Studio della Parte IV sul modello della soppressione del midollo osseo indotta da 5-Fu/5-Fu+L-OHP nei topi
Oct 09, 2024
Attualmente, i metodi comunemente utilizzati per costruire modelli animali di soppressione del midollo osseo includono la modellazione delle radiazioni [1,2], la modellazione dell'iniezione intraperitoneale di ciclofosfamide [3-5], 5-fluorouracile (5-Fluorouracile, { {5}}FU) modellazione dell'iniezione intraperitoneale [6,7], radiazione combinata confarmaco chemioterapicomodellazione dei composti [8,9], modellazione della sonda gastrica con carbamazepina del farmaco antiepilettico [10], ecc. Diversi metodi di modellazione causano diversi meccanismi di soppressione del midollo osseo e gli effetti su varie cellule del sangue e il loro grado sono diversi; diversi farmaci chemioterapici, a causa dei loro diversi meccanismi d'azione, mostrano anche alcune differenze nei loro effetti sull'ematopoiesi del midollo osseo. Pertanto, un modello animale ideale di soppressione del midollo osseo è di grande importanza per studiare gli effetti dei farmaci chemioterapici sull'ematopoiesi del midollo osseo.
Nella pratica clinica,chemioterapia adiuvante per il cancro del colon-rettoadotta principalmente il regime 5-FU e il regime 5-Fu combinato con oxaliplatino (oxaliplatino, L-OHP). Sono stati condotti studi rilevanti sull'uso del solo 5-Fu per costruire un modello animale di soppressione del midollo osseo. Tuttavia, l'ambito di utilizzo di 5-Fu è relativamente ampio. I rapporti in letteratura includono 110 mg/kg, iniezione intraperitoneale (ip) il giorno 1 e il giorno 5 per il modellamento [7, 150 mg/kg, ip, d1 per il modello 16, 11], 200 mg/kg, ip, d1 per il modello [{{ 15}}] e 250 mg/kg, ip, d1 per la modellazione [16]. Tuttavia, non ci sono rapporti sull'uso di 5-Fu combinato con L-OHP per costruire un modello animale di soppressione del midollo osseo. Yu Linghong et al. [17] hanno utilizzato 5-Fu combinato con L-OHP per creare un modello animale di danno epatico. Facendo riferimento al metodo di somministrazione e al dosaggio della letteratura, il team ha condotto un'esplorazione preliminare del dosaggio di 5-Fu combinato con L-OHP per stabilire un modello animale di ossosoppressione del midolloe hanno confrontato il metodo di modellazione di 5-Fu 200 mg/kg, ip, d1 e il metodo di modellazione di 5-Fu 187,5 mg/kg + L-OHP 9 mg/kg, ip, d1. I risultati hanno mostrato che il dosaggio di questi due modelli era troppo elevato. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è continuare a esplorare il dosaggio ottimale del modello animale di soppressione del midollo osseo indotta da 5-Fu e il dosaggio di 5-Fu combinato con il modello L-OHP, in modo da fornire il modello animale più ideale per ilfase successiva dello studio dell’efficaciaEmeccanismo di prescrizione di Qitu Erzhi.
CISTANCHE ERBE PER LA SALUTE DEI RENI
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Materiali e metodi
1 Materiali sperimentali
1.1 Animali da esperimento
100 topi maschi BALB/c esenti da agenti patogeni specifici (SPF), del peso di 20 g ± 2 g, sono stati acquistati da SBEF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. e alloggiati in gabbie presso il Centro sperimentale per animali dell'ospedale Xiyuan, Accademia cinese di medicina cinese Scienze (certificato di qualifica: SYXK (Pechino) n. 2015-0011). Tutti i topi sono stati nutriti in modo adattivo per 1 settimana e hanno avuto libero accesso all'acqua e al cibo durante il periodo di alimentazione. Condizioni di alimentazione: temperatura interna 20-26 gradi, umidità relativa 40%~60%, tempo di luce/buio 12 ore/12 ore. Questo esperimento è rigorosamente conforme alle normative pertinenti del Comitato etico per la gestione sperimentale degli animali dell'ospedale Xiyuan, dell'Accademia cinese delle scienze mediche cinesi e rispetta gli standard di etica animale.
1.2 Principali farmaci e reagenti sperimentali
5-Fu (fluorouracile iniettabile) Oxaliplatino iniettabile
0.01M tampone fosfato (tampone PBS) Diluente per l'analisi delle cellule del sangue (MEK-640)
Soluzione detergente per l'analisi delle cellule del sangue (MEK-680) Agente emolitico per l'analisi delle cellule del sangue (MEK-680) Soluzione detergente per l'analizzatore delle cellule del sangue
Colorazione con ematossilina di Harris 0colorazione con eosina, 5%.
