzione dell'apporto di ferro legato alla transferrina sulla crescita e sulla nefrogenesi dei reni, gli espianti sono stati coltivati in un mezzo contenente 50 ug/mL di olotransferrina saturata di ferro o 50 ug/mL di apotransferrina impoverita di ferro, rispettivamente. I reni con restrizione di ferro sono rimasti molto più piccoli delle loro controparti sufficienti di ferro e hanno mostrato un aumento dell'apoptosi nelle gemme ureteriche e una ridotta ramificazione e proliferazione delle gemme ureteriche (Figura 1G, Figura supplementare S1A-F). Sebbene la popolazione del nefrone fosse morfologicamente inalterata, si poteva osservare una diminuzione della parte distale in via di sviluppo del nefrone, nonché dei tubuli distali (Figura 1H, I, Figura supplementare S1G-J). I reni carenti di ferro erano, in media, il 47,9% delle dimensioni delle loro controparti coltivate con olotransferrina (Figura 1) e hanno mostrato una riduzione del numero complessivo di glomeruli per rene del 69,9% dopo 7 giorni di coltura (Figura 1K) . Pertanto, la deplezione di ferro da parte dell'apo-transferrina ha mostrato gravi effetti sulla crescita renale con un fenotipo di nefrogenesi tutto prossimale.
Figura 1. Uso di colture di organi metanefrici per studiare l'effetto delle condizioni ambientali sullo sviluppo renale.(A) La cresta urogenitale da embrioni di topo E12.5 (pannello di sinistra) è stata estratta microchirurgicamente (secondo pannello) e i reni sono stati isolati (terzo pannello) e posizionati su inserti Transwell (pannello di destra). Barre della scala∶ 1 mm （pannello sinistro）, 500 μm（terzo pannello）. (B) I topi transgenici con doppia espressione di pomodoro/EGFP sono stati utilizzati per l'etichettatura condizionale di sei2-cellule positive e della loro progenie utilizzando Six2. Cellule Cre o (C) podocina-positive utilizzando Pod. topi Cre. (D) Gli espianti dello stesso embrione sono stati coltivati per 7 giorni a 37 o 40 gradi. Barre di scala∶ 500 μm. （E） Aree superficiali di espianti cresciute per 7 giorni a 37 o 40 gradi .n=40 coppie, test t accoppiato, media±DS.(F) Il numero di glomeruli nei gruppi di espianti dopo 7 giorni.n{{ 17}} coppie, test t accoppiato, media ±SD. （G） Gli espianti dello stesso embrione sono stati coltivati per 7 giorni in un terreno contenente olo-Tf o apo-Tf. Barre di scala∶ 500 μm. (H) Le immagini ad ampio campo di coppie di espianti in coltura olo-Tf e apo-Tf colorate contro SIX2 ed E-caderina dopo 48 h di coltura mostrano un pool di cellule progenitrici normali e difetti nella morfologia del nefrone precoce. Barra di scala∶100 μm.（I） Immagini ad ampio campo di coppia di espianti in coltura olo-Tf e apo-Tf colorati contro WT1 e JAG1. Barre di scala∶100 μm. （） Aree superficiali di espianti in coltura olo-Tf e apo-Tf dopo 7 giorni.n=30 coppie, test t accoppiato, media ± DS.(K) Numero di glomeruli nei gruppi di espianto dopo 7 giorni.n =17 coppie, test t accoppiato, media ± DS.
2.2. Ex Vio L'elevata esposizione al glucosio porta a cambiamenti associati alla nefropatia diabetica nel rene in via di sviluppo
Il diabete materno è un'altra condizione comune durante la gravidanza, con una prevalenza globale di iperglicemia in gravidanza di circa il 17% e oltre 20 milioni di nati vivi ogni anno [25]. È stato dimostrato che il diabete indotto nei modelli di topo e ratto porta a una prole con un numero di nefroni inferiore[10,26,27]. La coltura di organi metanefrici è stata utilizzata in precedenza per studiare l'effetto del glucosio elevato sullo sviluppo renale [27-29]. In precedenza, abbiamo riportato una riduzione delle dimensioni, del numero di nefroni e della metilazione del DNA in condizioni di glucosio elevato di 55 mM[30]. Contrariamente ai dati pubblicati [28], non è stato possibile osservare alcun effetto sulla dimensione dell'espianto o sul numero glomerulare nei nostri campioni se coltivati in diversi mezzi di glucosio da 30 mM rispetto a condizioni di controllo da 5 mM dopo 7 giorni (Figura supplementare S2A, B). Inoltre, non è stata rilevata alcuna diminuzione della metilazione del DNA a LINE-1 e ai principali siti satellite (Figura supplementare S2C, D). L'effetto di 55 mM di glucosio alto sullo sviluppo renale dopo una coltura di 7-periodo di un giorno è stato ulteriormente analizzato, mostrando una diminuzione del tasso di crescita a partire dal giorno 3 nella coltura (Figura 2A, B). Le colorazioni di immunofluorescenza non hanno mostrato difetti morfologici del pool di cellule progenitrici SIX2- positive (Figura 2C) ma hanno mostrato una colorazione ridotta del marcatore podocitario podocalyxin (PODXL, Figura 2D). È stato riscontrato che i glomeruli contengono una matrice seminterrata glomerulare ispessita visibile nelle colorazioni istologiche (Figura 2E). Risultati simili sono stati ottenuti nella microscopia elettronica, che mostra un aumento dello spessore della membrana basale glomerulare (Figura 2F), uno dei primi marcatori di pre-diabete e nefropatia diabetica (DN) [31,32], in cinque reni su sei e nessuno di sette reni di controllo della cucciolata. Per svelare ulteriormente i cambiamenti nel trascrittoma, è stata eseguita l'analisi dell'espressione genica differenziale a coppie (DGE) delle colture renali di tre cucciolate, con un rene di ciascun embrione coltivato con glucosio alto e l'altro con mezzo di controllo e i reni raggruppati per l'analisi ( n=3).DGE ha confermato la sovraregolazione dei componenti della matrice extracellulare come processo biologico sovraregolato primario (Tabella Supplementare S1). I geni sottoregolati erano principalmente coinvolti nell'attivazione (immunitaria) delle cellule e nell'esocitosi/secrezione (Tabella Supplementare S1). L'ontologia del fenotipo dei mammiferi ha indicato la corteccia renale anormale e la morfologia del corpuscolo renale a causa di geni sottoregolati come Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb e Vegfa (Tabella Supplementare S1). È stato riscontrato che l'espressione renale di diversi geni, come Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa e Txnip, che hanno dimostrato di essere sovraregolati nella nefropatia diabetica [33-36], è aumentata in condizioni di iperglicemia. Per confrontare il profilo di espressione genica della coltura renale ad alto contenuto di glucosio con il DN umano, i dati DGE sono stati abbinati ai dati umani di glomeruli e tubuli microdissezionati da biopsie di pazienti con nefropatia diabetica dalla Banca europea del cDNA renale (ERCB). Dai 216 geni regolati in modo differenziato abbinati dopo l'analisi batch, 94 geni sono stati regolati in modo differenziato in modo corrispondente nelle frazioni glomerulari e/o tubulari (Figura 2G). La sovrapposizione del nostro modello e dei DNgenes umani ha mostrato 40 geni su 95 sovraregolati nei glomeruli e 34 geni nei tubuli (25 geni in comune) (Figura 2H). I geni erano principalmente coinvolti in un'organizzazione della matrice extracellulare (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) e nell'adesione cellulare (ITGBL1, CLDN15). Inoltre, i geni associati al diabete come TXNIP, SPON2 e PAPPA sono stati sovraregolati. Su 120 geni sottoregolati dalle colture renali, 22 erano anche sottoregolati nei glomeruli e 39 erano anche sottoregolati nei tubuli (16 in comune (Figura 2I). Questi geni erano coinvolti nella risposta allo stimolo endogeno (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), sviluppo dell'epitelio del nefrone (PTPRO, PODXL, VEGFA) e regolazione positiva della chemiotassi delle cellule endoteliali (LGMN, P2RX4, VEGFA).Inoltre, i geni associati al diabete come RASGRP3, SIRPA, GATM ed ESM1 erano sottoregolati. 37-39]. I geni regolati in modo differenziato che non si sovrappongono ai dati dell'ERCB riflettevano anche i cambiamenti associati al diabete, come la matrice extracellulare (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) o il diabete gestazionale (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). Pertanto, lo sviluppo renale in condizioni di glicemia elevata mostrava notevoli somiglianze con la nefropatia diabetica umana adulta.