Mezzo sigillante per gomma neutro
Soluzione decalcificante per campioni di tessuto di tipo minerale a base acida
1.3 Principali strumenti e attrezzature
Contatore automatico di cellule ematiche (MEK6318) Provetta per il prelievo di sangue capillare (20 μL)
Puntale per pipetta da 1000μL
Disidratatore per tessuti biologici Tissue-TEK VIP6 Macchina per l'inclusione di tessuti biologici Tissue-TEK TEC Affettatrice per tessuti Leica RM2235
Raccoglitrice di fette Leica HI1210 Macchina per cuocere a fette Leica HI1220
Coloratore automatico Leica ST5020 Montavetrini automatico Leica CV5030 Microscopio Olympus Bx53
Sistema di controllo qualità e gestione dei dati della patologia Path QC
Altro: pipetta, bilancia elettronica ordinaria, forbici chirurgiche, pinzette, alcool al 75%, garze mediche, batuffoli di cotone sterili, siringhe, ecc.
1.4 Preparazione dei farmaci chemioterapici
(1) Regime 5-Fu a farmaco singolo
Sciogliere {{0}}Fu (0,25 g/10 ml) in 40 ml di soluzione NaCl allo 0,9% per preparare una soluzione con una concentrazione di 5 mg/ml per l'uso in standby.
(2) 5-Fu combinato con il regime L-OHP
Sciogliere {{0}}Fu (0,25 g/10 ml) in 40 ml di soluzione NaCl allo 0,9% per preparare una soluzione con una concentrazione di 5 mg/ml per lo standby utilizzo. Sciogliere 1 provetta di L-OHP (50 mg) in 5 ml di soluzione di glucosio al 5% e continuare a diluire con una soluzione di glucosio al 5% fino ad ottenere una soluzione da 0,5 mg/ml per l'uso.
Tabella 4-1 Regime terapeutico di modello
Secondo il regime di dosaggio di cui sopra, tutti i topi sono stati pesati e dosati individualmente in base al peso corporeo. Nel gruppo a doppio farmaco, l'intervallo di tempo tra la somministrazione di 5-Fu e L-OHP è stato superiore a 5 ore [17].
(2) Indicatori di valutazione del modello di soppressione del midollo osseo
Gli indicatori di valutazione del modello di soppressione del midollo osseo includono la diminuzione della conta delle cellule del sangue periferico [18-22] o la conta delle cellule del sangue periferico combinata con le cellule nucleate del midollo osseo [9.23-25]. Questo studio ha utilizzato il secondo metodo per valutare l'effetto della modellazione.
2.2 Indicatori e materiali di osservazione
2.2.1 Condizioni generali dei topi
Durante l'esperimento, sono stati osservati ogni giorno la dieta, la defecazione, l'attività, la condizione, lo stato mentale e lo stato del pelo di ciascun gruppo di topi. Se i topi morivano, venivano registrati in tempo.
2.2.2 Variazioni di peso dei topi in ciascun gruppo
Pesare e registrare il peso di ciascun topo prima della somministrazione il giorno della modellazione (d0) e pesare e registrare il peso di ciascun topo a giorni alterni dopo la modellazione.
2.2.3 Cambiamenti nella conta delle cellule del sangue periferico
Fissa il mouse con un fissatore per mouse, esponi la coda e immergila in acqua calda a 45-50 gradi. Dopo aver asciugato la coda, tagliare 1-2 mm della punta della coda. Accarezza rapidamente e delicatamente la coda dalla base alla punta 2-3 volte. Utilizzare una provetta per la raccolta del sangue capillare per raccogliere 20μL di sangue, diluirlo nel diluente per cellule del sangue preparato ed eseguire l'analisi delle cellule del sangue sulla macchina. Raccogliere il sangue ogni giorno ad un'ora prestabilita; tutta la raccolta del sangue viene completata da una persona. Gli indicatori di rilevamento includono: globuli bianchi, globuli rossi, emoglobina e piastrine.