Figura 2. L'elevata esposizione al glucosio ex vivo porta a cambiamenti associati alla nefropatia diabetica nel rene in via di sviluppo.(A) Reni embrionali da Pod.Cre; Animali di pomodoro/EGFP coltivati per 7 giorni in condizioni di glucosio basso (LG, 5,5 mM -D-glucosio, mannitolo 55 mM) o alto (HG, 55 mM -D-glucosio). Barra della scala: 500 um.(B)Area della superficie renale delle condizioni HG e LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. L'esposizione ad alto contenuto di glucosio ex vivo influenza la formazione della memoria a lungo termine tramite la metilazione del DNA
Per comprendere ulteriormente i cambiamenti molecolari mediati da un ambiente iperglicemico, le colture renali sono state coltivate in condizioni di glucosio elevato per 3,5 giorni e quindi modificate in condizioni di glucosio basso per lo stesso periodo di tempo (Figura 3A). Sorprendentemente, l'incubazione in condizioni fisiologiche dopo il periodo di incubazione più breve in un mezzo ad alto contenuto di glucosio non ha invertito la riduzione della crescita dopo 7 giorni in coltura con le colture che crescono alla stessa velocità del trattamento continuo ad alto contenuto di glucosio (Figura 3B). Inoltre, la metilazione del DNA ha mostrato ipometilazione dell'elemento LINE-1 e dei principali loci satellite (Figura 2C, D), nonché ipermetilazione del DNA sostenuta del promotore Ppargcla, sia in condizioni di glucosio elevato che inverse (Figura 3E), indicando il formazione della memoria metabolica tramite metilazione del DNA a causa delle precedenti condizioni ambientali avverse come mezzo di programmazione fetale.
Figura 3. L'esposizione elevata al glucosio ex vivo influenza la formazione della memoria a lungo termine tramite la metilazione del DNA.(A) Imaging dei reni embrionali E12.5 dal giorno 0 al giorno 7 in mezzo a basso contenuto di glucosio (5,5 mM), mezzo ad alto contenuto di glucosio (55 mM) o mezzo ad alto contenuto di glucosio per 3,5 giorni e inversione in un mezzo a basso contenuto di glucosio per i restanti giorni.Barra della scala:500 um. (B) Area della superficie del rene per 7 giorni. Media ± DS. n{11}} reni. LG, trattamento a basso contenuto di glucosio; HG, trattamento ad alto glucosio; HG a LG,3,5 giorni di trattamento con glicemia alta e 3,5 giorni con bassa glicemia.***,LG-HG (test t non accoppiato):p=0.0004;**,LG-HG a LG (test t accoppiato ):p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4.Ex Vivo Small Compound Screen identifica i regolatori epigenetici dello sviluppo renale
I risultati di questo lavoro, così come quelli precedenti, suggeriscono che i meccanismi epigenetici svolgono un ruolo nello sviluppo del rene [30, A40-45]. Pertanto, abbiamo voluto valutare sistematicamente l'effetto dei modulatori epigenetici delle diverse classi di enzimi sullo sviluppo renale. Per questo, abbiamo selezionato una libreria di 22 piccoli composti approvati dalla FDA con attività inibitoria dimostrata [46-56] (Figura 4A). Utilizzando topi Six2.Cre-reporter per valutare lo sviluppo del nefrone, le strutture renali sono state coltivate per 3 giorni con gli inibitori nel mezzo. Le dimensioni aumentano nel tempo rispetto agli organi di controllo della lettiera e la morfologia è stata verificata per anomalie nello sviluppo (Figura 4B). È possibile dimostrare che diversi inibitori interferiscono con il normale sviluppo renale ex vivo. L'inibitore dell'HDAC entinostat, un inibitore della benzamide istone deacetilasi con un'elevata affinità per HDAC1,2 e 3 [57], ha mostrato una consistente riduzione della crescita e mancanza di differenziazione e proliferazione dopo 3 giorni (Figura 4C). TH39 si è sviluppato come inibitore selettivo dell'HDAC8 (IC50 HDAC8 88 nM, 26-selettiva per volte contro HDAC1,28-selettiva per volte contro HDAC6[56]), ha mostrato un'inibizione della crescita altrettanto grave rispetto agli organi di controllo della figliata. Inoltre, i chelanti del ferro e gli inibitori di JmJC deferasirox e deferoxamina hanno mostrato una riduzione della crescita analoga al mezzo carente di ferro. Inoltre, l'inibitore SET7/9 ciproeptadina [58,59] ha mostrato riduzione della crescita e mancanza di differenziazione e proliferazione rispetto ai reni di controllo (Figura 4D) ma sembrava anche interferire con la segnalazione Wnt (Figura complementare S3). Altri inibitori dell'HDAC, HAT, HDM e HMT e l'inibitore DNMT 5-azacitidina non hanno mostrato una riduzione della crescita o anomalie dello sviluppo entro il periodo di tempo misurato (Figura 4A).
Figura 4. Il piccolo schermo composto ex vivo identifica i modulatori dello sviluppo renale.(A) L'elenco di piccoli composti, i loro bersagli epigenetici e la concentrazione utilizzata mostra una riduzione della crescita renale con entinostat, TH39, deferasirox, deferoxamina e ciproeptadina in maggiore o uguale a 3 esperimenti indipendenti dopo 3 giorni di coltura. Le colture di controllo sono state trattate con DMSO. ***, valore p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