2.2.4 Cambiamenti nella conta delle cellule nucleate del midollo osseo
Un giorno prima del campionamento, utilizzare una micropipetta per prelevare 1000 μL di soluzione PBS e diluirla in una provetta EP da 2 ml e conservarla in un frigorifero a 4 gradi per un uso successivo. Al giorno 6, 8 topi sono stati selezionati casualmente da ciascun gruppo e uccisi mediante dislocazione cervicale. Sotto un banco sterile e pulito, sono state utilizzate delle forbici chirurgiche per tagliare la pelliccia vicino al femore, rimuovere il femore destro e avvolgerlo con garza medica per rimuovere il tessuto molle residuo. Utilizzare un ago da siringa da 1 ml (ago n. 4) per estrarre la soluzione PBS nel tubo EP, forare un'estremità del femore per lavare il midollo osseo nel tubo EP; lavare e aspirare ripetutamente più volte per eliminare le cellule del midollo osseo fino a quando il femore diventa bianco. La sospensione cellulare di midollo osseo preparata è stata fatta passare attraverso una rete di nylon a 200-maglie. Utilizzare un contatore automatico di cellule del sangue per rilevare le cellule nucleate del midollo osseo. Al d13, i topi rimanenti sono stati uccisi nello stesso modo e sono stati raccolti dei campioni.
2.2.5 Patologia del midollo osseo Colorazione HE
In d6, dopo che i topi di ciascun gruppo sono stati uccisi mediante dislocazione cervicale, sono state utilizzate forbici chirurgiche per tagliare la pelliccia vicino al femore sotto un banco sterile e pulito, rimuovere il femore sinistro, realizzare blocchi di cera, fette e colorazione HE.
(1) Passaggi di preparazione e sezionamento del blocco di cera
① Campionamento: fissare il tessuto con paraformaldeide al 4% per più di 24 ore, immergerlo nella soluzione di decalcificazione per 24-48 ore, pungere il tessuto con uno spillo, tagliare e tagliare il tessuto dopo che si è ammorbidito e inserirlo nel blocco di cera scatola;
② Disidratazione: il tessuto viene posto in sequenza in alcol al 70% (2 ore), alcol all'80% (1,5 ore), alcol al 95% I (1,5 ore), alcol al 95% II (1,5 ore), 100% alcol I (0,5 ore) e 100% alcol II (0,5 ore) e disidratati in modo gradiente.
③ Trasparenza: il tessuto viene posto in sequenza in una soluzione di etanolo anidro e xilene (rapporto volumetrico 1:1), xilene I e xilene II per 40 minuti ciascuno.
④ Immersione in cera: il tessuto viene posto in sequenza in una miscela di xilene e paraffina (1:1), paraffina I e paraffina II per 20 minuti ciascuna. L'immersione della cera viene effettuata in un dispositivo a temperatura costante a 58 gradi per mantenere la paraffina sciolta.
⑤ Incorporamento: dopo aver etichettato il blocco di tessuto, preriscaldare le pinzette, iniettare la paraffina fusa nello stampo, quindi inserire il blocco di tessuto e attendere che la paraffina si solidifichi.
⑥ Affettamento: dopo l'inclusione, posizionare il blocco di cera tissutale sull'affettatrice, regolare l'angolo dell'affettatrice e tagliare il blocco di tessuto a fette con uno spessore di 4-5 μm.
⑦ Attaccare: distribuire le fette di paraffina in acqua a 42 gradi, raccogliere le fette una per una con un vetrino e incollarle sul vetrino.
⑧ Cottura: posizionare il vetrino bloccato in una scatola a temperatura costante a circa 70 gradi e cuocere per 1,5 ore.
(2) Passaggi di colorazione HE:
① Deparaffinare immergendo in xilene I e II per 15 minuti ciascuno.
② Immergere in alcol 100% I e II per 5 minuti.
③ Immergere in alcol con gradiente al 95%, 85% e 75% per 3 minuti e risciacquare con acqua distillata.
④ Colorazione con ematossilina per 1-3 minuti e risciacquare con acqua distillata.
⑤ Differenziazione dell'alcol dell'acido cloridrico per 2-3 s, lavare con acqua distillata.
⑥ Immergere in acqua ammoniacale per diventare blu per 1 minuto, lavare con acqua distillata.
⑦ Colorazione con eosina per 5 minuti.
⑧ Immergere in alcol con gradiente al 75%, 85%, 95% per 2 minuti.
⑨ Immergere in alcool al 100% I, IⅡ per 3 minuti ciascuno.
⑩ Immergere in xilene I, Ⅱ per 5 minuti ciascuno.
⑪ Sigillare con gomma neutra.
2.3 Metodi statistici
SPSS26.0 è stato utilizzato per eseguire analisi statistiche sui dati. I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard (x±s). Innanzitutto, i dati sono stati testati per la normalità e l'omogeneità della varianza: per i dati distribuiti normalmente, è stato utilizzato l'ANOVA unidirezionale per il confronto tra più gruppi: quando la varianza era uguale, il test LSD è stato utilizzato per il confronto a coppie; se la varianza non era uguale, per il confronto a coppie veniva utilizzato il test t2 di Tamhane; se non era conforme alla distribuzione normale è stato utilizzato un test non parametrico. P<0.05 was considered statistically significant.
